Summary

Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

Published: September 27, 2018
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Summary

Aquí, presentamos dos protocolos para estudiar las interacciones de la fagocito –abscessus de la micobacteria : la proyección de una biblioteca mutante de transposon de deficiencia intracelular bacteriana y la determinación de transcriptoma bacteriana intracelular de RNA secuencia. Ambos enfoques proporcionan información sobre las ventajas genómicos y transcriptómicos adaptaciones mejorar la aptitud de las bacterias intracelulares.

Abstract

Abscessus de la micobacteria de otras micobacterias saprofitas es la capacidad de resistir la fagocitosis por los macrófagos humanos y la capacidad de multiplicarse dentro de tales células. Estos rasgos de virulencia render M. abscessus patógenas, especialmente en huéspedes vulnerables con enfermedad pulmonar estructural subyacente, tales como fibrosis quística, bronquiectasias o tuberculosis. No está claro cómo los pacientes se infectan con M. abscessus . A diferencia de muchas micobacterias, M. abscessus no se encuentra en el medio ambiente pero podría residir dentro de las amebas, los fagocitos ambientales que representan un potencial reservorio de M. abscessus. De hecho, M. abscessus es resistente a fagocitosis amoebal y la vida intra-ameba parece aumentar la virulencia de M. abscessus en un modelo experimental de infección. Sin embargo, poco se sabe sobre la virulencia de M. abscessus en sí mismo. Para descifrar los genes que confieren una ventaja a la vida intracelular de M. abscessus , se realizó un screening de una biblioteca mutante de M. abscessus transposon. Paralelamente, se desarrolló un método de extracción de RNA de micobacterias intracelulares después de co-cultivo con amebas. Este método fue validado y permitido la secuenciación de todo M. abscessus transcriptomas dentro de las células; proporcionar, por primera vez, una visión global de M. abscessus adaptación a la vida intracelular. Ambos enfoques nos dan una visión de factores de virulencia de M. abscessus que M. abscessus colonizar las vías respiratorias en los seres humanos.

Introduction

El género Mycobacterium incluye especies que van desde organismos saprofitos inofensivos a los patógenos humanos más importantes. Bien conocidas especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum Mycobacterium ulcerans pertenecen al subgrupo de crecimiento lento micobacterias (SGM). En contraste, el subgrupo de crecimiento rápido micobacterias (RGM) se caracteriza por su capacidad para formar colonias visibles en menos de 7 días en medio de agar. El grupo RGM compone de más de 180 especies, principalmente micobacterias saprofitas no patógenos. Estudios sobre las interacciones de RGM con sus anfitriones han centrado principalmente en Mycobacterium smegmatis y demuestran que estas micobacterias son rápidamente eliminadas por la acción bactericida de los macrófagos.

Mycobacterium abscessus es una de la s raros que son patógenas para los seres humanos y es responsable de una amplia gama de infecciones que van desde la piel y tejidos blandos a las infecciones pulmonares y diseminadas. M. abscessus es considerado, junto con Mycobacterium avium, a ser el principal patógeno por micobacterias en pacientes de fibrosis quística1.

Varios estudios realizados en M. abscessus indican que esta micobacteria se comporta como un patógeno intracelular, capaz de sobrevivir la respuesta bactericida de los macrófagos y fibroblastos en los pulmones y la piel, que generalmente no se observa en RGM 2 , 3 , 4. análisis del genoma de M. abscessus ha identificado vías metabólicas suelen encontradas en microorganismos ambientales en contacto con el suelo, plantas y ambientes acuáticos, que suelen ser las amebas libres5. También han demostrado que M. abscessus está dotada de varios genes de virulencia que no se encuentran en la RGM no patógenas y saprofita, probablemente adquirida por la transferencia horizontal del gene en un nicho favorable al intercambio genético que podría reunir varias bacterias resistentes a la amebas.

Experimentalmente, uno de los primeros resultados llamativos fue la observación de crecimiento intracelular de M. abscessus en macrófagos, así como para M. tuberculosis6. M. abscessus resiste también la acidificación del fagosoma, apoptosis y autofagia, tres mecanismos esenciales de la resistencia celular a la infección2. Incluso se ha demostrado que M. abscessus es capaz de establecer una comunicación inmediata entre el fagosoma y el citosol, un ambiente más rico en nutrientes que puede favorecer la multiplicación bacteriana2. Muy poco se sabe acerca de las ventajas genómicas que M. abscessus posee o ha adquirido para permitir la supervivencia en un entorno intracelular. Cocultivo de la ameba es un método eficaz que permite el aislamiento de muchas nuevas bacterias resistentes a la amebas como Mycobacterium massiliense7,8. La capacidad de multiplicarse dentro de las amebas se observó, en un modelo de aerosolización de M. abscessus en ratones, que puede conferir una mayor virulencia de M. abscessus4. Una hipótesis es que M. abscessus había desarrollado rasgos genéticos encontrados dentro de este entorno para sobrevivir en las células fagocíticas, que son diferentes de otros no patógenos RGM. Estas adquisiciones podrían favorecer la capacidad de difusión y su virulencia en el anfitrión humano.

Este informe describe herramientas y métodos para resaltar las ventajas de genomic conferidas a M. abscessus para sobrevivir en el ambiente de las amebas. Para este propósito, la selección de mutantes de M. abscessus transposon se describe en primer lugar, en la cepa tipo de Acanthamoeba castellanii. , que permite la identificación de defectos del mutante para el crecimiento intracelular. También se divulga una segunda proyección en macrófagos, para confirmar si este defecto persiste en el anfitrión humano. En segundo lugar, para comprender qué mecanismos se aprovechen en M. abscessus para adaptarse a la vida en fagocitario células y aumento de su virulencia en el anfitrión animal, un método especialmente adaptado por M. abscessus fue desarrollaron, después de cocultivo en presencia de amebas que permitieron la extracción de ARN total de bacterias intra-amoebal. Como consecuencia, se desarrolló una visión integral de M. abscessus genes que se requieren para una vida intracelular.

Protocol

1. librería proyección Construcción de la biblioteca del mutante de Tn Obtener una biblioteca de transposon.Nota: Para este experimento, una biblioteca mutante transposon se obtuvo de E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, Estados Unidos. La biblioteca fue construida de una cepa clínica lisa (43S) de la de M. abscessus complejo (M. abscessus subsp. massiliense) con un phagemid introducido en M. abscessus la inserción …

Representative Results

M. abscessus tiene la capacidad para resistir y escapar de la respuesta bactericida de los macrófagos y ambientales protozoos como las amebas. M. abscessus expresa factores de virulencia cuando se cultiva en contacto con las amebas, que hace más virulentas en ratones4. El primer objetivo de estos métodos fue identificar los genes presentes en M. abscessus permitiendo su supervivencia y multiplicación dentro de amebas. <p class="jo…

Discussion

El comportamiento de M. abscessus es mucho más similar al comportamiento de SGM patógeno como M. tuberculosis que cualquier otras micobacterias pertenecientes a RGM2. El elemento clave en la patogenicidad del SGM es su capacidad para sobrevivir o multiplicarse aún dentro de las células presentadoras de antígeno tales como macrófagos y células dendríticas.

M. abscessus ha adquirido ciertas ventajas genomic como se muestra en la secuenci…

Acknowledgements

Reconocemos mucho PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) para el precioso don del mutante de biblioteca y el Dr. Ben Marshall (Facultad de medicina, Universidad de Southampton, Reino Unido) para la corrección del manuscrito. Mucho reconocemos la asociación francesa de paciente de la Fibrosis Quística “Vaincre la Mucoviscidose” y “L’Association Gregory Lemarchal” por su apoyo financiero (RF20150501377). También agradecemos a la Agencia Nacional de investigación (programa de ANR (ANR-13-BSV3-0007-01) de DIMIVYR) y la Région Ile (Domaine d’Intérêt mayor Maladies Infectieuses et Emergentes) para la financiación de la beca postdoctoral para VL-m.. L. L. es Becaria doctoral de la “Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.

Materials

Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

References

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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