Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utvärdera oral biofilm bildning på Titan och zirkonium material för tandproteser distanser, inklusive analys av bakterieceller livskraft och morfologiska kännetecken. En i situ -modellen är associerad med kraftfulla mikroskopi tekniker används för oral biofilm analys.
Abstract
Dentala implantat och deras proteskomponenterna är benägna att bakteriell kolonisering och biofilm bildning. Användning av material som ger låg mikrobiell vidhäftning kan minska prevalensen och progression av peri-implantatet sjukdomar. Med tanke på den orala miljön komplexitet och oral biofilm heterogeniteten, mikroskopi tekniker behövs som kan aktivera en biofilm analys av ytorna på tänder och dentala material. Denna artikel beskriver en rad protokoll som genomförts för att jämföra oral biofilm bildning på Titan och keramiska material för protetiska distanser, liksom metoderna som är inblandade i oral biofilm analyser på morfologiska och cellulär nivå. I situ modellen att utvärdera oral biofilm bildning på Titan och zirkonium material för tandproteser distanser som beskrivs i denna studie ger en tillfredsställande bevarande av de 48 h biofilm, därmed visar metodologiska tillräcklighet. Multiphoton mikroskopi tillåter analys av ett område representativt av den biofilm som bildas på testmaterial. Användningen av fluorophores och bearbetning av bilderna med multiphoton mikroskopi kan du dessutom analysen av den bakteriella livskraften i en mycket heterogen population av mikroorganismer. Utarbetandet av biologiska prover för elektronmikroskopi främjar strukturella bevarandet av biofilm, bilder med bra upplösning och inga artefakter.
Introduction
Bakteriell biofilm är komplexa, funktionellt och strukturellt organiserade mikrobiella samhällen, kännetecknas av en mångfald av mikrobiell art att syntetisera en extracellulär, biologiskt aktiva polymer matris1,2. Den bakteriell vidhäftningen till biotiska och abiotiska ytor föregås av ett bildande av den förvärvade membran, huvudsakligen bestående av saliv glykoproteiner1,3,4. Svag fysikalisk-kemiska samspelet mellan mikroorganismer och den tunna hinnan är inledningsvis etablerat och följt av starkare samverkan mellan bakteriell adhesiner och glykoprotein receptorer av den förvärvade membran. Mikrobiell mångfald ökar gradvis genom coaggregation av sekundära kolonisatörerna till receptorsna av redan bifogade bakterier, bildar en Medelhavet gemenskapen1,3,4, 5.
Homeostas av den oral bakterieflora och dess symbiotiska förhållande med värden är viktigt att upprätthålla munhälsa. Dysbios inom oral biofilm kan öka risken för utveckling av karies och tandlossning2,5. Kliniska studier visar ett orsak-verkan samband mellan ansamling av biofilm på tänder eller implantat och utvecklingen av gingivit eller peri-implantatet mukosit6,7. Utvecklingen av den inflammatoriska processen leder till peri-implantitis och den påföljande förlusten av implantatet8.
Dentala implantat och deras proteskomponenterna är benägna att bakteriell kolonisering och biofilm bildning9. Användning av material med en kemisk sammansättning och ytans topografi som ger låg mikrobiell vidhäftning kan minska prevalensen och progression av peri-implantatet sjukdomar9,10. Titan är det vanligaste materialet för tillverkning av protetiska distanser för implantat; men keramiska material nyligen introducerade och ökar i popularitet som ett alternativ till Titan på grund av deras estetiska egenskaper och biokompatibilitet11,12. Också viktigt, har keramiska material förknippats med en förment reducerad potential att följa mikroorganismer, främst på grund av sin ytjämnhet, vätbarheten och ytan fri energi10,13.
In vitro studier har bidragit till betydande framsteg i förståelsen av mikrobiell vidhäftning till protetiska distansen ytor9,14,15,16,17. Dynamisk miljö i munhålan, kännetecknas av dess varierande temperatur och pH och näringsämnen tillgänglighet samt av förekomsten av skeva styrkor, är dock inte reproducerbart i in vitro- experimentella protokoll18, 19. För att lösa detta problem, är ett alternativ att utnyttja i situ modeller av biofilm bildning, som med fördel bevarar dess tredimensionella struktur för ex vivo analys10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
Analysen av den komplexa strukturen av den biofilm som bildas på muntliga substrat kräver användning av mikroskopi tekniker kan visa optiskt tät materia25. Multiphoton laserscanning mikroskopi är ett modernt alternativ för biofilm strukturanalys26. Det kännetecknas av användning av ickelinjär optik med en belysning källa nära infraröd våglängd, pulsade femtosekunder27. Denna metod är indicerat för bild förvärv av autofluorescens material eller material som präglas av fluorophores, förutom bilder som genereras av icke-linjära optiska signaler som härrör från ett fenomen känt som harmoniska understödjautvecklingen. Bland fördelarna med multiphoton mikroskopi är det stora bilddjup erhålls med minsta cellskador orsakade av intensiteten av magnetiseringen ljus27.
För en livskraft analys av biofilm på abiotiska ytor av multiphoton mikroskopi, användning av fluorescerande nukleinsyra färgämnen med olika spektrala egenskaper och en penetration kapacitet i bakterieceller är krävs28. Fluorophores SYTO9 (grönt fluorescerande) och propidium jodid (röd fluorescerande) kan användas för en visuell differentiering mellan levande och döda bakterier28,29,30. Propidium jodid tränger bara bakterier med skadade membran, medan SYTO9 går in bakterieceller med en intakt och komprometterad membran. När både färgämnen finns inuti en cell, propidium jodid har större affinitet för nukleinsyror och förskjuter SYTO9, markera det röda28,30.
Med tanke på den orala miljön komplexitet och oral biofilm heterogeniteten, mikroskopi tekniker behövs som kan aktivera biofilm analysen av ytorna på tänder och dentala material. Denna artikel beskriver en rad protokoll som genomförts för att jämföra oral biofilm bildning på Titan och keramiska material för protetiska distanser, liksom metoderna som är inblandade i oral biofilm analyser på morfologiska och cellulär nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den institutionella Review Board av den skolan för odontologi i Ribeirão Preto, och den frivilliga deltagaren undertecknat skriftligt medgivande (Process 2011.1.371.583).
1. Biofilm bildning in Situ
-
Urval av deltagare
- Välj patienter baserat på de följande inklusionskriterierna: en frisk individ med en fullständig tanduppsättning och några kliniska tecken på orala sjukdomar.
- Utesluta patienter baserat på följande kriterierna för uteslutning: graviditet, amning, karies, tandlossning eller antibiotikabehandling i de senaste 3 månaderna, rökare eller någon systemisk sjukdom som skulle kunna påverka parodontal status.
-
Beredning av intraorala enhet
- Spela in maxillary bågen med hjälp av alginat intryck.
- Förbereda typ IV sten genom att lägga till 19 mL vatten 100 g sten pulver. Häll stenen i alginat mögel att göra en modell av maxillary bågen.
- Designa och tillverka en akryl intraorala enhet för att stödja provstyckena (Titan och keramiska diskar).
- Fabricera glans knäppen från NiCr tråd (0.7 mm i diameter) med tandreglering tång #139 och placera dem på modellen. Om du vill placera klämman mellan övre premolarer, böj ena änden av varje tråd så att de bildar en ögla.
- Anpassa slingan i regionen i interdentala papilla. I den ocklusala, infoga en mild rundning för att inte störa med beröringspunkter och ocklusion. Göra en 90° vik slutet av klämman för en lagring i akryl.
- För att passa klämman i den övre andra molar, anpassa krökning av kabeln i den cervikala tredje (vestibulära) contour tanden (distala) och göra en 90° vik slutet av klämman för en lagring i akryl.
Obs: För att ge tillräcklig retention/stabilitet till intraorala enheten, de glans knäppen placerades mellan övre premolarer och distala aspekt av den andra molar på båda sidor av tandbågen.
- Manipulera den självläkande akrylharts enligt tillverkarens anvisningar och tryck på akrylharts mellan 2 Glasplattor (med en 3 mm tjock spacer inföll) under plast, att göra ett 3 mm tjockt blad.
- Lägg bladet akryl på palatala regionen av modellen, enligt enhetens design, och trimma bort de överflödiga akrylharts med en carver, innan polymerisation.
- Tillverka vax diskar med en metallisk matrix [10 mm i diameter, 2 mm i tjocklek (yta på 78,5 mm2)] genom att placera smält vax i matrisen och väntar på vaxet stelna. Bädda in 4 vax diskar manuellt i akryl harts, 2 av dem mellan premolarer och de andra 2 bredvid andra kindtänderna.
- Låt den akrylharts polymerisera i trycket kruka under 20 psi med tryckluft i 20 min.
- Avsluta den intraorala enheten med en elektrisk Dentallab handstycket och fräs och polera det med slipande gummi.
- Justera enheten för en korrekt passform i munnen med hjälp av utrustning som beskrivs ovan.
- Fabricera glans knäppen från NiCr tråd (0.7 mm i diameter) med tandreglering tång #139 och placera dem på modellen. Om du vill placera klämman mellan övre premolarer, böj ena änden av varje tråd så att de bildar en ögla.
-
Förberedelse av Titan och zirkonium exemplar
Obs: Exemplar (n = 14) är 10 mm i diameter och 2 mm i tjocklek och har en yta på 78,5 mm2.- Polska exemplaren ytor med vattenkylda sandpapper fallande abrasiveness (600, 1200 och 2000 grit), för ca 20 min.
Obs: Polering av exemplar utfördes för att standardisera ytjämnheten på 0,2 µm. - Rengör och desinficerar exemplar och intraorala enhet med flytande tvättmedel och vatten, och sedan använda ultraljudsbad isopropylalkohol för 15 min. torka dem med absorberande pappershanddukar.
- Fixa exemplaren i intraorala muntliga enheten med cirka 0,1 mL giftfri smältlim lim (figur 1).
- Installera enheten som innehåller exemplaren i munhålan.
Obs: Intraorala enheten som innehåller exemplaren skall bäras för 48 h. Enheten var bort och förvaras i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) medan patienten var ätande och utför oral rengöring.
- Polska exemplaren ytor med vattenkylda sandpapper fallande abrasiveness (600, 1200 och 2000 grit), för ca 20 min.
2. bedömning av bakteriell livskraft
Obs: Prov storlek n = 10.
- Bered en färgning genom att lägga till 3 µL av SYTO9 (grön fluorescerande nukleinsyra färgämne) och 3 µL av propidium jodid (röd fluorescerande nukleinsyra färgämne) 1 ml sterilt destillerat vatten.
Obs: Förbereda lösningar skyddas från ljus. - Överför exemplaren till en 24-well platta och tvätta dem med PBS ta bort icke-anhängare celler.
- Tillsätt lämplig volym (1 mL) av fluorescerande färg lösning att täcka biofilm-innehållande preparatet. Lägga till färgen mycket noga så att inte disorganize biofilmen.
- Inkubera provet för 20-30 min i rumstemperatur, skyddas från ljus.
- Försiktigt tvätta biofilm provet med sterilt destillerat vatten för att avlägsna eventuella överskott färgämne.
- Placera provet i en skål med glas i botten och utföra multiphoton laserscanning mikroskopi för biofilm analys.
Obs: Analys av bakterieceller livskraft genomfördes med hjälp av en multiphoton mikroskopi system. Fluorescensen propidium jodid upptäcktes med hjälp av ett filter med excitation/emissionsvåglängden 546/680 nm och 477/600 nm för SYTO9. Storleken på de bilder som erhållits var 5.16188 x 5.16188 mm, vilket motsvarar 26.64 mm2 av den totala arealen av varje prov (78,5 mm2) eller 33.94% av den totala arealen. Bilderna gjordes från den mest centrala delen av provet med en upplösning på 1 024 x 1 024 pixlar. Den röda kanalen och gröna kanalen bilder analyserades separat med Fiji programvara31. Varje cell valdes med ett markeringsverktyg och intensiteten av fluorescensen mättes genom integrerad tätheten av pixlar, subtrahera bakgrunden bild.
3. analys av exemplaren kemisk sammansättning av energi dispersiv spektroskopi (EDS)
Obs: Prov storlek n = 3.
- Välj 3 exemplar av varje biofilm-fri testmaterial och bedöma den kemiska sammansättningen i 2 olika delar av varje prov med scanning electron Mikroskop kopplat till en energidispersiv spektrometer, med en electron beam spänning av 10 kV32.
4. Morfologisk analys av den bakteriell biofilmen av svepelektronmikroskopi
Obs: Prov storlek n = 1.
- Åtgärda biofilmen genom nedsänkning exemplaren i 2,5% glutaraldehyd utspätt i 0,1 M natrium cacodylate buffert, pH 7,0-7,3, för 24 h.
- Tvätta provet i PBS-bufferten (pH = 7,6).
- Postfix biofilmen med 1% osmium vanligtvis för 1 h.
- Tvätta provet i PBS-bufferten (pH = 7,6).
- Torka biofilm proverna försiktigt, att hålla dem nedsänkt i ökande koncentrationer av etanol lösningar (50%, 70%, 90%, 95% och 100%).
Obs: Utför 3 utbyte av etanol vid en koncentration av 100%. Det totala uttorkning steget tar ca 2 h. - Överför exemplaren till den kritiska punkten torktumlare och göra flera substitutioner med koldioxid (CO2) tills exemplaren är torra.
- Ta bort torkade exemplaren från apparaten och montera dem på svepelektronmikroskop innehavare.
- Fräsande-coat ett 20 nm lager av guld på preparatets yta för 120 s.
- Infoga de guld-belagda skivorna i svepelektronmikroskop kammaren. Hämta bilder från 5 olika områden av varje prov, på 20-30 kV variabel påtryckningar och 650 X förstoring12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Colonization tätheten av biofilmen efter 48 h i situ tillväxt var representerade i denna studie av andelen koloniserade området på Titan och zirkonium diskarna i förhållande till det totala skannade området av preparatet med hjälp av multiphoton mikroskopi ( 26.64 mm2). Figur 2 föreställer den bakteriella kolonisation tätheten på ytan av 3 testade material. En högre täthet av biofilm observerades på ytbehandlar av gjutna och maskinbearbetade Titan diskarna (0.0292 µm2 och 0.0213 µm2, respektive) än i zirconia diskar (0.0099 µm2; p < 0,05; Kruskal-Wallis test, följt av Dunn's test).
Figur 3 visar bakterieceller livskraft på ytbehandlar av zirkonium (figur 3A, 3A', och 3A ”), maskinbearbetade Titan (figur 3B, 3B', och 3B”), och gjutna Titan (figur 3 c, 3 C' , och 3 C ”) diskar. I detta protokoll, den nukleinsyra dye propidium jodid tränger bara in bakterier med skadade membran och därför avger ett rött fluorescerande-signal som är relaterade till döda celler. SYTO9 tränger bakteriecellerna med intakt eller komprometterad membran och avger en grön fluorescerande signal från levande mikroorganismer. Cellulära bakteriell lönsamhet var liknande mellan testmaterial, med en dominans av levande mikroorganismer i alla grupper (figur 4). Live/dead celler andelar var 2.10 för zirkonium, 1,95 för maskinbearbetade Titan och 1,63 för gjutna Titan.
Sprickor, räfflor eller nötning defekter på ytan av allt material som producerats under processen för polering och/eller bearbetning observerades, tydligare i bearbetade och gjutna Titan diskar. I zirconia diskar observerades större områden med en frånvaro av mikroorganismer; liten polymorfa mikrobiell aggregat bestående huvudsakligen av kocker, baciller och trådformiga bakterier observerades också (figur 5A och 5A'). Förekomsten av kocker och baciller var utspridda på ytbehandlar av maskinbearbetad titan diskar (figur 5B och 5B'). Gjutna Titan exemplar presenteras kolonier av mikroorganismer som är inblandade i en matris med en biofilm utseende på ytan (figur 5 c och 5 C'). Mindre matrismaterial observerades på ytan av zirconia diskarna jämfört med maskinbearbetade Titan och gjutna Titan diskar.
EDS analysen visade 70.83% av zirkonium, 22,84% av syre, 4,52% yttrium och 1,57% av hafnium i zirconia diskar; 95.16% av Titan, 3,99% syre och 0,85% kol i gjuten Titan diskar; och 89.86% av Titan, 7,53% av syre och 2,61% kol i maskinbearbetad titan diskar (figur 6).
Figur 1 : Den intraorala enheten för den i situ studera. Glans knäppen var fabricerade med smide tråd och Titan och zirkonium test diskar (10 mm i diameter, 2 mm tjocka) var slumpmässigt placerade i regionerna premolarer och molarer, delvis inbäddade själv bota akrylharts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Fluorescens bilder av bakteriell cell densiteten. Dessa är fluorescens bilder av bakteriell cell densiteten på (A) zirconia, (B) bearbetas Titan, och (C) gjutna Titan diskar efter 48 h i situ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Cell livskraften hos bakterier anslutit sig till ytor. Dessa paneler visar cellen livskraft bakterier följs ytbehandlar av (A) döda och levande bakterieceller på zirconia, (B) döda och levande bakterieceller på maskinbearbetad titan, och (C) döda och levande bakterieceller på cast titanium diskar som skildras av fluorescens imaging. Döda bakterieceller färgas med propidium jodid (A', B', och C': röd fluorescerande signal). Levande bakterier färgas med SYTO9 (A ”, B”, och C ”: grön fluorescens signal). Paneler A, Boch C Visa färg sammanslagna bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Boxplots som representerar biofilmen cellviabilitet på de olika testmaterial. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Svepelektronmikroskopi. Dessa paneler visar den skanning elektronmikroskopi av (A, A') zirconia, (B, B') bearbetas Titan, och (C, C') gjutna Titan diskar med biofilm, panoramautsikt och närbild visningar, efter 48 h på plats . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : En elementär analys av energi dispersiv spektroskopi (EDS). Dessa paneler Visa (A) zirconia diskar (Zr = zirconia, Y = yttrium, C = kol, O = syre och Hf = hafnium); (B) bearbetade Titan, och (C) gjutna Titan diskar (Ti = Titan, O = syre och C = kol). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs i denna studie har utvecklats för att utvärdera den biofilm-bildningen på Titan och zirkonium material för protetiska distanser, inklusive analys av bakteriell cell livskraft och morfologiska kännetecken. För att åstadkomma detta, utformades en i situ -modell av biofilm bildning, bestående av en intraoral enhet som klarar att rymma prover av testmaterial och hålla dem utsätts för den dynamiska orala miljön för 48 h. Enheten ansågs bekväm och lätt att infoga, ta bort och rengöra av volontären. Ändå visade liten inverkan på fonetik och estetik, var enkel och billig att tillverka, och tillät en enkel återvinning av exemplar utan avbrott av biofilm struktur. Dessutom tillåts metoden bevarandet av bakteriecellerna och extracellulärmatrixs integritet. Kontakten mellan tungan med exemplaren och oavsiktlig förlust av skivan under experimentet finns begränsningar av den föreslagna modellen. För att minimera begränsningarna av metoden, delades slumpmässigt placeringen av skivorna i intraorala enheten; Dessutom skivorna var fast med giftfri smältlim lim, och ingen förlust av provet rapporterades.
På grund av den höga heterogeniteten i de bakteriearter som bebor den orala miljön, krävs kraftfulla mikroskopi tekniker för analys av biofilmer kolonisera dess hårda ytor. Multiphoton mikroskopi ger flera fördelar över konventionella eller confocal microscopy analyser, såsom en inneboende tredimensionella resolution, en nära-infraröd magnetisering för överlägsen optisk penetration, en minskning av fotoblekning och åldrad hud när imaging levande celler och en förmåga att tillhandahålla kvantitativa information33,34. Dessa fördelar kommer genom starkt lokaliserad excitation av två-photon absorption processen och minskad effekt av ljusspridning i exemplaren. Multiphoton mikroskopi kan därför djup vävnad imaging, minsta cellskador och ett inledande av väl lokaliserad fotokemi34. Stickprov och ett representativt antal fält ska väljas för korrekta analyser35,36. Multiphoton laser scanning mikroskopi tillåtna analysen av områden av 5161.88 x 5161.88 µm, motsvarande 33.94% av totala preparatets område. Konfokalmikroskopi användes inte på grund av behovet av ett stort antal fält för representativa analys och en lång period av utvärdering av exemplaren. Dessutom begränsad out-of-fokus bakgrund signal användning av fluorescensmikroskopi. Trots fördelarna med multiphoton mikroskopi är bara ett fåtal applikationer i fältet mikrobiologiska rapporterade37,38,39. Bland dem är dess användning som en manipulation verktyg; till exempel för att uppnå lokaliserade ablation, celler apoptos/nekros, blekning eller ljusaktivering av en väl definierad volym av biofilm26. En annan tillämpning av denna metod är att utvärdera effekten av antibakteriella medel mot flera biofilm komponenter25,40,41.
I denna studie utvärderades klibbade bakterieceller livskraft med fluorescerande nukleinsyra färgämnen, som tränga in i cellerna som en funktion av deras membran integritet28. SYTO9 fluorophores och propidium jodid användes för visuell differentiering mellan levande och döda bakterier. Vissa begränsningar av användningen av SYTO9 och propidium jodid rapporteras i litteraturen, till exempel svårigheten att SYTO9 att färga gramnegativa bakterier med en intakt membran eftersom det har att korsa två cellmembranen närvarande i struktur30, 42. Levande celler kan därmed underskattas av en kombinerad färgning. Dessutom, när SYTO9 inte helt ersätts av propidium jodid, observeras gul fluorescens istället för röd i bakterieceller30,42. En annan begränsning är minskningen av SYTO9 signalen över tid. Det rekommenderas att mikroskopi analyserna utförs inom 30 min efter exponeringen till färgämnen29,30. Det är nödvändigt att överväga den bakgrund fluorescensen att beräkna signal intensiteten, sedan autofluorescens av substratet och förekomsten av obundet färgämne kan störa de results30. Ändå, eftersom begränsningarna rapporteras väl, är det möjligt att ha proverna behandlas inom den angivna tidsramen, samt att noggrant välja och subtrahera bildernas bakgrund med hjälp av programvaran Fiji.
Högt vakuum och elektron bestrålning under svepelektronmikroskopi representerar ogynnsamma förhållanden för prover som innehåller biologiskt material. Utöver oledande egenskaper, är biofilmen i sitt naturliga tillstånd hydratiserade, som stör det elektron generation Upptäck system och bildar artefakter43. Prover som innehåller biologiskt material måste därför vara beredda för att säkerställa bevarandet av strukturen och överledning av sina elektroner43,44. Protokoll faser som involverar fixering, uttorkning, utvecklades torkning och beläggning av exemplaren med elektriskt ledande material med särskild uppmärksamhet på utspädningar och tid. Fixering av det biologiska materialet utfördes med en aldehyd i en cacodylate buffert och efter fixering med osmium vanligtvis, för att bevara strukturen av den klibbade biofilm43,45,46. Dehydrering uppnåddes med en stigande serie av etanol koncentrationer, med vattnet ersätts gradvis av de organiska lösningsmedel44. Torkning med en minimal förvrängning av biofilm arkitektur utfördes via den kritiska punkten med upprepade ersättningsleveranser flytande CO2 för etanol avlägsnande, följt av en omvandling av CO2 till gasfas, en borttagning av vätskan / gas-gränssnitt, och eliminering av ytspänning på de exemplar43,44,45,46. För att säkerställa conductivityen av elektronerna, förebygga eller minska skador och bilden artefakterna, exemplaren var belagda med ett 10-20 nm lager av guld eller guld/palladium. Dessutom kan beläggning exemplaren med ett tunt lager av metall reducera den elektriska laddningen uppbyggnaden inom ett exemplar, förbättra kontrast och öka bild resolution46.
Trots vissa begränsningar var den i situ -modell som beskrivs i denna studie tillräcklig för bedömning av oral biofilm bildning på Titan och zirkonium material, bevara den 48 h biofilmen. Användning av fluorophores i samband med imaging av multiphoton mikroskopi tillåtna analysen av bakteriell cell livskraften i en mycket heterogen population av mikroorganismer kolonisera testmaterial. Teknikerna anställd i utarbetandet av biologiskt prover främjas den biofilm strukturella bevarande och tillät förvärv av högkvalitativa bilder för visualisering och morfologisk karakterisering av de kolonisera mikroorganismerna .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar José Augusto Maulin från mikroskopi fleranvändar laboratorium (School of Medicine i Ribeirão Preto) för hans generösa hjälp med EDS och SEM analyser och Hermano Teixeira Machado för hans generösa tekniskt bistånd i video edition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J.
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M.
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S.
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
