Summary

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكولين لدراسة التفاعلات بلعمية-بكتريا أبسسيسوس : فحص مكتبة ينقول متحولة لعوز داخل الخلايا البكتيرية وتصميم الترنسكربيتوم داخل الخلايا البكتيرية من الحمض النووي الريبي التسلسل. كلا النهجين التبصير مزايا الجينوم والتكيفات ترانسكريبتوميك تعزيز اللياقة البدنية البكتيريا داخل الخلايا.

Abstract

ما يميز بكتريا أبسسيسوس من المتفطرة saprophytic الأخرى هو القدرة على مقاومة البلعمه بالضامة البشرية والقدرة على ضرب داخل هذه الخلايا. تجعل هذه الصفات الفوعة م. أبسسيسوس المسببة للأمراض، لا سيما في المضيفين الضعيفة مع أمراض الرئة الهيكلية الأساسية، مثل التليف الكيسي أو القصبات أو السل. كيف يصاب المرضى مع أبسسيسوس م. لا تزال غير واضحة. خلافا للعديد من البكتيريا، أبسسيسوس م. لم يتم العثور على في البيئة لكن قد تتواجد داخل الزحارية، البالعات البيئية التي تمثل خزان محتملة أبسسيسوس م. وفي الواقع، أبسسيسوس م. مقاومة البلعمه أمويبال والحياة داخل-أميبا ويبدو أن زيادة ضراوة م. أبسسيسوس في نموذج تجريبي للعدوى. ومع ذلك، يعرف الكثير عن ضراوة م. أبسسيسوس في حد ذاته. فك جينات تمنح ميزة للحياة داخل الخلايا أبسسيسوس م. ، وضعت عرض مكتبة متحولة ينقول م. أبسسيسوس . في موازاة ذلك، تم تطوير طريقة لاستخراج الحمض النووي الريبي من البكتيريا داخل الخلايا بعد ثقافة المشارك مع الزحارية. هذا الأسلوب تم التحقق من صحتها ويسمح تسلسل كله أبسسيسوس م. ترانسكريبتوميس داخل الخلايا؛ تقدم، لأول مرة، نظرة عالمية على أبسسيسوس م. التكيف مع الحياة داخل الخلايا. كلا النهجين تعطينا نظرة ثاقبة في عوامل الفوعة أبسسيسوس م. تمكن م. أبسسيسوس لاستعمار الشعب الهوائية في البشر.

Introduction

جنس متفطره يشمل الأنواع تتراوح بين الكائنات saprophytic غير مؤذية لمسببات الأمراض البشرية الرئيسية. الأنواع المسببة للأمراض المعروفة مثل بكتريا السلو بكتريا marinum المقرحة متفطره تنتمي إلى المجموعة فرعية النمو البطيء المتفطرة (SGM). وفي المقابل، الفريق الفرعي للنمو السريع المتفطرة (رجم) تتميز بقدرتها على تشكيل مستعمرات مرئية في أقل من 7 أيام في المتوسط أجار. وتضم المجموعة رجم الأنواع أكثر من 180، المتفطرة saprophytic غير ممرضة أساسا. الدراسات المتعلقة برجم التفاعلات مع مضيفيهم ركزت أساسا على بكتريا سميجماتيس وإثبات أن هذه البكتيريا قد أزيلت سريعاً بفعل جراثيم الضامة.

متفطره أبسسيسوس هو واحد من رجم النادرة التي المسببة للأمراض للبشر، ومسؤولة عن طائفة واسعة من الأمراض بدءاً بالجلد والتهابات الأنسجة الرخوة للالتهابات الرئوية ونشرها. ويعتبر أبسسيسوس م. ، جنبا إلى جنب مع بكتريا بالمتفطره، أن الممرض المتفطرات الرئيسي في مرضى التليف الكيسي1.

تشير مختلف الدراسات التي أجريت على أبسسيسوس م. أن هذا المتفطرة يسلك ممرض داخل الخلايا، قادرة على النجاة من جراثيم استجابة الضامة والليفية في الرئتين والجلد، والتي لا تحترم عادة في رجم 2 , 3 , 4-تحليل الجينوم أبسسيسوس م. وقد حددت المسارات الأيضية التي توجد عادة في الكائنات المجهرية البيئية على اتصال مع التربة، والنباتات والبيئات المائية، حيث غالباً ما تكون الزحارية الحرة الحالية5. قد أثبتت أيضا أن أبسسيسوس م. يتمتع بجينات الفوعة عدة لا توجد في رجم saprophytic وغير ممرضة، ربما حصل عليها نقل الجينات الأفقي في مكانة مواتية لتبادل الوراثية التي قد جمع البكتيريا المقاومة أميبا المختلفة.

تجريبيا، كان أحد نتائج ملفتة للنظر الأولى مراقبة النمو داخل الخلايا من أبسسيسوس م. في الضامة، وكذلك فيما يتعلق السل م.6. أبسسيسوس م. كما يقاوم التحمض يبلوع والمبرمج وأوتوفاجي، ثلاث آليات أساسية لمقاومة العدوى2الخلوية. بل ثبت أن أبسسيسوس م. يكون قادراً على إنشاء رسالة فورية بين يبلوع وسيتوسول، بيئة أكثر الغنية بالمغذيات التي قد تشجع على تكاثر البكتيريا2. جداً لا يعرف الكثير عن مزايا الجينوم أن أبسسيسوس م. تمتلك أو اكتسب للسماح بالبقاء على قيد الحياة في بيئة داخل الخلايا. كوكولتوري أميبا هو أسلوب فعال يسمح بعزل العديد من البكتيريا المقاومة أميبا جديدة بكتريا ماسيلينسي7،8. ولوحظ قدرة على ضرب داخل الزحارية، في نموذج هباء M. أبسسيسوس في الفئران، التي يمكن أن تضفي زيادة فوعة إلى أبسسيسوس م.4. فرضية واحدة هي أن أبسسيسوس م. وضعت الصفات الوراثية مصادفة في إطار هذه البيئة البقاء على قيد الحياة في خلايا متجولة، التي تختلف عن الأخرى رجم غير ممرضة. قد تفضل هذه المقتنيات قدرة على الانتشار وشدته في المضيف البشري.

ويصف هذا التقرير أدوات وأساليب لتسليط الضوء على مزايا الجينوم الممنوحة إلى أبسسيسوس م. البقاء على قيد الحياة في بيئة الزحارية. لهذا الغرض، فحص طفرات ينقول م. أبسسيسوس هو وصف لأول مرة، في سلالة نوع شوكميبة كاستيلاني ، مما يتيح تحديد معيبة للمسخ للنمو داخل الخلايا. ويقال أيضا لفحص ثان في الضامة، لتأكيد إذا كان هذا الخلل ما زال قائما في المضيف البشري. وثانيا، لفهم الآليات التي يتم تسخيره في أبسسيسوس م للتكيف مع الحياة في متجولة الخلايا وزيادة شدته في البلد المضيف الحيواني، وأسلوب مكيفة خصيصا أبسسيسوس م. وقد وضعت، بعد ثقافة المشارك حضور الزحارية الذي يسمح باستخراج الحمض النووي الريبي مجموع من البكتيريا داخل أمويبال. نتيجة لذلك، تم تطوير رؤية شاملة للجينات أبسسيسوس م. التي مطلوبة من أجل حياة داخل الخلايا.

Protocol

1-مكتبة الفرز بناء المكتبة متحولة تينيسي الحصول على مكتبة ينقول.ملاحظة: هذه التجربة، حصل مكتبة ينقول متحولة من روبين اكساجولا، “مدرسة هارفارد للصحة العامة”، بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية. المكتبة شيد من سلالة سريرية سلس (43S) أبسسيسوس م. مجمع (م. أبسسيسو…

Representative Results

أبسسيسوس م. لديه القدرة على مقاومة والهروب من الردود جراثيم الضامة والبروتوزوا البيئية مثل الزحارية. أبسسيسوس م. وتعرب عن عوامل الفوعة عندما نمت على اتصال الزحارية، مما يجعلها أكثر شراسة في الفئران4. وكان الهدف الأول لهذه الأساليب لتحديد الجينات ا?…

Discussion

سلوك أبسسيسوس م. يشبه أكثر بكثير لسلوك SGM المسببة للأمراض مثل السل م من أي المتفطرة أخرى تنتمي إلى رجم2. والعنصر الأساسي في الأمراض التي تسببها SGM هو قدرتها على البقاء على قيد الحياة أو حتى تتكاثر داخل خلايا مستضد-عرض، مثل الضامة، والخلايا الجذعية.

أب?…

Acknowledgements

نعترف روبين اكساجولا “العلاقات العامة” (مدرسة طب هارفرد، بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى حد كبير لهدية ثمينة للمسخ المكتبة، والدكتور مارشال بن (كلية الطب، جامعة ساوثهامبتون، المملكة المتحدة) لتصويبات المخطوطة. ونعترف “الرابطة الفرنسية المريض” كثيرا التليف الكيسي “Vaincre la Mucoviscidose” و “الرابطة غريغوري لومارشال” لدعمها المالي (RF20150501377). ونشكر أيضا الوكالة الوطنية للبحوث (ANR برنامج ديميفير (ANR-13-BSV3-0007-01))، والقارسة ضمور (Domaine د ‘ الاهتمام القاهرة علل إينفيكتيوسيس et اميرجينتيس) لتمويل زمالات ما بعد الدكتوراه إلى V.L-م. ل. ل. وزميل دكتوراه من “وزارة التعليم العالي et de la البحوث”.

Materials

Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

References

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  14. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  15. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  16. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
  17. Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  18. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  19. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  20. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
  21. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
  22. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
  23. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  24. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  25. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  26. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  27. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  28. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  29. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  30. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  31. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  32. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  33. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).

Play Video

Cite This Article
Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

View Video