Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes
Summary
Nous présentons ici deux protocoles pour étudier les interactions Phagocyte –Mycobacterium abscessus : le criblage d’un transposon mutant pour carence intracellulaire bactérienne et la détermination des bactéries intracellulaire transcriptome de l’ARN séquençage. Les deux approches offrent un aperçu des avantages génomiques et transcriptomique des adaptations améliorant l’aptitude des bactéries intracellulaires.
Abstract
Ce qui le différencie des autres mycobactéries saprophytes Mycobacterium abscessus , c’est la capacité à résister à la phagocytose par les macrophages humains et la capacité de se multiplier à l’intérieur de ces cellules. Ces traits de caractère de virulence rendent M. abscessus pathogène, en particulier chez les hôtes vulnérables ayant une maladie pulmonaire structurelles sous-jacentes, telles que la fibrose kystique, dilatation des bronches ou la tuberculose. Comment les patients deviennent infectées par M. abscessus reste floue. Contrairement à nombreuses mycobactéries, M. abscessus ne se trouve pas dans l’environnement, mais pourrait résident à l’intérieur des amibes, les phagocytes environnementales qui représentent un réservoir potentiel pour M. abscessus. En effet, M. abscessus est résistant à la phagocytose amibiennes et la vie intra-amibe semble augmenter M. abscessus virulence dans un modèle expérimental d’infection. Cependant, on connaît M. abscessus virulence en soi. Pour déchiffrer les gènes conférant un avantage à M. abscessus vie intracellulaire, un criblage d’un transposon M. abscessus mutant a été développé. En parallèle, il a développé une méthode d’extraction de l’ARN des mycobactéries intracellulaires après co-culture avec des amibes. Cette méthode a été validée et a permis le séquençage de l’ensemble M. abscessus transcriptomes l’intérieur des cellules ; fournir, pour la première fois, une vue globale sur M. abscessus adaptation à la vie intracellulaire. Ces deux approches nous donnent un aperçu des facteurs de virulence de M. abscessus qui permettent à M. abscessus coloniser les voies respiratoires chez l’homme.
Introduction
Le genre Mycobacterium comprend des espèces allant des organismes saprophytes inoffensifs aux principaux agents pathogènes humains. Les espèces pathogènes notoires comme Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum et Mycobacterium ulcerans appartiennent au sous-groupe de croissance lente mycobactéries (SGM). En revanche, le sous-groupe de croissance rapide mycobactéries (RGM) se caractérise par leur capacité à former des colonies visibles en moins de 7 jours, sur un milieu gélosé. Le groupe RGM comprend plus de 180 espèces, principalement des mycobactéries saprophytes non pathogène. Études sur les interactions avec leurs hôtes RGM ont principalement porté sur Mycobacterium smegmatis et démontrent que ces mycobactéries sont rapidement éliminés par l’action bactéricide des macrophages.
Mycobacterium abscessus est l’un des rare GRM qui sont pathogènes pour l’homme et est responsable d’un large éventail d’infections allant de la peau et des tissus mous pour les infections pulmonaires et disséminées. M. abscessus est considéré, avec Mycobacterium avium, d’être le principal pathogène mycobactérie dans la fibrose kystique les patients1.
Diverses études effectuées sur M. abscessus indiquent que cette mycobacterium se comporte comme un agent pathogène intracellulaire, capable de survivre la réponse bactéricide des macrophages et des fibroblastes dans les poumons et la peau, ce qui n’est pas habituellement observée dans RGM 2 , 3 , 4. analyse du génome de M. abscessus a identifié les voies métaboliques se trouves généralement dans les micro-organismes environnementaux en contact avec le sol, les plantes et les milieux aquatiques, où les amibes libres sont souvent présent5. Ils ont également démontré que M. abscessus est doté de plusieurs gènes de virulence, introuvables dans le GRM saprophyte et non pathogènes, probablement acquis par le transfert horizontal de gènes dans un créneau favorable aux échanges génétiques qui pourraient rassembler diverses bactéries résistantes amibes.
Expérimentalement, l’un des premiers résultats frappants a été l’observation d’une croissance intracellulaire de M. abscessus dans les macrophages, ainsi que pour M. tuberculosis6. M. abscessus résiste également à l’acidification du phagosome, apoptose et autophagie, trois mécanismes essentiels de la résistance cellulaire à l’ infection par2. Il a même été démontré que M. abscessus est en mesure d’établir une communication immédiate entre le phagosome et le cytosol, un environnement plus riche en nutriments qui pourrait favoriser la multiplication bactérienne,2. On en sait très peu sur les avantages de génomiques qui M. abscessus possède ou a acquis afin de permettre la survie dans un environnement intracellulaire. Co-culture d’amibes est une méthode efficace qui a permis l’isolement de nombreuses bactéries résistantes amibes nouveau comme Mycobacterium massiliense7,8. Une capacité de se multiplier dans les amibes a été observée, dans un modèle d’aérosolisation de M. abscessus chez la souris, qui peuvent conférer une virulence accrue à M. abscessus4. Une hypothèse est que M. abscessus avait développé des traits génétiques rencontrées au sein de cet environnement pour survivre dans les cellules phagocytaires, qui sont distinguent des autre non pathogènes RGM. Ces acquisitions pourraient favoriser la capacité de se propager et sa virulence chez l’hôte humain.
Ce rapport décrit les outils et méthodes pour mettre en évidence les avantages génomiques conférés à M. abscessus pour survivre dans l’environnement d’amibes. À cet effet, la projection des mutants de transposon M. abscessus est tout d’abord décrit, sur la souche de type Acanthamoeba castellanii , qui permet l’identification de défectueux de mutant pour croissance intracellulaire. Une seconde projection dans les macrophages est également signalée, pour vérifier si ce défaut persiste chez l’hôte humain. Deuxièmement, pour comprendre les mécanismes qui sont mobilisés par M. abscessus pour s’adapter à la vie en phagocytaires cellules et augmentation de sa virulence chez l’animal hôte, une méthode spécifiquement adaptée pour M. abscessus a été mis au point, après la co-culture en présence d’amibes qui a permis l’extraction de l’ARN total des bactéries intra-amibiennes. En conséquence, une vue d’ensemble des gènes de M. abscessus qui sont nécessaires pour mener une vie intracellulaire a été développée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le comportement de M. abscessus est beaucoup plus semblable au comportement de SGM pathogène tels que M. tuberculosis que n’importe quel autres mycobactéries appartenance à RGM2. L’élément clé de la pathogénicité du SGM est leur capacité à survivre ou même multiplier au sein des cellules présentatrices d’antigène, tels que les macrophages et les cellules dendritiques.
M. abscessus a acquis certains avantages génomiques, com…
Acknowledgements
Nous reconnaissons grandement PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) pour le don précieux du mutant Bibliothèque et le Dr Ben Marshall (Faculté de médecine, Université de Southampton, Royaume-Uni) pour les corrections du manuscrit. Nous reconnaissons grandement l’Association de patients Français pour la fibrose kystique « Vaincre la Mucoviscidose » et « L’Association Gregory Lemarchal » pour leur soutien financier (RF20150501377). Nous remercions également l’Office National de la recherche (programme ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) et la Région Ile-de-France (Domaine d’Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) pour le financement de la bourse de recherche postdoctorale pour V.L-M. L. L. est un doctorant de le « Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche ».
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
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