Identifikation af virulens markører af Mycobacterium abscessus intracellulære replikering i fagocytter
Summary
Her præsenterer vi to protokoller for at studere phagocyt –Mycobacterium abscessus interaktioner: screening af en transposon mutant bibliotek for bakteriel intracellulære mangel og bestemmelse af bakteriel intracellulære transkriptom fra RNA sekventering. Begge tilgange giver indsigt i genomisk fordele og transkriptom tilpasninger forbedre intracellulære bakterier fitness.
Abstract
Hvad adskiller Mycobacterium abscessus fra andre saprofytiske mykobakterier er evnen til at modstå fagocytose af menneskelige makrofager og evne til at formere sig inde i sådanne celler. Disse virulens træk render M. abscessus patogene, navnlig sårbare værter med underliggende strukturelle lungesygdom såsom cystisk fibrose, bronchiectasis eller tuberkulose. Hvordan patienter bliver smittet med M. abscessus uklart. I modsætning til mange mykobakterier, M. abscessus findes ikke i miljøet men måske bor inde amøber, miljømæssige fagocytter, der repræsenterer et potentielle reservoir for M. abscessus. Faktisk, M. abscessus er resistente over for amoebal fagocytose og intra-amøbe liv synes at øge M. abscessus virulens i en eksperimentel model af infektion. Dog er lidt kendt om M. abscessus virulens i sig selv. For at dechifrere de gener, der giver en fordel til M. abscessus intracellulære liv, blev en screening af en M. abscessus transposon mutant bibliotek udviklet. Parallelt, blev der udviklet en metode af RNA udvinding fra intracellulære mykobakterier efter fælles kultur med amøber. Denne metode blev valideret og tilladt sekvenseringen af hele M. abscessus transcriptomes inde i cellerne; give, for første gang, en global view M. abscessus tilpasning til intracellulære liv. Begge tilgange giver os et indblik i M. abscessus virulens faktorer, der aktiverer M. abscessus at kolonisere luftvejene hos mennesker.
Introduction
Slægten Mycobacterium omfatter arter lige fra harmløse saprofytiske organismer til store menneskelige patogener. Kendte patogene arter som Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum og Mycobacterium ulcerans tilhører undergruppe af langsomt voksende mykobakterier (sdb). I kontrast, undergruppe af hurtig-voksende mykobakterier (RGM) er kendetegnet ved deres evne til at danne synlige kolonier i mindre end 7 dage på agarsubstratet. RGM Gruppen består af mere end 180 arter, hovedsagelig ikke-patogene saprofytiske mykobakterier. Undersøgelser på RGM interaktioner med deres værter har hovedsageligt fokuseret på Mycobacterium smegmatis og vise, at disse mykobakterier elimineres hurtigt af den baktericid virkning af makrofager.
Mycobacterium abscessus er en af de sjældne RGM, der er patogene for mennesker og er ansvarlig for en lang række infektioner spænder fra hud og bløddele infektioner til pulmonal og formidlet infektioner. M. abscessus er sammen med Mycobacterium avium, anses at være de vigtigste mykobakterielle patogen i cystisk fibrose patienter1.
Forskellige undersøgelser udført på M. abscessus tyder på, at denne mycobacterium opfører sig som en intracellulær patogen, i stand til at overleve den baktericide svar af makrofager og fibroblaster i lungerne og huden, der ikke er normalt observeret i RGM 2 , 3 , 4. M. abscessus genomanalyse har identificeret stofskifteveje typisk findes i miljømæssige mikroorganismer i kontakt med jord, planter og akvatiske miljøer, hvor gratis amøber er ofte til stede5. De har også vist, at M. abscessus er udstyret med flere virulens gener ikke fundet i den saprofytiske og apatogene RGM, sandsynligvis erhvervet af horisontal genoverførslen i en niche gunstige for genetiske udveksling, der kan samles forskellige amøbe resistente bakterier.
Eksperimentelt, var en af de første slående resultater observation af intracellulære vækst af M. abscessus i makrofager samt M. tuberkulose6. M. abscessus modstår også forsuring af phagosome, apoptose og autophagy, tre væsentlige mekanismer af cellulære modstanden mod infektion2. Det har endda vist sig at M. abscessus er i stand til at etablere en øjeblikkelig kommunikation mellem phagosome og cytosol, en mere næringsrige miljø, der kunne favorisere bakteriel multiplikation2. Meget lidt er kendt om genomisk fordele, M. abscessus besidder eller har erhvervet for at muliggøre overlevelse i en intracellulær miljø. Amøbe coculture er en effektiv metode, der tillod isolationen af mange nye amøbe resistente bakterier som Mycobacterium massiliense7,8. En evne til at formere sig inden for amøber blev observeret i en model af aerosolization af M. abscessus i mus, som kan give en øget virulens M. abscessus4. En hypotese er, at M. abscessus havde udviklet genetiske træk opstod inden for dette miljø til at overleve i fagocyterende celler, som er forskellige fra andre ikke-patogene RGM. Disse opkøb kan favor muligheden for at sprede og dens virulens i den menneskelig vært.
Denne rapport beskriver værktøjer og metoder til at fremhæve de genomisk fordele til M. abscessus at overleve i miljøet, amøber. Til dette formål, screening af M. abscessus transposon mutanter først er beskrevet, på Acanthamoeba castellanii type stamme, som giver mulighed for identifikation af mutant’s defekt for intracellulære vækst. En anden screening i makrofager er også rapporteret, at bekræfte, hvis fejlen fortsætter i den menneskelig vært. For det andet, for at forstå hvilke mekanismer er spændte i M. abscessus til at tilpasse sig livet i fagocyterende celler og øge dens virulens i den animalske vært, en metode, der er specielt tilpasset til M. abscessus blev udviklet, efter fælles kultur i nærværelse af amøber, der tillod ekstraktion af total RNA fra intra-amoebal bakterier. Som en konsekvens, blev en omfattende visning af M. abscessus gener, der er nødvendige for en intracellulær liv udviklet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funktionsmåden for M. abscessus er meget mere ligner funktionen af patogene SGM som M. tuberkulose end nogen andre mykobakterier tilhører RGM2. Det centrale element i SGM patogenicitet er deres evne til at overleve eller endog formere sig i antigen-præsenterer celler, såsom makrofager og dendritiske celler.
M. abscessus har erhvervet visse genomisk fordele, som det fremgår af den samlede sekvens af dens genom14 for…
Acknowledgements
Vi høj grad anerkende Pr. ej Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) for den dyrebare gave af muterede bibliotek, og Dr. Ben Marshall (Faculty of Medicine, University of Southampton, UK) til rettelser af manuskriptet. Vi anerkender meget fransk patienten Association for cystisk fibrose “Vaincre la Mucoviscidose” og “L’Association Gregory Lemarchal” for deres finansielle støtte (RF20150501377). Vi takker også det nationale agentur for forskning (ANR program DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) og Région Ile-de-France (Domaine d’Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) til finansiering af postdoc stipendium til V.L-M. L. L. er Ph.d.-stipendiat fra den “Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
References
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
