Summary
Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.
Abstract
Mappatura attività enzimatica nello spazio e nel tempo è fondamentale per comprendere le basi molecolari del comportamento delle cellule nel tessuto normale e malattia. Le analisi in situ attività metabolica possono fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle attività metabolica all'interno di un tessuto. Forniamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività dell'enzima lattato deidrogenasi direttamente nei campioni di tessuto. Lattato deidrogenasi è un determinante importante di se consumato glucosio verrà convertito in energia mediante glicolisi aerobica o anaerobica. Una soluzione contenente lattato e NAD è fornita di una sezione di tessuto congelato. Cellule con attività alto lattato deidrogenasi converte il lattato fornito a piruvato, mentre convertendo simultaneamente fornito nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) a NADH e un protone, che può essere rilevato sulla base della riduzione di nitrotetrazolium blu di formazan, che è visualizzato come un precipitato blu. Descriviamo un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo. Applicazione del presente protocollo, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è alta nelle cellule staminali del follicolo pilifero quiescente all'interno della pelle. Applicazione del protocollo di cellule staminali embrionali di topo coltivate ha rivelato la macchiatura più alto in cellule staminali embrionali coltivate di fibroblasti embrionali del mouse. Analisi dell'aorta del mouse appena isolato ha rivelato la macchiatura in cellule di muscolo liscio perpendicolare all'aorta. La metodologia fornita può essere utilizzata per mappare spazialmente l'attività degli enzimi che generano un protone nel tessuto fresco o congelato.
Introduction
Capire le posizioni all'interno dei tessuti in cui gli enzimi hanno attività alta o bassa è essenziale per la fisiologia e sviluppo di comprensione. Livelli di trascrizione o di proteine sono spesso utilizzati come surrogati per l'attività enzimatica. Mentre tali studi possono essere ben informativi, non forniscono informazioni che possono essere critici per determinare l'attività di un enzima, quali modificazioni post-traduzionali, la presenza di complessi proteici, o localizzazione subcellulare dell'enzima. Quando l'attività enzimatica è misurata direttamente, spesso è monitorato nei lisati di omogeneizzato proteine che non contengono informazioni su singole celle all'interno della miscela o la distribuzione spaziale delle cellule con alta o bassa attività all'interno di un tessuto.
Forniamo qui un protocollo dettagliato per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica all'interno di un campione di tessuto. La metodologia si basa su precedenti studi che dimostrano che sali di tetrazolio possono essere utilizzati per localizzare l'attività della deidrogenasi, riduttasi e ossidasi in tessuto congelato1. Con questi metodi, un formazan insolubili in acqua si forma quando protoni vengono trasferiti a un tetrazolium sale2,3. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi genera NADPH e un protone ed è stata rilevata con attività di tetrazolium. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi è stata monitorata epatociti Platichthys flesus4, nelle cellule alveolari di tipo 2 del polmoni5 e nefroni del rene5. Sali di tetrazolio sono stati utilizzati anche per monitorare l'attività di transketolase in tessuto congelato6. Un approccio simile è stato recentemente utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi multiple nel tessuto stesso su diapositive adiacenti7.
Descriviamo qui un metodo per utilizzare sali di tetrazolio per monitorare la distribuzione spaziale delle attività della deidrogenasi del lattato (Figura 1). Lattato deidrogenasi può convertire piruvato generato da glicolisi di lattato e la reazione inversa. L'attività della deidrogenasi del lattato è di conseguenza un determinante importante dell'entrata di piruvato nel ciclo dell'acido tricarbossilico contro sua secrezione come lattato. Livelli di lattato nel sangue sono spesso utilizzati per diagnosticare una gamma di malattie, compreso cancro8,9,10, perché può segnalare che la malattia o infortunio ha danneggiato le cellule e l'enzima è stato rilasciato.
Ci sono quattro geni di lattato deidrogenasi: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD11. LDHA e LDHB sono pensati per risultare dalla duplicazione di un gene di iniziali LDHA12. LDH è attivo come un tetramero e LDHA e LDHB possono formare homotetramers ed eterotetrameri con a vicenda. LDHA è segnalato per avere maggiore affinità per piruvato, mentre LDHB è segnalato per avere maggiore affinità per lattato e preferenzialmente convertire lattato in piruvato13. Il promotore LDHA contiene siti di legame per fattori di trascrizione HIF1α, cMYC e FOXM111. Inoltre, come molti altri enzimi glicolitici14,15, LDH può essere modificato da modificazioni post-traduzionali. Ricevitore di fattore di crescita del fibroblasto 1 può fosforilare LDHA Y10, che promuove la formazione di tetramero, o Y83, che promuove il NADH substrato associazione16. LDHA può anche essere acetilata17. Per questi motivi, una comprensione completa delle attività LDH richiede un monitoraggio non solo i livelli di proteina LDH, ma l'attività dell'enzima pure.
Oltre al metodo che presentiamo qui, altri approcci sono stati utilizzati per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato. L'attività della deidrogenasi del lattato può essere monitorata spettrofotometricamente a lisato proteico omogeneizzato. La generazione del NADH come lattato viene convertito in piruvato può essere misurata basata su assorbanza a 340 nm, mentre la scomparsa del NADH può essere monitorata come piruvato viene convertito in lattato18. L'attività della deidrogenasi del lattato è stata monitorata anche con risonanza magnetica (MRI). 13 C-piruvato può essere somministrato e la conversione di piruvato a lattato possa essere monitorata come il rapporto di [1 -13C] lattato / [1 -13C] piruvato. Elevati coefficienti di [1 -13C] lattato / [1 -13C] piruvato sono stati osservati in cancro del tessuto19. Mentre gli approcci basati su MRI possono fornire informazioni sulle attività della deidrogenasi del lattato nel normale e tessuti malattia, le metodologie non hanno la risoluzione necessaria per determinare il livello di attività in celle specifiche. La metodologia fornita qui può fornire informazioni sull'attività della deidrogenasi del lattato in aree di tessuto e anche in singole cellule.
Usando in situ analisi di attività, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è ricco di cellule staminali del follicolo pilifero di mouse pelle20. Abbiamo anche usato il metodo per monitorare l'attività del lattato deidrogenasi in cellule staminali embrionali coltivate e l'attività è più alto nelle cellule staminali dello strato dell'alimentatore. Infine, abbiamo monitorato l'attività del lattato deidrogenasi nell'aorta del mouse fresco e osservato la macchiatura in cellule di muscolo liscio. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo congelati.
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Protocol
Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal comitato di cura animale presso l'Università di California, Los Angeles.
1. generare diapositive della pelle del topo congelati
- Eutanasia topi in conformità alla politica di istituzione.
Nota: Seguire la politica istituzionale per indumenti di protezione. Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali devono essere approvati dal Comitato cura animale istituzionale. - Rimuovere i capelli del mouse con un trimmer peli di animali.
- Fare delle incisioni nella pelle usando le forbici. Usando il forcipe, sollevare la pelle dal mouse. Utilizzando le forbici, tagliare la sezione di pelle.
- Riempire il cryomold con congelamento reagente composto (Vedi Tabella materiali).
- Sezioni di pelle posto in cryomolds riempito usando il forcipe dal naso dell'ago. Orientare la pelle affinché fettine di tessuto genererà una sezione trasversale della pelle dall'epidermide al derma, ipoderma e muscolo (Figura 2).
Nota: se possibile, montare sperimentale e topi di controllo insieme alla cryomold stesso modo possono essere sezionati sulla diapositiva stessa ed elaborate insieme. Fare attenzione a non per creare bolle. - Posto cryomold sulla superficie piana di un blocco di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio e far congelare. Continuare ad osservare l'orientamento della pelle. Regolare se necessario.
Nota: Indossare guanti criogenici maneggiare ghiaccio secco. - Trasferimento cryomolds in un congelatore-80 ° C per la conservazione. I campioni possono essere mantenuti in freezer per circa 3 mesi senza una significativa perdita di attività enzimatica. Sezioni congelate non lasciare asciugare.
- Utilizzando un criostato a-20 ° C, fetta del tessuto per creare sezioni 7-10 µm di spessore per la miglior pelle morfologia21.
2. preparazione diapositive per la colorazione
- Stabilire il set di diapositive da testare. Includono un vetrino di controllo su cui sarà trattenuto il NAD e far scorrere un altro controllo in cui il substrato, lattato, verrà trattenuto. Includere un vetrino di controllo positivo da un blocco di tessuto congelato precedentemente studiato.
- Brevemente Difficoltà diapositive contenente sezioni di pelle con formalina 4% per 5 min da pipettaggio 1 mL di formalina 4% sulla diapositiva, o durante l'elaborazione di più diapositive, immergendo i vetrini in un recipiente contenente formalina 4%.
Nota: La fissazione garantirà che la pelle non staccare dalle diapositive durante le seguenti procedure e preservare la morfologia della pelle.
Attenzione: La formalina è un agente cancerogeno e pericolose; indossare guanti, non lasciare che toccare la tua pelle ed eseguire questo passaggio in una cappa chimica. - Lavare i vetrini con il fosfato di almeno 1 mL tampone, pH 7.4, per ogni diapositiva o pipettando o immersione.
3. preparare la soluzione di colorazione
- I reagenti insieme vortice per la colorazione di attività della deidrogenasi del lattato (Tris 50 mM a pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM fenazina methosulfate (PMS), cloruro di nitrotetrazolium blu 600 µM e lattato di 30 mM) in un tubo di dimensione appropriate a seconda della quantità di macchiatura soluzione necessaria.
Nota: 1 mL è sufficiente per coprire completamente una diapositiva. - Preparare una seconda soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti tranne NAD. Preparare una terza soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti ad eccezione del lattato.
4. Incubare i vetrini nella soluzione di colorazione
- Delicatamente dispensare la soluzione colorante o soluzioni per il controllo sui vetrini preparati che coprono la sezione nella sua interezza (1 mL è sufficiente per una diapositiva). Se più diapositive vengono elaborati insieme, immergere tutti i vetrini nella soluzione colorante allo stesso tempo (assicurarsi che il contenitore è una soluzione abbastanza per coprire completamente la sezione di tessuto).
- Incubare i vetrini in un ambiente umidificato a 37 ° C al buio. Se la soluzione di colorazione è in cima alla diapositiva, è possibile collocare il vetrino in un ambiente umidificato per evitare l'evaporazione.
5. monitorare le diapositive
- Monitorare la conversione della soluzione colorante da chiaro a blu mediante ispezione visiva. Quando i campioni hanno raggiunto il livello desiderato di azzurro, arrestare la reazione rimuovendo la soluzione colorante.
Nota: Per la pelle, 10 min è sufficiente. Il tempo dipenderà l'organo e l'attività enzimatica. - Sciacquare i vetrini con tamponato fosfato salino pipettando (1 mL è sufficiente per ogni diapositiva) o immersione.
Nota: Eventuali campioni che saranno confrontati a vicenda devono essere mantenuti nella soluzione colorante per la stessa quantità di tempo.
6. colorante di contrasto e montare
- Dispensare una colorazione sui vetrini quando le diapositive hanno raggiunto un livello adeguato di azzurro.
Nota: Coloranti che trasformano i nuclei rossi o verdi fornirà buon contrasto con il blu creato dal formazano precipitante. - Montare con acquoso o non acquoso montaggio medio22. Una-tre gocce (40-50 µ l) di mezzo di montaggio è sufficiente a seconda delle dimensioni del vetrino coprioggetti.
7. immagini diapositive e quantificare
- Diapositive di immagini al microscopio ottico. Prendere fotografie di sperimentale e campioni di controllo e tutti i controlli negativi a 10x, 20x e 40x.
- Determinare l'intensità della macchia blu in diverse regioni con software di analisi di immagine.
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Representative Results
Precedentemente abbiamo segnalato risultati per analisi di attività in situ in mouse pelle20. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo osservato che alti livelli di attività della deidrogenasi del lattato in cellule staminali del follicolo pilifero, alla base del follicolo di capelli quando le procedure descritte sopra sono stati seguiti. Questi risultati sono stati confermati da celle attivate la fluorescenza ordinamento della pelle per le cellule staminali del follicolo pilifero e conferma attività alto lattato deidrogenasi nel compartimento di cellule staminali con analisi di attività sulle cellule ordinate.
Basato sui nostri risultati che le cellule staminali del follicolo pilifero hanno attività alto lattato deidrogenasi, abbiamo esteso i nostri studi delle cellule staminali embrionali coltivate. Fibroblasti embrionali del mouse che serve come uno strato dell'alimentatore sono stati analizzati da solo o in presenza di cellule staminali embrionali. Per analizzare le cellule coltivate, il mezzo è stato aspirato, e le cellule erano brevemente fissi e incubate con lattato deidrogenasi soluzione di colorazione come descritto sopra. Abbiamo osservato alto lattato deidrogenasi attività nelle cellule staminali embrionali rispetto ai mouse fibroblasti embrionali (Figura 4).
Abbiamo anche applicato il protocollo di colorazione al tessuto di recente isolato. Aorte del mouse sono stati sezionati e affettati aperti. Le navi sono state aperte e immobilizzate affinché all'interno lumen di aorte era accessibile. I campioni sono stati incubati con soluzione salina bilanciata di Hank che contiene 0,5% Triton-X per 10 min, poi con la deidrogenasi del lattato soluzione per 10 min. lattato deidrogenasi macchiatura soluzione di colorazione è stato applicato al tessuto fresco. Dopo l'incubazione, le immagini sono state raccolte, mostrando la macchiatura in cellule di muscolo liscio (Figura 5).
Figura 1 : Attività chimica di lattato deidrogenasi e la relativa rilevazione. Lattato deidrogenasi converte lattato + NAD in piruvato + NADH + H+. Il protone che viene generato si ridurrà del nitroblue a formazano, che forma un precipitato blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Schematico di orientare la pelle del topo in cryomolds. Pelle del topo deve essere orientata all'interno di cryomolds modo che ogni taglio sezione conterrà una sezione trasversale di tutta la pelle dall'epidermide, derma, ipoderma e muscolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Deidrogenasi del lattato di colorazione della pelle del topo rivela ad alta attività nelle cellule staminali del follicolo pilifero. Pelle del topo è stata congelata nel cryomolds e incubata con lattato deidrogenasi macchiatura soluzione contengono lattato. L'attività della deidrogenasi del lattato era prominente nelle cellule staminali del follicolo pilifero. (A, B) Due immagini di analisi di attività della deidrogenasi del lattato di pelle del topo. (C, D) Due immagini del controllo colorazione con il lattato di substrato trattenuto. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Attività della deidrogenasi del lattato elevato in cellule staminali embrionali di topo coltivate. Cellule staminali embrionali coltivati del topo coltivate su uno strato di alimentatore dei fibroblasti embrionali del mouse irradiati sono state analizzate per l'attività della deidrogenasi del lattato. Alta attività è stata osservata nelle cellule staminali rispetto ai fibroblasti. Fibroblasti embrionali del mouse ha mostrato i simili livelli di macchiatura con e senza irradiazione. Immagini sono state scattate con un obiettivo X 20. Barra della scala = 50 µm. (A, B, D, E) fibroblasti embrionali di topo e cellule staminali. (C, F) Fibroblasti embrionali del mouse da solo. (A-C) Immagini sono state scattate dopo 7 minuti di incubazione con la soluzione di macchiatura. (D-F) Immagini sono state scattate dopo 20 minuti di incubazione con la soluzione di macchiatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Attività della deidrogenasi del lattato elevato in cellule di muscolo liscio che circonda l'aorta del mouse. Aorte sono state isolate da topi euthanized. Vasi sono stati fissati per 2 minuti in 2% di paraformaldeide e lavato 3 x 10 minuti in 1 tampone fosfato x Salina. Le navi sono state incubate con soluzione salina bilanciata di Hank con 0,5% Triton-X e lavati 3 x 5 minuti in soluzione salina tamponata con fosfato. Deidrogenasi del lattato soluzione di colorazione è stato aggiunto e campioni sono stati incubati per 10 min a 37° C e lavato 3 x 5 min con soluzione tampone fosfato e 1x. I campioni sono stati quindi corretti per 1 ora a 2% paraformaldeide, lavato 3 x 5 min con 1x tampone fosfato salino ed imaged. (A) della deidrogenasi del lattato soluzione contenenti lattato. (B) della deidrogenasi del lattato soluzione senza lattato come controllo negativo. Per ogni sezione, c'è un'immagine ingrandimento in basso a sinistra e una zona designata è mostrata con maggiore ingrandimento sulla destra. (A, B) Soluzione completa del lattato deidrogenasi contenenti lattato è stata usata per la colorazione. B è che un'immagine ingrandita dell'area interessata in soluzione di lattato deidrogenasi di r. (C, D) di immagini senza lattato è stata utilizzata per la colorazione come controllo negativo. D è un'immagine ingrandita dell'area interessata in C. A e C sono state scattate con obiettivi X 20 (barra della scala = 50 µm) e B e D sono state scattate con un obiettivo 40x (barra della scala = 20 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato o altri enzimi metabolici che generano NADH o NADPH, in diversi tipi cellulari all'interno di un tessuto o di diverse porzioni di un tessuto nel corso del tempo. Lattato deidrogenasi è un enzima importante per la comprensione della biologia delle cellule staminali e tumori, e la capacità di monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato in singole celle rischia di fornire le comprensioni importanti nella funzione di questo enzima.
Uno importante vantaggio di questo protocollo rispetto ad altre metodologie che è la capacità di monitorare l'attività enzimatica, anziché solo abbondanza di proteine, può causare più conclusivi informazioni su non solo dove sono gli enzimi della deidrogenasi del lattato presente, ma dove sono in realtà funzionale. Modo che il livello di una proteina selezionato, per esempio, un indicatore di lineage delle cellule, è determinato negli stessi campioni del tessuto come attività della deidrogenasi del lattato, l'approccio descritto qui può essere abbinato a immunohistochemistry. Rispetto agli approcci basati su MRI per monitoraggio attività della deidrogenasi del lattato, il protocollo fornito ha il vantaggio che può fornire una maggiore risoluzione spaziale e contribuire a determinare le cellule specifiche all'interno di un tessuto che hanno alta attività enzimatica . Rispetto agli approcci al metabolismo di mapping basato su substrati fluorogenici, rilevando il segnale con il protocollo descritto non è limitato da autofluorescence1. Miller e co-autori eseguita una simile analisi della dipendenza dal tempo e dipendenza di substrato degli enzimi differenti cinque monitorando conversione a formazano7. Le reazioni sono state scoperte a seguire stechiometrici principi di cinetica enzimatica. Miller e coautori enzimi mitocondriali distinti da non-mitocondriale enzimi di co-localizzazione con colorazione mitocondriale7. Hanno usato 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium cloruro (CTC) come un reagente di rivelazione seguito da microscopia confocale per co-localizzazione subcellulare analisi7.
Il metodo descritto presenta svantaggi pure. Mentre gli approcci basati su MRI possono essere utilizzati negli organismi viventi, l'approccio descritto richiede tessuto fresco o congelato. Tessuti congelati sono adatti solo per pochi mesi perché l'attività degli enzimi degradano nel tempo, anche quando congelati. Inoltre, poiché il substrato viene fornito in eccesso, l'approccio fornisce informazioni su "potenziale attività" supponendo che il substrato sia presente. Se i livelli del substrato sono limitanti, la distribuzione di attività osservata con questo dosaggio può derogare la quantità di attività che si verifica fisiologicamente. Inoltre, se esistono diverse isoforme dell'enzima stesso che svolgono la stessa attività enzimatica, il metodo presentato qui non è in grado di distinguere tra di loro. Per esempio, il metodo presentato non può distinguere tra l'attività di LDHA contro LDHB. Un approccio all'indirizzo che questo problema sarebbe quella di utilizzare geneticamente ingegnerizzati topi in cui una singolo enzima isoforma è geneticamente inattivata.
Abbiamo sperimentato con PMS, un trasportatore di elettrone fotochimicamente stabili che media il trasferimento di elettroni tra NADH e tetrazolium coloranti23. Mentre alcuni scienziati hanno riferito che il PMS inibisce l'attività del glucosio 6-fosfato deidrogenasi e trovato PMS scortese5, abbiamo trovato il PMS per essere prezioso per la localizzazione dell'enzima e includerlo nel nostro protocollo. Alcuni altri autori hanno segnalato usando alcool polivinilico per limitare la diffusione di glucosio 6-fosfato deidrogenasi enzima1. Nei nostri esperimenti, abbiamo trovato non l'alcool polivinilico per essere disponibile ed eliminato.
A pochi passi sono fondamentali per il successo della colorazione. Una questione importante è garantire che i campioni di tessuto sono posizionati correttamente nella cyromolds. Sezioni della pelle è opportuno piatta in modo che fette tagliate attraverso la pelle. Inoltre, se più sezioni sono di essere preparati, è ideale se sono incorporati all'interno del cryomold stesso modo essi possono essere affettati insieme nella stessa diapositiva. Questo vi aiuterà a eliminare la variazione a causa dello spessore della diapositiva che è tagliata con il criostato. È inoltre importante garantire che il tessuto conserva ancora l'attività enzimatica.
Il momento migliore per terminare la reazione dovrebbe essere determinato empiricamente. È necessario monitorare attentamente le diapositive durante il periodo di incubazione e determinare il momento opportuno per aggiungere colorante di contrasto e montare le diapositive in base all'intensità della macchia blu. Se i campioni sono troppo leggermente macchiati, non sarà possibile determinare dove si trova l'attività. Se i campioni sono overstained, il formazano precipitato può diffondersi, rendendolo difficile da accertare le aree specifiche che sono stati originariamente elevate nell'attività.
Prevediamo che questo protocollo sarà prezioso per gli scienziati con una vasta gamma di domande sul ruolo del metabolismo. Le applicazioni includono co-macchiatura per attività metabolica e gli indicatori delle cellule lignaggio o marcatori di proliferazione, valutare i contributi di diversi enzimi con modelli genetici, valutare la localizzazione subcellulare di attività enzimatica, monitoraggio attività enzimatica nel tessuto malato o durante lo sviluppo.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.
Acknowledgments
HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute di R01 di scienze mediche generali GM081686, R01 AR070245, Istituto nazionale di generali (Medical Sciences R01 GM0866465, Eli ed Edythe Broad centro di medicina rigenerativa e ricerca sulle cellule staminali Colline di rose e Hal Gaba awards), Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, alla Leukemia Lymphoma Society, impatto Iris Cantor femminile premi da Jonsson Comprehensive Cancer Center a WEL e HAC. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & ricerca sulle cellule staminali, l'Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
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