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Medicine

Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57756
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dental, incluyendo el análisis de la viabilidad de las células bacterianas y características morfológicas. Un modelo en situ asociado con técnicas de microscopía de gran alcance se utiliza para el análisis de biofilm oral.

Abstract

Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y formación de biopelículas. El uso de materiales que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de enfermedades peri-implante. Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que puede hacer un análisis de biofilm de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular. El modelo en situ para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dentales como se describe en este estudio ofrece una satisfactoria preservación de la biopelícula de 48 h, lo que demuestra la adecuación metodológica. Microscopía multifotón permite el análisis de un representante del área de la biopelícula formada en la prueba de materiales. Además, el uso de fluoróforos y el procesamiento de las imágenes mediante microscopía multifotón permiten el análisis de la viabilidad bacteriana en una población muy heterogénea de microorganismos. La preparación de muestras biológicas para microscopia electrónica promueve la preservación estructural de biofilm, imágenes con buena resolución y sin artefactos.

Introduction

Biofilms bacterianos son complejos, funcionalmente y estructuralmente organizada las comunidades microbianas, caracterizado por una diversidad de especies microbianas que sintetizan una matriz extracelular polímero biológicamente activo1,2. La adhesión bacteriana a superficies bióticas o abióticas es precedida por una formación de la película adquirida, que consiste en principalmente glicoproteínas salivales1,3,4. Débiles interacciones fisicoquímicas entre los microorganismos y la película son inicialmente establecidas y seguidas por fuertes interacciones adhesinas bacterianas y receptores de la glicoproteína de la película adquirida. Diversidad microbiana aumenta gradualmente a través de la coaggregation de los colonizadores secundarios a los receptores de las bacterias ya atados, formando una comunidad de especies1,3,4, 5.

Homeostasis de la microbiota oral y su relación simbiótica con el hospedero es importante en el mantenimiento de la salud oral. La disbiosis dentro de los biofilms orales pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de caries y enfermedad periodontal2,5. Estudios clínicos demuestran una relación de causa y efecto entre la acumulación de biofilm en los dientes o implantes dentales y el desarrollo de gingivitis o peri-implante mucositis6,7. La progresión del proceso inflamatorio conduce a peri-implantitis y la consiguiente pérdida del implante8.

Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y biofilm formación9. El uso de materiales con una composición química y la topografía de la superficie que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de peri-implante enfermedades9,10. El titanio es el material más utilizado para la fabricación de aditamentos protésicos para implantes; sin embargo, los materiales cerámicos fueron introducidos recientemente y están ganando popularidad como una alternativa al titanio debido a sus propiedades estéticas y biocompatibilidad11,12. También importante, materiales de cerámica se han asociado con un potencial supuestamente reducido a adherirse a los microorganismos, principalmente debido a su rugosidad, la humectabilidad y la energía libre superficial10,13.

Estudios in vitro han contribuido a importantes avances en la comprensión de la adherencia microbiana a pilar protésico superficies9,14,15,16,17. Sin embargo, el dinámico ambiente de la cavidad oral, caracterizado por sus diversos temperatura y pH y la disponibilidad de nutrientes, así como por la presencia de las fuerzas de corte, no es reproducible en vitro protocolos experimentales18, 19. Para superar este problema, una alternativa es el uso de modelos en situ de la formación de biofilm, que ventajosamente conserva su estructura tridimensional para ex vivo análisis10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

El análisis de la compleja estructura del biofilm formado sobre sustratos orales requiere el uso de técnicas de microscopía de ópticamente denso materia25. Microscopía multifotón láser es una opción moderna para biofilm análisis estructural26. Se caracteriza por el uso de la óptica no lineal con una fuente de iluminación cerca de la longitud de onda infrarroja pulsada a femtosegundos27. Este método está indicado para la adquisición de imágenes de Autofluorescencia o materiales marcados por fluoróforos, además de imágenes generadas por señales ópticas no lineales derivadas de un fenómeno conocido como segunda generación armónica. Entre las ventajas de la microscopía multifotón es la profundidad de la imagen obtenida con células mínimo daño causado por la intensidad de la luz de excitación27.

Para un análisis de viabilidad de biopelícula en superficies abióticas por microscopía multifotón, el uso de ácido nucleico fluorescente tiñe con diferentes características espectrales y una capacidad de penetración en las células bacterianas es necesario28. Fluorophores SYTO9 (verde fluorescente) y yoduro de propidio (rojo fluorescente) pueden ser utilizados para una diferenciación visual entre bacterias vivas y muertas28,29,30. Yoduro de propidio penetra solamente bacterias con membranas dañadas, mientras que SYTO9 entra en las células bacterianas con una membrana intacta y comprometida. Cuando ambos colorantes están presentes dentro de una celda, yoduro de propidio tiene una mayor afinidad por los ácidos nucleicos y desplaza SYTO9, marca rojo28,30.

Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que permite el análisis de la biopelícula de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular.

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Protocol

Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Facultad de Odontología de Ribeirão Preto, y el participante voluntario firmado el consentimiento por escrito (proceso 2011.1.371.583).

1. Biofilm formación in Situ

  1. Selección de los participantes
    1. Seleccionar a los pacientes basados en los siguientes criterios de inclusión: un individuo sano con una dentición completa y sin signos clínicos de enfermedades orales.
    2. Excluir a los pacientes basados en los siguientes criterios de exclusión: embarazo, lactancia, caries dental, enfermedad periodontal o tratamiento antibiótico en los últimos 3 meses, fumador o cualquier enfermedad sistémica que podría influir en el estado periodontal.
  2. Preparación de dispositivo intraoral
    1. Registro de la arcada maxilar mediante una impresión de alginato.
    2. Preparar tipo IV piedra añadiendo 19 mL de agua y 100 g de polvo de piedra. Vierta la piedra en el molde de alginato para hacer un modelo del arco maxilar.
    3. Diseñar y fabricar un dispositivo intraoral acrílico para apoyar a las probetas (discos de cerámica y titanio).
      1. Fabricar cierres retentivos de alambre de NiCr (0,7 mm de diámetro) utilizando alicates ortodónticos #139 y posición en el modelo. Para colocar la abrazadera entre los premolares superiores, doblar un extremo de cada alambre de modo que formen un bucle.
        1. Adaptar el bucle en la región de la papila interdental. En oclusal, inserte una curvatura suave para no interferir con los puntos de contacto y la oclusión. Hacer un 90 º doblez en el extremo de la abrazadera de retención en el acrílico.
        2. Para montar la pinza en el segundo molar superior, adaptar la curvatura del alambre en el tercio cervical (vestibular) del contorno del diente (distal) y 90 º doblez en el extremo de la abrazadera de retención en el acrílico.
          Nota: Para proveer retención/estabilidad adecuada al dispositivo intraoral, los broches de retención se colocaron entre los premolares superiores y el aspecto distal del segundo molar en ambos lados de la arcada dental.
      2. Manipular la resina acrílica autopolimerizable según las instrucciones del fabricante y presiona la resina de acrílico entre 2 placas de vidrio (con un espaciador de espesor 3 mm interpuesto) durante la fase plástica, para hacer una hoja gruesa de 3 milímetros.
      3. Coloque la hoja de acrílico en la región palatina de la modelo, según el diseño del dispositivo y recortar el excedente la resina de acrílico con un carver, antes de la polimerización.
      4. Fabricación de discos de cera mediante una matriz metálica [10 mm de diámetro, 2 mm de espesor (área de superficie de 78,5 mm2)] colocando cera fundida en la matriz y a la espera de la cera se solidifique. Incorporar manualmente 4 discos de cera en la resina de acrílico, 2 de ellos entre los premolares y los otros 2 al lado de los segundos molares.
      5. Deje que la resina de acrílico polimerice en una olla a presión menores de 20 psi de aire comprimido por 20 min.
      6. Acabado el dispositivo intraoral con una pieza de mano eléctrica laboratorio dental y cortador y pulir con abrasivo de goma.
      7. Ajustar el dispositivo para un ajuste correcto en la boca, utilizar el equipo descrito anteriormente.
  3. Preparación de las probetas de titanio y zirconio
    Nota: Las muestras (n = 14) son 10 mm de diámetro y 2 mm de espesor y tienen una superficie de 78,5 mm2.
    1. Pulir las superficies de los especímenes con lijas refrigerado por agua de disminuir la abrasividad (600, 1200 y 2000 arena), durante aproximadamente 20 minutos.
      Nota: El pulido de las muestras fue realizado para uniformar la rugosidad de la superficie a 0.2 μm.
    2. Limpiar y desinfectar las muestras y los dispositivos intraorales con agua y detergente líquido y luego un baño de ultrasonidos de alcohol isopropílico para 15 minutos secar con toallas de papel absorbente.
    3. Fijar a las muestras en el aparato bucal intraoral con aproximadamente 0.1 mL de adhesivo de fusión en caliente no tóxico (figura 1).
    4. Instalar el dispositivo que contiene a las muestras de la cavidad bucal.
      Nota: El dispositivo intraoral que contiene a las muestras se debe usar durante 48 h. El dispositivo fue extraído y guardado en tampón fosfato salino (PBS) mientras que el paciente era comer y realizar la limpieza oral.

2. evaluación de viabilidad bacteriana

Nota: La muestra tamaño n = 10.

  1. Preparar una solución de teñido mediante la adición de 3 μl de SYTO9 (ácido nucleico fluorescente tinte verde) y 3 μl de yoduro de propidio (rojo ácido nucleico fluorescente tinte) a 1 mL de estéril de agua destilada.
    Nota: Preparar soluciones protegidas de la luz.
  2. Transferir a las muestras a una placa de 24 pocillos y lávelos bien con PBS para eliminar las células no adherentes.
  3. Añadir el volumen adecuado (1 mL) de solución de colorante fluorescente para cubrir a la muestra que contiene el biofilm. Añadir el colorante con mucho cuidado para no desorganizar el biofilm.
  4. Incubar a la muestra durante 20-30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
  5. Lave suavemente la muestra de biofilm con agua destilada estéril para eliminar cualquier exceso de tinte.
  6. Coloque al espécimen en un plato de fondo de cristal y efectuar multifotón láser microscopía para el análisis de biofilm.
    Nota: El análisis de la viabilidad de las células bacterianas se llevó a cabo mediante un sistema de microscopía multifotón. La fluorescencia de yoduro de propidio fue detectada usando un filtro con una longitud de onda de excitación/emisión de 546/680 nm y 477/600 nm para SYTO9. El tamaño de las imágenes obtenidas fue 5.16188 x 5.16188 mm, que corresponde a 26,64 mm2 de área total de cada muestra (78,5 mm2) o el 33.94% de la superficie total. Las imágenes fueron hechas desde la parte más central de la muestra, con una resolución de 1.024 x 1.024 píxeles. El canal rojo y canal verde imágenes se analizaron por separado de software Fiji31. Cada celda fue seleccionado utilizando una herramienta de selección y la intensidad de la fluorescencia fue medida a través de la densidad integrada de los píxeles, restando el fondo de la imagen.

3. Análisis de la composición química de las muestras por espectroscopia de energía dispersiva (EDS)

Nota: La muestra tamaño n = 3.

  1. Seleccione a 3 ejemplares de cada material de la prueba libre de biofilm y evaluar la composición química en 2 zonas diferentes de cada muestra con un microscopio electrónico acoplado a un espectrómetro de energía dispersiva, con una tensión de haz de electrones de 10 kV32.

4. morfológico análisis del Biofilm bacteriano por microscopía electrónica de barrido

Nota: La muestra tamaño n = 1.

  1. Fijar el biofilm sumergiendo las muestras en glutaraldehído 2.5% diluido en buffer de cacodilato de sodio de 0.1 M, pH 7.0-7.3, para 24 h.
  2. Lavar la muestra en tampón PBS (pH = 7,6).
  3. Postfix el biofilm con tetróxido de osmio 1% durante 1 hora.
  4. Lavar la muestra en tampón PBS (pH = 7,6).
  5. Deshidratan las muestras de la biopelícula cuidadosamente, manteniéndolos sumergidos en el aumento de concentraciones de soluciones de etanol (50%, 70%, 90%, 95% y 100%).
    Nota: Realizar 3 intercambios de etanol a una concentración de 100%. El paso de deshidratación total toma aproximadamente 2 horas.
  6. Transferir las muestras en el secador de punto crítico y hacer varias sustituciones con dióxido de carbono (CO2) hasta que las muestras estén secas.
  7. Retire a las muestras secas del aparato y montar sobre los soportes de microscopio electrónico de barrido.
  8. Farfullar-capa una capa de nm 20 de oro sobre la superficie de la muestra de 120 s.
  9. Inserte los discos recubiertos de oro en la cámara de microscopio electrónico de barrido. Obtención de imágenes de 5 diferentes áreas de cada muestra, en 20-30 kV bajo presión variable y de aumento de 650 X12.

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Representative Results

La densidad de colonización de la biopelícula después de 48 h de crecimiento en situ estuvo representada en este estudio por la proporción del área colonizada en los discos de titanio y zirconio en relación con el total área escaneada de la muestra mediante microscopía multifotón ( 26.64 mm2). Figura 2 representa la densidad de colonización bacteriana en la superficie de los materiales probados 3. Se observó una mayor densidad de biofilm en las superficies del molde y en los discos de titanio mecanizado (0,0292 μm2 y 0.0213 μm2, respectivamente) que en los discos de zirconia (0.0099 μm2; p < 0.05; Examen de Kruskal-Wallis, seguido por la prueba de Dunn).

La figura 3 muestra la viabilidad de las células bacterianas en las superficies de zirconia (Figura 3A, 3A', y 3A "), mecanizado de titanio (figura 3B, 3B', y 3B") y titanio (figura 3, 3 C' , y 3 C ") discos. En este protocolo, el yoduro de propidio tinte ácido nucleico penetra sólo en las bacterias con una membrana dañada y, por lo tanto, emite una señal fluorescente rojo que se relaciona con las células muertas. SYTO9 penetra las células bacterianas con la membrana intacta o comprometida y emite una señal fluorescente verde de microorganismos vivos. Viabilidad celular bacteriana fue similar entre los materiales de prueba, con un predominio de microorganismos vivos en todos los grupos (figura 4). Proporciones de células muertas o vivir fueron 2.10 zirconia, 1.95 titanio mecanizado y 1.63 de titanio fundido.

Grietas, surcos o defectos de la abrasión producidas en la superficie de todos los materiales durante el proceso de pulido o mecanizado se observaban más claramente en mecanizan y lanzar discos de titanio. En los discos de zirconia, áreas más grandes se observaron con la ausencia de microorganismos; también se observaron pequeños agregados microbianos polimórficos consiste principalmente en cocos, bacilos y bacterias filamentosas (figura 5A y 5A'). La presencia de cocos y los bacilos se dispersó en las superficies de los discos de titanio mecanizado (figura 5B y 5B'). Muestras de titanio fundido presentaron colonias de microorganismos involucrados en una matriz con una apariencia de biofilm en la superficie (figura 5 y 5 C'). Menos material de la matriz se observó en la superficie de los discos de zirconia en comparación con el titanio mecanizado y fundición titanio discos.

El análisis EDS reveló 70.83% de zirconia, 22.84% de oxígeno, 4.52% del itrio y 1,57% de hafnio en los discos de zirconio; 95.16% de titanio, 3.99% de oxígeno y 0,85% de carbono en los discos de titanio fundido; y 89.86% de titanio, 7.53% de oxígeno y 2,61% de carbono en los discos de titanio mecanizado (figura 6).

Figure 1
Figura 1 : El dispositivo intraoral para la en situ estudio. Broches de retención fueron fabricados con alambre forjado, y prueba de titanio y zirconio discos (10 mm de diámetro, 2 mm de espesor) fueron colocados al azar en las regiones premolares y molares, parcialmente incrustadas en el curado de la resina de acrílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imágenes de fluorescencia de la densidad bacteriana celular. Estas son imágenes de fluorescencia del célula bacteriana densidad en zirconia (A), (B) mecanizado de titanio, y (C) emitir discos titanio después de 48 h en situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : La viabilidad celular de las bacterias adheridas a las superficies. Estos paneles muestran que la viabilidad celular de las bacterias adheridas a las superficies de muerto (A) y viven las células bacterianas en zirconia, (B) muertos y viven células bacterianas sobre mecanizado titanio y (C) muertos y viven las células bacterianas en titanio fundido discos descritos imágenes por fluorescencia. Las células bacterianas muertas se tiñen con yoduro de propidio (A', B', y C': señal de rojo fluorescente). Bacterias vivas se tiñen con SYTO9 (A «, B «, y C «: señal de fluorescencia verde). Paneles A, By C muestran imágenes de color combinado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Boxplots representando el biofilm viabilidad en los materiales de prueba diferentes celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Microscopía electrónica de barrido. Estos paneles muestran la microscopía electrónica de (A, A') zirconia, (B, B') mecanizado de titanio, y (C, C') discos de titanio con biofilm, panorámicas y vistas, cerca del molde después de 48 h in situ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Un análisis elemental por espectroscopia dispersiva de energía (EDS). Estos paneles muestran (A) discos de zirconio (Zr = zirconia, Y = itrio, C = carbono, O = oxígeno y Hf = hafnio); (B) mecanizado de titanio, y (C) emitir discos titanio (Ti = titanio, O = oxígeno y C = carbono). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo descrito en este estudio se desarrolló para evaluar la formación de biopelículas sobre materiales de titanio y zirconio para aditamentos protésicos, incluyendo el análisis de la viabilidad de la célula bacteriana y características morfológicas. Para lograr esto, se diseñó un modelo en situ de la formación de biopelículas, que consta de un dispositivo intraoral capaces de acomodar las muestras de los materiales de prueba y mantenerlos expuestos al medio oral dinámico durante 48 h. El dispositivo era considerado cómodo y fácil de insertar, eliminar y limpiar por el voluntario. Sin embargo, demostró poco impacto en fonética y estética, fue simple y de bajo costo para fabricar y permite una fácil recuperación de los ejemplares sin interrupción de la estructura del biofilm. Por otra parte, el método permite la preservación de la integridad de la matriz extracelular y las células bacterianas. El contacto de la lengua con las muestras y la pérdida accidental del disco durante el experimento son limitaciones del modelo propuesto. Con el fin de minimizar las limitaciones del método, el posicionamiento de los discos en el dispositivo intraoral se distribuyó al azar; Además, los discos fueron fijados con pegamento caliente del derretimiento no tóxico, y no se informó de ninguna pérdida de muestra.

Debido a la alta heterogeneidad de las especies bacterianas que habitan en el medio oral, técnicas de microscopía de gran alcance se requieren para el análisis de los biofilms colonizando sus superficies. Microscopía multifotón proporciona varias ventajas sobre el análisis de microscopía confocal o convencional, como una resolución tridimensional inherente, una excitación de infrarrojo cercano para la penetración óptica superior, una reducción de fotoblanqueo y fotodaño cuando imágenes de células vivas y una capacidad para proporcionar información cuantitativa33,34. Estas ventajas se originan a través de la excitación altamente localizada del proceso de absorción de dos fotones y el reducido efecto de dispersión de la luz en los especímenes. Por lo tanto, microscopía multifotón permite tisular profundo, daño celular mínima y una iniciación fotoquímica bien localizado34. Muestreo aleatorio y un número representativo de los campos deben ser elegidos para el análisis exacto35,36. El láser multifotón microscopía permitió el análisis de áreas de 5161.88 x 5161.88 μm, correspondiente a 33.94% del área de la muestra total. La microscopia confocal no fue utilizada debido a la necesidad de un gran número de campos para el análisis representativo y un largo período de evaluación de las muestras. Por otra parte, la señal de fondo fuera de foco había limitado el uso de microscopía de fluorescencia. A pesar de las ventajas de la microscopía multifotón, sólo unas pocas aplicaciones en el campo microbiológico son reportados37,38,39. Entre ellos está su uso como una herramienta de manipulación; por ejemplo, para lograr la ablación localizada, necrosis apoptosis, blanqueo o fotoactivación de un volumen bien definido de biofilm células26. Otra aplicación de este método es evaluar la eficacia de agentes antibacterianos contra múltiples biofilm componentes25,40,41.

En este estudio, se evaluó la viabilidad de las células bacterianas adheridas con tintes fluorescentes de ácido nucleico, que penetran en las células en función de su membrana integridad28. Yoduro de fluoróforos y propidio SYTO9 fueron utilizados para la diferenciación visual entre bacterias vivas y muertas. Algunas limitaciones del uso de SYTO9 con yoduro de propidio se divulgan en la literatura, como la dificultad de SYTO9 a bacterias Gram-negativas con una membrana intacta de la mancha porque tiene que atravesar las dos membranas de las células presentes en la estructura30, 42. Así, células vivas pueden ser subestimadas por un combinado de la coloración. Además, cuando SYTO9 no es reemplazado totalmente por el yoduro de propidio, se puede observar fluorescencia amarilla en vez de rojo en las células bacterianas30,42. Otra limitación es la disminución de la señal SYTO9 en el tiempo. Se recomienda que los análisis de microscopía se realizan dentro de 30 minutos después de la exposición a los colorantes29,30. Es necesario tener en cuenta la fluorescencia de fondo para calcular la intensidad de la señal, desde la autofluorescencia del sustrato y la presencia de tinte puede interferir con los resultados de30. Sin embargo, puesto que bien se divulgan estas limitaciones, es posible que las muestras procesadas en el plazo especificado, así que seleccionamos cuidadosamente y restar el fondo de las imágenes con la ayuda del software de Fiji.

Alta irradiación de vacío y electrónica durante la exploración de la microscopia electrónica representan condiciones adversas para las muestras que contienen material biológico. Además de las propiedades no conductoras, el biofilm en su estado natural es hidratado, que interfiere con el sistema de detección y generación de electrones, formando artefactos43. Por lo tanto, las muestras que contienen material biológico deben estar preparadas para garantizar la preservación de la estructura y la conducción de sus electrones43,44. Las fases del protocolo que implica la fijación, deshidratación, secado y recubrimiento de las muestras con material conductor fueron desarrollados con especial atención a las diluciones y tiempo. La fijación de la materia biológica se realizó con un aldehído en un buffer de cacodilato y la posterior fijación con tetróxido de osmio, para preservar la estructura de la biopelícula adherida43,45,46. Deshidratación se logró con una serie ascendente de las concentraciones de etanol, con el agua poco a poco siendo sustituido por el solvente orgánico44. Secado con una mínima distorsión de la arquitectura de la biopelícula se realizó a través del punto crítico con reemplazos sucesivos de líquido CO2 para la extracción de etanol, seguida por una conversión de CO2 a la fase de gas, un retiro del líquido / interfaz de gas y la eliminación de la tensión superficial muestra43,44,45,46. Para asegurar la conductividad de los electrones, prevenir o reducir el daño y la imagen de que los artefactos, los especímenes fueron recubiertos con una capa de 10-20 nm de oro o de oro/paladio. Además, las muestras con una capa delgada de metal de la capa puede reducir la acumulación de carga eléctrica dentro de un espécimen, mejorar el contraste y aumentar imagen resolución46.

A pesar de algunas limitaciones, el modelo en situ descrito en este estudio era adecuado para la evaluación de la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio, preservando el biofilm de 48 h. El uso de fluoróforos asociados con la proyección de imagen por microscopía multifotón permitida el análisis de la viabilidad de las células bacterianas en una población muy heterogénea de microorganismos colonizan los materiales de prueba. Las técnicas emplean en la preparación de la biológica muestras promueve conservación estructural de la biopelícula y permitió la adquisición de imágenes de alta calidad para la visualización y caracterización morfológica de los microorganismos colonizadores .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen José Augusto Maulin del laboratorio de microscopía multiusuario (Facultad de medicina de Ribeirão Preto) por su ayuda generosa con el EDS y SEM análisis y Hermano Teixeira Machado por su generosa asistencia técnica en la edición de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogum 5 Zhermack Dental C302070
Durone IV Dentsply 17130500002
NiCr wire  Morelli 55.01.070
JET auto polymerizing acrylic Clássico
Dental wax  Clássico
Pressure pot  Essencedental
Sandpapers 600 grit NORTON T216
Sandpapers 1200 grit NORTON T401
Sandpapers 2000 grit NORTON T402
Metallographic Polishing Machine Arotec
Isopropyl alcohol SIGMA-ALDRICH W292907
Hot melt adhesive TECSIL PAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316
Pipette Tips, 10 µL KASVI K8-10  
Pipette Tips, 1,000 µL KASVI K8-1000B  
24-well plate  KASVI K12-024
Glass Bottom Dish Thermo Scientific 150680
AxioObserver inverted microscope  ZEISS
Chameleon vision ii laser Coherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC ZEISS 440452-9903-000
SDD sensors - X-Max 20mm² Oxford Instruments
Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G5882
Sodium cacodylate Buffer  SIGMA-ALDRICH 97068 
Osmium tetroxide SIGMA-ALDRICH 201030
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH S9638 Used for preparation of phosphate buffered saline
KH2PO4 SIGMA-ALDRICH P9791 
NaCl MERK 1.06404
Kcl SIGMA-ALDRICH P9333 
Ethanol absolute for analysis EMSURE MERK 1.00983
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC
JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope JEOL
SCD 050 Sputter Coater BAL-TEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales
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Silva, T. S. O., Freitas, A. R.,… More

Silva, T. S. O., Freitas, A. R., Pinheiro, M. L. L., do Nascimento, C., Watanabe, E., Albuquerque, R. F. Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants. J. Vis. Exp. (136), e57756, doi:10.3791/57756 (2018).

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