Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.
Brugen af murine modeller til at efterligne menneskelige nyresygdom bliver mere og mere almindelige. Vores forskning er fokuseret på vurderingen af glomerulær funktion i diabetisk nefropati og podocyte-specifikke VEGF-en knock-out mus; Derfor, denne protokol beskriver fuld nyre arbejde-op bruges i vores lab til at vurdere disse musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. I forhold til alternative metoder præsenteres i litteraturen til at vurdere glomerulær funktion, muliggør brug af metoden beskrevet i denne hvidbog glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Ved hjælp af denne metode, kan forskeren bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Denne vitale oplysninger om mekanismen af sygdommen er påkrævet, når du undersøger potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle vurdering af glomerulær filtration barriere gennem måling af urin albumin kreatinin ratio og individuelle glomerulær vand permeabilitet, samt både strukturelle og ultra-strukturelle gennemgang ved hjælp af periodiske syre-Schiff pletten og elektronmikroskopi. Derudover muliggør analyse af gener dysregulated på mRNA og protein niveau mekanistiske analyse af glomerulær funktion. Denne protokol beskriver de generiske men fleksible metoder, der kan anvendes på alle musemodeller af glomerulær sygdom.
Brugen af murine modeller til at efterligne menneskelige nyresygdom bliver mere og mere almindelige. Sådanne murine modeller omfatter spontan modeller som spontant hypertensive rotter (SHR)1, streptozotocin (STZ)-induceret diabetisk rotter og mus2, og db/db type II diabetisk mus3, gensplejsede modeller som primære podocyte-specifik fokal segmentær glomerulær sklerose (FSGS) modeller4, den podocyte-specifikke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) model5, og Alport syndrom modeller6, og erhvervet modeller som 5/6 nephrectomistatus7 og ensidige ureter obstruktion (UUO) model8. For at vurdere de forskellige aspekter ved glomerulær funktion i disse modeller, er flere teknikker til rådighed. Formålet med denne metode papir er at vise et omfattende arbejde op, der skal udføres i musemodeller af nyresygdom for at fuldt ud for at vurdere glomerulær funktion.
Rationalet bag anvendelse af denne metode er, at det muliggør glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Dette omfatter vurdering af glomerulær permeabilitet, både protein og vand, glomerulær strukturelle abnormiteter og ændringer i udtryk/splejsning af mRNAs og proteiner afgørende for normal glomerulær funktion. Ved hjælp af denne metode, er at forskeren stand til at bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Dette er vigtige oplysninger om mekanismen af sygdommen, som er påkrævet, når undersøge potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller.
I litteraturen er det en fælles begivenhed at blive præsenteret med en musemodel af glomerulær sygdom hvor fænotype bestemmes af en øget niveau af albumin i urinen. Der er imidlertid grund til at formode, at en enkelt metode til at bestemme glomerulær funktion ikke er altid effektive; måle den urinveje albumin udskillelse sats eller urin albumin kreatinin ratio (uACR) kun giver oplysninger om samlede nyrefunktion, og ikke af de enkelte glomeruli. Tidligere undersøgelser har vist, at permeabiliteten kan variere i forskellige glomeruli fra samme nyre5,9,10. Vurdering af permeabilitet af individuelle glomeruli er desuden en mere følsom måde vurdere glomerulær funktion; teknik til at måle individuelle glomerulær vand permeabilitet (LpA / V,jeg) har vist sig for at være mere følsomme over for ændringer i glomerulær funktion end måling uACR9. Denne analyse er gavnlige i musemodeller der er resistente over for proteinuri, som dem på en c57BL/6 baggrund11. Fordelen ved den nuværende metode papir er, at den undersøger både den samlede renal permeabilitet til albumin såvel som den enkelte glomerulær permeabilitet til vand.
Undersøgelse af glomerulær strukturelle abnormiteter er ofte vurderet af et batteri af pletter såsom periodiske syre Schiff (PAS), trichrome, og sølv pletter. Disse aktiverer en uddannet renal patolog at evaluere niveauet for nyresygdom via en scoring metode. Selv om alle gode metoder, ændringer glomerulær makro-struktur ikke er altid overholdes i modeller akutte nyre skade12. Denne metode foreslår, at ud over udførelsen af renal histologi teknikker beskrevet ovenfor, bør den glomerulær ultra-struktur også vurderes via elektronmikroskopi (EM). En farves glomerulus kan ser relativt normal under en regelmæssig lysmikroskop; dog ved vurdering med EM, små ændringer i glomerulær basalmembran (GBM) bredde, er podocyte foden proces effacement, endotel fenestrations og sub-podocyte plads dækning analyseret. Derfor er det afgørende, at både glomerulær ultra-struktur og mikro-struktur er vurderet for at bestemme mekanismen af glomerulær dysfunktion.
Ud over vurderingen af glomerulær strukturelle abnormiteter, bør ændringer i mRNA og protein udtryk og splejsning samt protein aktivering (fx, fosforylering), undersøges for at yderligere belyse mekanismerne i glomerulær sygdom. Når man ser på glomerulær sygdom, eller, for eksempel, når KO/over-expressing et gen specielt i glomerulær celler, som i den podocyte-specifikke VEGF-A KO mus5, er det vigtigt at protein og mRNA ændringerne undersøges kun inden for de glomerulær celler, og ikke hele nyren. Denne protokol beskriver en metode hvor glomeruli er isoleret fra mus nyre cortex, og derefter protein/RNA er isoleret. Det giver specifikke analyse af protein/mRNA dysregulering i glomeruli sygdom model.
Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.
Denne protokol beskriver en fuld nyre arbejde op, der skal udføres i musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. De kritiske trin i hver metode giver mulighed for funktionelle, strukturelle og mekanistiske DETAILANALYSE af glomerulær funktion, herunder vurdering af permeabilitet af nyrerne som helhed (uACR og plasma kreatinin målinger), permeabilitet af enkelte glomeruli (glomerulær LpA / V,jeg), undersøgelse af de strukturelle ændringer (PAS, Trichrome blå og EM), protein lokalisering (IF) og glomerulær genekspression (RT-PCR og Western blotting). Disse metoder er nøglen til den fulde vurdering af glomerulær funktion i musemodeller af nyresygdom.
Ved vurderingen af permeabilitet af GFB, har mange undersøgelser valgt for at bruge den konventionelle uACR eller 24 h albumin udskillelse sats som en effektiv foranstaltning17,18. Selvom disse teknikker tillader vurdering af GFB permeabilitet som helhed, giver det ikke mulighed for individuelle glomerulær permeabilitet vurdering og variation blandt glomeruli. Tidligere undersøgelser har fundet måling af glomerulær LpA / Vi at være en mere følsom mål for ændringer i GFB permeabilitet5,9. Faktisk, i de repræsentative resultater viste i dette papir, på 14 uger post induktion af VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b mus har en betydeligt lavere uACR i forhold til VEGF-A KO mus; men dette resultat er ikke afspejlet i glomerulær LpA / Vjeg målinger, hvor VEGF-A165b ikke forhindre betydeligt øger i GFB permeabilitet (figur 1 og figur 2)5. Dette viser betydningen af at bruge flere assays til at vurdere både nyre permeabilitet og permeabilitet af individuelle glomeruli. Derudover glomerulær LpA / Vjeg oncometric analyse tyder på, at permeabiliteten af individuelle glomeruli fra samme nyrerne kan variere meget, især i sygdommen modeller5,10, 19. en begrænsning til måling af glomerulær LpA / Vjeg er, at det kun kan udføres på den eksperimentelle end-point; således, regelmæssig uACR målinger er forpligtet til at give en indikation af den eksperimentelle end-point.
Ud over vurderingen af den funktionelle fænotype, tilskynder den nuværende metode også vurdering af de strukturelle og ultrastrukturelle fænotype. Dette kan gøres ved hjælp af et udvalg af pletter såsom PAS, trichrome, og sølv pletter; hver at vurdere forskellige aspekter af glomerulær morfologi. I akut modeller af glomerulær sygdom, som det ofte er tilfældet i musemodeller, kan være svære at opdage eventuelle store strukturelle abnormiteter ved hjælp af disse pletter, medmindre du er en uddannet renal patolog. Derfor foreslås udfører EM for at vurdere ultrastruktur af GFB, som giver mulighed for kvantitativ måling af parametre såsom GBM, endotel fenestrae størrelse og antal og podocyte karakteristika. Sådanne målinger kræver minimal uddannelse til at udføre og muliggør investigator at bestemme celle-typer/strukturer påvirket i en sygdom model. I eksemplet vist i de repræsentative resultater, VEGF-A KO mus blev fundet at være en mild model af glomerulær sygdom, således, var ingen store strukturelle abnormiteter til stede ved PAS farvning. Dog podocyte-specifikke VEGF-A KO fremkalde ændringer til GBM, podocytes og endotelceller, når den undersøger de glomerulær ultra-struktur5. Forberedelse af nyrerne til EM beskrevet i den aktuelle metode giver desværre ikke påvisning af i endothelial glycocalyx, som også er kendt for at have betydelige virkninger på permeabilitet af GFB19. For at præcist at måle glycocalyx dybde, skal nyrerne være perfuse-fast med 2,5% glutaraldehyd med 1% Alcian blå i endothelial glycocalyx mærkning, som beskrevet i Oltean mfl19.
Når den funktionelle og strukturelle fænotype er blevet vurderet, kan udtryk/aktivisering mønstre af forskellige gener og veje derefter vurderes konkret i glomeruli. Ultra-strukturelle forhåndsvurdering kunne give nogle oplysninger om cellen typer/glomerulær strukturer involveret, der angiver, om podocyte – eller endotel-specifikke gener/veje bør undersøges. For eksempel, i de repræsentative resultater fra VEGF-A KO mus, blev en reduktion i endothelial fenestrae antallet observeret (figur 3D); Derfor blev glomerulær protein udtryk for en endotel mærke kendt for at være involveret i VEGF-en vej undersøgt; VEGFR-2 (figur 4B)5. Ud over udtrykket af proteiner i glomeruli, kan deres lokalisering også visualiseres ved hjælp af hvis. I en undersøgelse af Zhang mfl20, blev podocyte-specifikke overekspression af GLUT1 bekræftet i podocytes af hvis Co lokalisere den øgede GLUT1 med podocin.
I forhold til alternative metoder præsenteres i litteraturen til at vurdere glomerulær funktion, giver brug af metoden beskrevet i denne hvidbog at vurdere nyrefunktionen i musemodeller af glomerulær sygdom glomerulær fænotype vurderes fuldt ud fra flere aspekter. Ved hjælp af denne metode, er at forskeren stand til at bestemme nyre Fænotypen af modellen og vurdere mekanisme, hvorfor fænotype udvikler. Denne vitale oplysninger om mekanismen af sygdommen er påkrævet, når du undersøger potentielle terapeutiske muligheder i disse modeller. Denne metode kan nemt anvendes til fremtidige undersøgelser glomerulær funktion både i vurderingen af sygdom fænotyper og potentielle therapeutics.
Til sidst, beskriver denne generisk og fleksibel protokol en fuld nyre arbejde op for musemodeller af glomerulær sygdom, gør det muligt for en enorm mængde af informationer vedrørende nyre og glomerulær funktion at være fremstillet af et enkelt museklik. Metoderne, der giver mulighed for detaljerede funktionelle, strukturelle og mekanistiske analyse af glomerulær funktion, som kan anvendes til alle musemodeller af glomerulær sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den britiske Heart Foundation, Richard Bright VEGF forskning har tillid og MRC.
Metabolic Cages | Harvard Apparatus | 52-6731 | |
Tris buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | T5912-1L | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl Laboratories | E90-134 | |
TMB ELISA Substrate solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
SPECTRstar nano | BMG Labtech | SPECTRstar nano or equivalent | |
RNAlater stabilisation solution | ThermoFisher Scientific | AM7020 | |
4-15% precast protein gel | BIORAD | 4568084 | |
4x Laaemmli Sample buffer | BIORAD | 161-0747 | |
Mini Trans-Blot cell | BIORAD | 1703930 | |
10x Tris running buffer | BIORAD | 1610732 | |
Coomassie Brilliant Blue Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
Creatinine Companion | Exocell | 1012 Strip Plate | |
Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
10x Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | AM9625 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
EDTA Blood Collection tubes | BD | 367835 | |
23-25G Needle | BD | PMC0735 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
10 ml Glass Vial | Thomas Scientific | 0914X10 | |
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes | ThermoFisher Scientific | 10110101 | |
0.5 ml Tubes | ThermoFisher Scientific | 10681894 | |
Disposable Tissue Molds | ThermoFisher Scientific | 22-363-553 | |
Mouse Surgical Disection Kit | ThermoFisher Scientific | 13-005-204 | |
Optimal Cutting Medium | ThermoFisher Scientific | 23-730-571 | |
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Glass Capillary Tubes | Harvard Apparatus | EC1 64-0770 | |
Glomerular Permeability Rig | Built at the Univeristy of Bristol – not comercially available | Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol | |
Stainless Steel Sieves | Cole-Parmer | WZ-59984 | |
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System | Sigma-Aldrich | 395B-1KT | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
Xylene | MerckMillipore | 108298 | |
Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | 8030 | |
Osmium tetroxide solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
Aradite Resin | Agar Scientific | CY212 | |
Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
Lead Citrate | Agar Scientific | AGR1210 | |
Cryostat | ThermoFisher Scientific | e.g. 957000H | |
Hydrophobic Pen | Abcam | ab2601 | |
Nephrin (1243-1256) Antibody | Acris | BP5030 | |
Anti-Podocin | Sigma-Aldrich | P0372-200UL | |
Anti-CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
Alexa Fluor Secondary Antibody | ThermoFisher Scientific | A32732 | |
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
NP40 Cell Lysis Buffer | ThermoFisher Scientific | FNN0021 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78437X4 | |
10x Transfer Buffer | BIORAD | 1610734 | |
PVDF Membrane | ThermoFisher Scientific | LC2002 | |
HRP-Conjugated Secondary Antibodies | Abcam | ab6721 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Fisher | 10713387 | |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
Dnase I | New England Biolabs | M0303S | |
M-MLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M053S | |
Oligo dT | ThermoFisher Scientific | 18418012 | |
Random Primers | ThermoFisher Scientific | 48190011 | |
dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427088 | |
Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
DEPC Water | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
Fluorescent Light Miscroscope | Leica Microsystems | ||
Image J Analysis Software | Image J | ||
PCR Thermocycler | ThermoFisher Scientific | ||
TEM Microscope | Britannica |