Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning af antistoffer, som neutraliserer den cellulære optagelse af enzymet udskiftning behandlingsformer med en celle-baseret analyse

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/57777
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1BioMarin Pharmaceutical Inc

Summary

Her præsenterer vi en celle-baserede flow flowcytometri metode til påvisning af neutraliserende antistoffer eller andre faktorer, der forstyrrer den cellulære optagelse af enzymet udskiftning behandlingsformer i et menneskelige matrix, såsom cerebral-spinalvæske (CSF) eller humant serum.

Abstract

Administration af enzymet udskiftning behandlingsformer (ERTs) og andre biologiske behandlinger til patienter, der kan fremkalde en anti-drug immunrespons. Karakterisering af disse anti-drug antistoffer (ADA), især dem, der kan neutralisere den biologiske aktivitet i stoffet, betegnes neutraliserende antistoffer (Davids), er afgørende i forståelsen af virkningerne af disse antistoffer på stoffet farmakologisk profil. Denne protokol beskriver en celle-baserede flow flowcytometri metode til påvisning af faktorer, som neutraliserer den cellulære optagelse af en repræsentant lysosomale ERT i menneskelige matrix. Protokollen består af tre procedurer: screening, en bekræftende skridt og titer assays til at opdage, identificere og etablere det relative niveau af neutraliserende antistof titer i emnet prøver.

I denne metode, prøver først blandet med fluorophore-konjugeret ERT produkt, og derefter inkuberes med celler [fx, humane T lymfocytter (Jurkat celler)], der udtrykker en celle-overflade kation-uafhængige mannose-6-fosfat receptor (CI-M6PR), og Endelig analyseres med en flow Flowcytometret. En prøve uden NAbs vil resultere i udnyttelsen af den fluorophore-konjugeret ERT produkt via CI-M6PR, der henviser til, at tilstedeværelsen af Nimb vil binde sig til stoffet og forstyrre CI-M6PR binding og optagelse. Mængden af fluorophore-konjugeret ERT internaliseret af Jurkat celler er målt ved flowcytometri og evalueret som procent (%) signal hæmning i forhold til respons opnås i overværelse af en repræsentant stof-naive matrix. I trinnet bekræftende er prøver pre rugede med ERT-konjugeret magnetiske perler nedbryder stof-specifikke faktorer, at binde til lægemiddel (såsom NAbs) før en inkubering med celler. Prøver, som skærmen og bekræfte positive for narkotika-specifikke Nimb i analysen er derefter seriefremstillede fortyndes for at generere et antistof titer. Semi-kvantitative antistof titers kan være korreleret med målinger af lægemiddelsikkerhed og effektivitet.

Introduction

Immunogenicitet vurdering er en vigtig del af sikkerheds- og virkningskriterier overvågning program for ethvert biologiske terapeutisk produkt, herunder ERTs. Patienter kan udvikle en immunrespons, der kan direkte påvirke lægemidler sikkerhed, effektivitet og farmakokinetiske/farmakodynamiske profiler. Et undersæt af disse ADA, kaldet Nimb, kan hæmme ERT effekten på to måder: gennem hæmning af ERT optagelse i den målrettede celle eller ved at hæmme ERT katalytisk aktivitet. Den metode, der præsenteres her er designet til at måle Nimb, der forstyrrer ERT optagelse i celler. Fuldt overvåge sikkerheden og virkningen af den terapeutiske ERT, er løbende overvågning af Nimb afgørende i belyse eventuelle potentielle korrelationer med kliniske resultater eller farmakodynamiske virkninger1.

Platforme for at vurdere NAbs mod protein therapeutics omfatter cellebaserede, enzymatisk aktivitet og ligand-bindende assays1. Optimal assay platform er udvalgt på grundlag af en række kriterier: virkningsmekanisme af produktets terapeutiske, assay platform følsomhed, selektivitet, præcision, og vigtigere, dens evne til at efterligne den hæmmende virkning af Nimb i vivo . Ligand-bindende assays kan være hensigtsmæssigt i visse tilfælde (f.eks.når en relevant cellelinie ikke kan identificeres, eller hvis den passende følsomhed ikke kan opnås i en celle-baseret analyse). Men i 2016 udkastet til FDA retningslinjer for industrien dokument og andre industri-accepteret hvidbøger, celle-baserede NAb assays anbefales, fordi de kan bedre afspejler den biologiske mekanisme af narkotika i vivo1,2 , 3.

De kritiske komponenter for at udvikle en flow flowcytometri cellebaserede NAb assay omfatter en passende cellelinje, der reagerer på stof stimulation, et surrogat positive-kontrol NAb, som neutraliserer ERT, en fluorophore-konjugeret ERT og den biologiske arter matrix4,5,6. Line cellemarkeringen er afhængig af ERT virkningsmekanisme og flere cellelinjer bør vurderes under assay udvikling3. I metoden beskrevet her, blev menneskelige Jurkat T-celler udvalgt for deres endogene CI-M6PR udtryk på celleoverfladen og manglen på antistof fragment receptorer (FcRs), der ukritisk binde regionen Fc i de fleste antistoffer7,8 . Under analysen udvikling er det vigtigt at etablere en negativ kontrol for valideringsundersøgelserne og patient prøven test, såsom serum samles fra enkeltpersoner, der ikke er blevet behandlet med test artikel1. Cellelinjer bør også tåle relevante matricer fra forskellige arter for kontinuitet på tværs af de kvalitetsdata, kliniske og post marketing stadier af narkotika udvikling1. En anden komponent er udvælgelsen af den assay positiv kontrol. Den positive kontrol for ERT celle optagelse assay blev udvalgt på baggrund af sin evne til at binde den terapeutiske og neutralisere optagelse gennem CI-M6PR9,1. Det er ofte vanskeligt at opnå nyttige eller bæredygtig mængder af neutraliserende antisera fra menneskelige emner til brug som en assay kontrol, især i sjælden sygdom patientpopulationer2. Alternativer omfatter antisera fra hyper-immuniseret dyr eller affinitet-renset polyklonale eller monoklonale antistoffer spidse i analysen relevante matrix1. Mens du bruger en artsspecifik matrix, er det muligt at hæmmende faktorer end antistoffer til stede i matricen kan hæmme ERT optagelse. En anden afgørende komponent i analysen er den fluorophore-konjugeret ERT. Udvælgelsen af fluorophore for ERT konjugation bør vurderes for hver ERT, baseret på den assay behovet for lysstyrken, pH stabilitet og potentielle spektrale overlapning i andre kanaler på flow-Flowcytometret.

Analysen beskrevet her er et eksempel til at måle en NAb til en terapeutisk protein, som en ERT, der kommer ind i cellen via CI-M6PR. Flere ERTs, beregnet til at behandle lysosomale opbevaring lidelser (LSDs), udnytte denne vej for celle optagelse og lysosomale målretning, herunder elosulfase alfa Morquio A syndrom, cerliponase alfa for CLN2 Batten disease, agalsidase alfa for Fabry sygdom, og alglucosidase alfa for Pompe sygdom10,11. Formålet med denne metode er at måle de relative niveauer af Nimb, der interfererer med narkotika bindende og internalisering via CI-M6PR. Dette udføres i differentieret screening, verifikation, og titer trin3. Prøver er først screenet for NAb positivitet og derefter bekræftet positivt i den bekræftende skridt. Endelig kan prøver at skærmen og bekræfte positive fortyndes seriefremstillede for at generere et antistof titer1. Denne celle-baserede flow flowcytometri drug optagelse assay giver en følsom og mekanisk relevante in vitro- metode til måling af stof-specifikke Nimb, der kan påvirke et lægemiddel farmakologisk profil. Vi tidligere har valideret metoden og testet kliniske prøver ved hjælp af denne platform for drug elosulfase alfa8. Her beskriver vi de detaljerede trinvise protokol, der kan anvendes til andre terapeutiske proteiner eller ERTs.

Protocol

Menneskelige matricer blev købt fra kommercielle kilder med godkendelse fra deres institutionelle Review Board (IRB) men skal behandles som potentielt smittefarlige. Sikre, at laboratoriemiljø bruges fastholder en kultur af sikkerhed12.

1. før du starter analysen

  1. Forberede ERT-konjugeret streptavidin magnetiske perler ifølge producentens instruktioner13.
  2. Forberede kvalitet kontrolprøver (QCs): spike en positiv kontrol antistof (PC) (f.eks.en NAb) i den artsspecifikke matrix (fx, poolede CSF eller serum).
    Bemærk: FDA og EMA vejledning anbefaler forbereder en høj og en lav QC assay validering og rutine test1,14.
    1. For eksempel, for at opnå en QC på 10 µg/mL, tilføje 10 µL af 1 mg/mL stock positiv kontrol i 990 µL af den relevante matrix (f.eks.CSF) for en samlet maengde paa 1.000 µL.
    2. Alikvot QC prøver i en diskenhed, der er egnet til en enkelt brug (f.eks.50 µL) og fryse alikvoter ved -60 til-80 ° C1.
    3. Alikvot del en klip-punkt kontrol (CC), artsspecifikke matrix ikke behandlet med test artikel (fx, poolede CSF eller serum) for en enkelt bruger (f.eks.50 µL) og fryse alikvoter ved -60 til-80 ° C1.
  3. Udføre en konjugation reaktion mellem fluorophore og ERT ved hjælp af en protein-mærkning kit ifølge producentens protokol15. Alikvot prøven i et volumen, der er egnet til en enkelt brug (f.eks.50 µL) og fryse alikvoter ved -60 til-80 ° C.

2. dag 1: Celle Plating og forberedelse af prøver

  1. Celle plade forberedelse
    1. Bruge en vævskultur hætte og vedligeholde et aseptisk miljø for følgende trin. Spray hvert objekt, der placeres i hætte med 70% ethanol og opretholde et rent miljø16,17,18.
    2. Varm celle vækstmedium (f.eks.RPMI-1640 med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin-streptomycin) i et vand eller perle bad på 37 ° C19.
    3. Tælle de humane T lymfocytter Jurkat celler og pladen 100 µL pr. brønd på 7,5 x 105 celler/mL i en 96-brønd runde-nederste celle kultur plade egnet til brug på en flow Flowcytometret udstyret med en plade loader.
      1. For eksempel bruge en hemocytometer eller en automatiseret celle tæller til at tælle celler20,21.
      2. Sikre, at cellerne har mindst 70% levedygtighed før man går videre med eksperimentet (f.eks.vurdere levedygtighed med trypan blå farvning)17.
    4. Inkuber celler i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2 og 95% luftfugtighed natten for 14-20 h.
  2. Screening prøveforberedelse
    1. Fortynd genstand eller assay kontrolprøver ved hjælp af serum-gratis medier (f.eks.RPMI-1640). I eksempel metoden her, fortynde prøver 1: 2.5 i RPMI-1640 ved at tilføje 60 µL af prøven til 90 µL serum-frie medier. (fx8-strip rør). Fortsæt til trin 3.1 for at forberede en fluorophore-mærket ERT analyseprocedure.
      Bemærk: Fortynding på 1: 2.5 var eksperimentelt bestemmes og er optimal for den metode, der præsenteres her. Optimale prøve fortyndinger bør fastlægges for hver metode, der er udviklet.
  3. Genfremsatte perle og prøve forberedelse
    1. Beregne antallet af ERT-konjugeret perlerne nødvendige for bekræftende prøver.
      1. For eksempel, for 10 prøver, bruge 10 prøver x 100 µL af ERT-konjugeret perler per prøve + 30% ekstra for at kompensere for eventuelle tab under trinnet til vask = 1.300 µL af ERT-konjugeret perler.
    2. Vortex perlerne grundigt. Tilføje det beregnede antal perler til en 15 mL konisk slange til vask.
    3. Vaske de ERT-konjugeret magnetiske perler ved at tilføje 1.300 µL af kobling buffer eller som foreslået af fabrikanten (f.eks.med fosfatbufferet saltopløsning med 0,1% Polysorbat 20) efter nedenstående13trin.
    4. Vortex røret grundigt. Glasset anbringes i et magnetisk tube rack for 2 min. Uden at forstyrre perlerne, omhyggeligt Aspirér og supernatanten.
      Bemærk: Løsningen vil vende fra mørk brun til at klare Når perlerne er trukket til magneten.
    5. Resuspend perler med 1.300 µL af kobling buffer. Gentag trinene vask for i alt fire vasker.
    6. Efter den sidste vask, suspendere perlerne i 1.300 µL af kobling buffer (tidligere beregnet i trin 2.3.1.1). Tilsæt 100 µL pr. brønd til en 96-brønd, hvide, runde-bund, ikke-bindende polypropylen plade efter plade kort (f.eks, en bekræftende godt pr. prøve eller QC; prøven vil opdeles i dubletter når inkuberes med den fluorophore-mærket ERT).
    7. Pladen anbringes på en 96-brønd side-skirted magnet og tillade perler til at danne en pellet. Omhyggeligt Aspirér klart supernatanten og kassér den.
      Bemærk: Løsningen vil vende fra mørk brun til klar efter ca 1-2 min. på den side-skirted magnet. Opnåede perlerne kaldes de "tørre" perler.
    8. Hvis prøverne screenet positiv og er ved at blive bekræftet, tilføje 100 µL af hver prøve med og uden ERT-konjugeret perler i den passende/tildelte godt. Forsegle pladen med en plastfolie og ryst den i mindst 60 minutter på en orbitalryster på ca 800 rpm ved stuetemperatur (RT).
      Bemærk: Tidligere tilberedt og frosset positive og negative QCs og CC bør medtages på hver plade.
    9. Efter inkubering tilsættes genfremsatte pladen anbringes på 96-brønd side-skirted magnet og tillade perler til at danne en pellet.
  4. Titer fortynding serie forberedelse
    1. For at forberede en titer serie, seriefremstillede fortyndes prøven i matrixen poolede et tilstrækkeligt antal gange til at krydse forudbestemt titer skære punkt1.
    2. For eksempel, bland 30 µL af prøven til 60 µL af poolede matrix i en 1:3 fortyndingsrække for ialt 8 fortyndinger (fx, 8-strip rør). Fortsæt til trin 3.1 for at forberede fluorophore-mærket ERT analyseprocedure.

3. dag 1: Analyseprocedure

  1. Forberede den fluorophore-mærket ERT i serumfrit medium (f.eks., 60 µL pr. brønd, eller ca 6 mL/plade).
    1. For eksempel, at forberede 10 mL af 1 µg/mL fluorophore-mærket ERT, tilsæt 10 µL af stock 1 mg/mL fluorophore-mærket ERT 9,99 ml serum-gratis medier (f.eks.RPMI-1640).
  2. I en ny inkubation plade (f.eks., 96-brønd, hvide, runde-bunden, ikke-bindende polypropylen plade), Tilføj de forberedte prøver fra trin 2.2, 2.3, eller 2,4 og en fluorophore-mærket ERT i en 1:1 blanding i dublerede wells (f.eks.overførsel 60 µL af hver forberedt prøve og tilsættes 60 µL af den fluorophore-mærket ERT pr. brønd).
    Bemærk: Et eksempel eksperiment plade kort er fastsat i figur 1.

Figure 1
Figur 1: eksempel på et eksperiment plade layout. Prøver og en fluorophore-mærket ERT blev inkuberet natten over ved 2 – 8 ° C. Kontrol som høj kvalitet kontrol (HQC), lav-kvalitetskontrol (LQC) og negative kvalitetskontrol (NQC) blev screenet og bekræftet på modsatte hjørner af pladen at vurdere plade ensartethed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Bland prøverne og fluorophore-mærket ERT af pipettering op og ned flere gange med en multikanalpipette. Wrap plader i folien og inkuberes dem natten over ved 2 – 8 ° C til 14-20 h.

4. dag 2: Tilføjelse de forberedte prøver til cellerne

  1. Fjerne udsnit inkubation skilte fra inkubation ved 2 – 8 ° C og varm pladerne ved at placere dem i en perle bad ved 37 ° C i 10-15 min.
  2. Fjerne celler fra CO2 inkubator. Udfør en visuel kontrol af forgyldt celler ved hjælp af en omvendt mikroskop til at sikre, at cellerne vises sund og jævnt fordelt på tværs af brønde17,19.
  3. Tilføje 100 µL af den tidligere blandet prøver og fluorophore-mærket ERT til en celle plade efter eksperimentel plade kort.
  4. Placer celle pladen med de ekstra prøver tilbage til CO2 inkubator ved 37 ° C. Inkuber plade for 3 h og ± 15 min.
    Bemærk: Denne gang blev etableret i laboratoriet som optimal for signal-støj-reaktion i analysen.
  5. Centrifugeres celle plade i 6 min. ved 320 x g i en bordplade centrifuge på 14 – 18 ° C. Bekræfte tilstedeværelsen af en celle pellet i bunden af pladen brønde.
  6. Holde pladen på en 30-45° vinkel. Fjern forsigtigt supernatanten fra hver brønd uden at forstyrre den celle pellet. Tilføje 200 µL af 1 x DPBS på celle pellet i hver brønd resuspend cellerne.
  7. Gentag cellen vaske trin for i alt 3 vasker. Gå straks til trin 5 for celle levedygtighed farvning.

5. dag 2: Celle levedygtighed farvning

  1. Ved hjælp af en multikanalpipette, Tilsæt 100 µL af en brugsopløsning i 1 x Live/døde pletter til hver brønd, valgt for en emission bølgelængde adskiller sig fra den fluorophore-mærket ERT og tilberedt efter producentens instruktioner22.
  2. Inkuber plade i 15 min. på RT i mørke. Centrifugeres plade i 6 min. ved 320 x g i en bordplade centrifuge på 14 – 18 ° C.
  3. Fjern forsigtigt supernatanten fra hver brønd uden at forstyrre den celle pellet. Vaske cellerne 1 x med 1 x DPBS.

6. dag 2: Fastsættelse af celler med 1% PARAFORMALDEHYD

  1. Ved hjælp af en multikanalpipette afpipetteres 100 µL af kølet (ved 2 – 8 ° C) 1% PARAFORMALDEHYD (PFA) i hver brønd.
  2. Forsegle plader og forsigtigt puls vortex at blande. Wrap pladen i folien og placere det ved 2 – 8 ° C i mindst 10 min at give mulighed for fiksering.
    Bemærk: Være omhyggelig med at undgå sprøjt på plade segl.
  3. Tilføje 50 µL af 1 x DPBS i hver brønd ved hjælp af en multikanalpipette op og ned inden analysen.

7. flowcytometri

  1. Læg pladerne på flow forskellige med plade loader og køre dem.
  2. Erhverve og optage den målte median fluorescens intensitet (MFI) ved hjælp af flow flowcytometri software (Se Tabel af materialer).
    Bemærk: Se figur 2 som et eksempel for indstillingerne loader. Prøvegassens strømningshastighed, sample volumen, blande volumen, blande hastigheder, og antallet af blandinger er optimeret til dette assay. Disse kriterier kan justeres ved hjælp af knapperne "pil op" eller "ned" ved siden af tallene for hvert kriterium, afhængigt af flow flowcytometri erhvervelse software23.

Figure 2
Figur 2: eksempel på flow forskellige loader indstillinger. Loader indstillinger skal optimeres for hvert assay, der er udviklet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Oprette en Flowcytometret analyse/porte/plots som vist i figur 3.
    Bemærk: Porten oprettelse og ansøgning kan variere for hver flow flowcytometri software23.

Figure 3
Figur 3: Flow flowcytometri gating strategi. Jurkat celler blev adskilt fra de samlede begivenheder og indsamlet af plotte forward scatter (FSC) vs side-scatter (SSC) kanaler og tegne en gate omkring målgruppen. Housecoats (enkelt celler) blev adskilt fra dubletter eller større celle aggregater benytter FSC-området (FSC-A) og FSC højde (FSC-H) kanaler. Levende celler blev valgt af gating på singlet celler for en levedygtighed pletten negativt. Median fluorescens intensitet (MFI) blev målt i enkelt, levende Jurkat celler og er afbildet som et histogram. MFI værdier af celler med narkotika optagelse blokeret (f.eks.HQC) og af celler med kontrol beløb af optagelsen skal vises (rød og blå, henholdsvis). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Udelukke døde celler fra analysen og optage ca 10.000 begivenheder23.

8. dataanalyse

  1. Eksportere data (rå MFI) til analyse software (Se Tabel af materialer).
    Bemærk: Afhængigt af den analyse, behov, den følgende analyse af data kan udføres ved hjælp af analysesoftwaren.
  2. Beregne middelværdi MFI dublerede brønde (QCs og prøver) og variationskoefficienten (% CV) at vurdere udbredelsen variabiliteten af dubletter fra middelværdien.
    Equation 1
    Equation 2
    Equation 3
  3. For prøver og QCs, der blev screenet i analysen, beregne procent signal hæmning (% SI) i forhold til den gennemsnitlige MFI af den for QCs poolede matrix CC.
    Equation 4
  4. Hvis det er nødvendigt, beregne opsving nøgletal (RRs) for bekræftede QCs og prøver i forhold til de tilsvarende skærm værdier.
    Equation 5

Representative Results

På den første dag i metoden, en frossen alikvot af Jurkat celler blev optøet og forgyldt, og prøverne blev udarbejdet. Figur 1 viser et eksempel plade kort. Den anden dag, blev prøverne blandet med Jurkat cellerne og inkuberes ved 37 ° C i ca 3 timer og 15 min. Cellerne blev derefter vaskes, fast med PFA og analyseret på en flow Flowcytometret. Figur 2 viser eksempel flow forskellige indstillinger.

Flowcytometri gating strategi var designet til at måle mængden af fluorophore-konjugeret stof i live single Jurkat celler24 (figur 3). Cellerne blev adskilt fra resterne af tegning en gate, der udelukker celleaffald [normalt, lav forward scatter (FSC)] og døde celler [normalt høje side scatter (SSC)], forlader kun levende celler for analyse25. Enkelt celler blev derefter adskilt fra celle klynger ved at tegne en gate, som udelukker området høj FSC og lav FSC højde26. Cellerne blev behandlet med en levedygtighed plet, der mærket nogen døde eller usund celler uden en intakt membran, og en yderligere gate blev oprettet for at udelukke de døde celler22. MFI live enkelt celler blev brugt til analyse af fluorophore-konjugeret ERT optagelse. Som et eksempel på potentialet screening assay resultater, hæmmede matrix tilsat en stor mængde af surrogat anti-drug antistof positiv kontrol [f.eks.høj kvalitet kontrol (HQC)] fluorophore-konjugeret ERT optagelse, hvilket resulterer i en lav MFI af ca 300 (figur 3). Derimod cellerne inkuberes med matrix i mangel af antistof positiv kontrol bør have en højere MFI (MFI = 37,830 i figur 3), viser udbredelsen af den fluorophore-konjugeret ERT.

Den neutralisere positive kontrol antistof til eksemplet her blev valgt baseret på virkningsmekanisme af narkotika (dvs., ERT optagelsen gennem CI-M6PR). Et panel af fluorophores blev også testet og sammenlignet for optimal assay følsomhed og dynamikområde1. CypHer 5e blev testet på grund af dets øgede fluorescens på en sur pH-værdi, som kunne være relevante for nogle ERTs som en supplerende foranstaltning af lysosomale målretning narkotika27. En grøn fluorescerende farvestof (fx Alexa Fluor 488), og en far-red fluorescerende farvestof (fxAlexa Fluor 647) blev også undersøgt. Et eksempel på, hvordan forskellige fluorophores kan udføre er præsenteret i figur 4a og 4b. I eksemplet med havde Alexa Fluor 647 ERT den bedste ydeevne på grund af sin overlegne følsomhed (f.eks., den højeste % SI i den laveste koncentration på PC) og bredt dynamikområde (~ 3 ordrer størrelsesorden).

Figure 4
Figur 4: eksempel resultater fra forskellige fluorophore-ERT konjugater. (A) under assay udvikling, en positiv kontrol (PC) fortynding kurve bør evalueres ved hjælp af forskellige fluorophore-konjugeret ERTs. I eksemplet vist her, to fluorophore-konjugeret ERTs (Alexa Fluor 488 og CypHer 5e) på 6,25 µg/mL og en lysere fluorophore-konjugeret ERT (Alexa Fluor 647) på 1,56 µg/mL blev testet i stigende koncentrationer af positiv-kontrol Nimb. (B) dette panel viser kurver fra panelet A grafen, ved hjælp af MFI for at vise den betydelige stigning i det dynamiske område ved hjælp af en Alexa Fluor 647-konjugeret ERT. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den beskrevne metode er en differentieret tilgang til påvisning, bekræftelse og interpolering en kvasi kvantitative niveau af NAb titer3. For at etablere analysen er klar til validering, de parametre, herunder assay følsomhed, præcision, selektivitet, specificitet, drug tolerance, robusthed, og opskåret point bør evalueres i henhold til etablerede vejledninger1,3 .

Prøver blev betragtet som potentielt positive i denne analyse, når % SI værdier større end screening cut point (SCP) blev opnået. Komitéen blev fastsat statistisk test narkotika-naive prøver fra en repræsentativ befolkning og måle en relative fald i signal intensitet (SI)3. Vejledning (for eksempel af FDA) anbefaler at SCP er etableret på de 95th percentilen af den normalt distribuerede datasæt, og metoder til beregning af SCP er blevet beskrevet udførligt andetsteds1. Enhver proeve, der faldt assay-signal (målt som en stigning i % SI) på eller over komitéen var fast besluttet på at være potentielt positive, og prøver med resultater, der er højere end SCP (uden ændre eller fald i % SI) betragtes som negative.

Prøver, der screenet positiv (% SI over SCP) blev testet i bekræftende analysen til at bestemme specificiteten af Nimb til ERT. Den bekræftende analyse blev udført af pre inkubere prøver med ERT-konjugeret magnetiske perler fjerne stof-specifikke antistoffer eller hæmmende faktorer. RR (forholdet mellem genfremsatte MFI at screening MFI) blev evalueret for at afgøre antallet af Nimb fjernet fra prøven. En højere end den beregnede positivitet [dvs.de genfremsatte cut point (CCP)] RR angivet tilstedeværelsen af anti-drug Nimb. Som i analysen screening bør det kinesiske Kommunistpartis første fastlægges af evaluering behandling-naive prøver fra en repræsentativ befolkning i den bekræftende analyse. CCP var baseret på en statistisk set beslutsomme 1% falsk positive rate og var tærsklen udpege et positivt bekræftet prøve (figur 5)3.

Prøver, der screenes og bekræftet positivt var seriefremstillede fortyndet og testet i titer analysen til at fastslå det relative niveau eller titer på Nimb i hver prøve. Den højeste fortynding, som en stikprøve tester positive, når det krydsede en udpegede tærsklen [fx titer cut point (TCP)] er prøven titer (figur 5)1,3.

Figure 5
Figur 5: eksempel prøve testresultater. Disse paneler viser eksempler på prøver, der testede positiv eller negativ ved screening enten over eller under en SCP 17.51% SI. Positive prøver blev derefter testet i den bekræftende analyse ved hjælp af narkotika-konjugeret magnetiske perler til nedbryder det stof-specifikke antistof fra prøverne før prøvningen i analysen. Prøver med et opsving forholdet (RR) er større end den konfirmatoriske cut point (dvs., RR = 1.315) blev anset for at være bekræftet positivt. Prøver, der bekræftede positive blev fortyndet indtil signalet krydsede titer cut point (TCP) at etablere titer (fortyndingsfaktoren) hvor prøven resultatet er lig med titer cut point. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Assay repeterbarhed og variabilitet blev testet over flere dage og med mere end én analytiker. QCs blev oprindeligt udarbejdet i én batch og sub-aliquoted til 1 x brug. I løbet af 3 d udføres to analytikere assay med flere sæt af QCs at demonstrere præcision af analysen. I viste eksempeldata % CV af inter - og intra-assay præcisionen for QCs er mindre end FDA vejledning anbefaling af % CV < 20% (figur 6)1.

Figure 6
Figur 6: eksempel på QC precision data genereret over tre dage med to analytikere. Præcisionsdataene blev beregnet ved en variansanalyse (ANOVA) ved hjælp af formlen i DeSilva et al. 28. intra-batch (inden for løber) og indbyrdes parti (mellem kørsler) statistik rapporteres som % CV. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Neutraliserende antistoffer eller andre faktorer, der forhindrer ERT optagelsen gennem CI-M6PR har potentiale til at påvirke ERT sikkerheds- eller effektivitetshensyn1. Det er derfor vigtigt at vurdere Nimb i emnet prøver ved hjælp af en robust model relevante at lægemidlets virkningsmekanisme. Vi og andre har fundet, at ikke justerer resultaterne af nogle bioassay formater (f.eks., receptor dimerization, luciferase udtryk, etc.) med sundhed myndighed anbefalinger for assay præcision, reproducerbarhed og følsomhed 29. i bioassay-metoden beskrevet her, Jurkat celler, der udtrykker endogene CI-M6PR er ansat til at overvåge NAbs specifikke for lysosomale ERT optagelsen. Kombineret med en flow flowcytometri udlæsning, bruger dette assay en fysiologisk celle model med egner sig analysen præcision, følsomhed, reproducerbarhed og høj sample overførselshastighed. NAb detection med et flow flowcytometri udlæsning er også blevet anvendt til andre indikationer. For eksempel er metoder blevet udviklet for at påvise eksisterende antistoffer imod hepatitis E og adeno-associeret virus (AAV)30,31.

Kritiske trin i protokollen omfatter at vælge et passende fluorophore, indarbejde en LQC at skærme assay følsomhed, at sikre et tilstrækkeligt niveau af cellernes levedygtighed, og opretholde streng overholdelse af inkuberingstider. I eksemplet præsenteres her, fluorophores (f.eks., Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 og CypHer 5e), konjugeret med et lysosomale ERT, varierede meget i deres ydeevne. Alexa Fluor 647, som også var den klogeste fluorophore testet32, blev udvalgt til yderligere analyse udvikling. Vi anbefaler, at flere fluorophores evalueres tidligt i udviklingen af analysen at give den bedste følsomhed og dynamikområde. Assay følsomhed under stikprøvekontrol bør overvåges ved at inkludere en LQC, der er tæt nok til den følsomhed grænse, at det vil mislykkes i 1% af den test kører1. Sammen med HQC fungerer LQC også som et system egnethed QC at overvåge assay drift over tid3. Optimale cellernes levedygtighed og ydeevne opnås ved at forberede en celle bank af engangsbrug delprøver og kvalificerende i nye cellebanker baseret på sammenlignelige QC resultater3,18. Celle og fluorophore-konjugeret drug inkuberingstider er også centrale for en konsekvent assay ydeevne, da stof optagelsen stiger med mængden af tid, stoffet er inkuberes med celler. Eksempeldataene kan for at minimere den daglige variation i stof optagelse, normaliseres poolede matrix kontrolprøver på hver plade (fx, opskåret point kontrolprøver i metoden ovenfor). En anden vigtig faktor i at producere konsekvent data med denne metode er at overvåge plade ensartethed og minimere mulige kant effekter. En indledende forsøg kan omfatte udfører analysen ved hjælp af en enkelt QC på tværs af hele pladen, mens mere robust eksperimenter kan udføres under assay validering (fx, præcision og nøjagtighed)1. Dette viser betydningen af plade kort layout33. Som vist i eksemplet plade kort, placeret kvalitetskontrol prøver på begge sider af pladen skærm en ensartethed, som kan spores over tid med Levey-Jennings diagrammer34.

Mens dette assay overvåger Nimb og andre faktorer, der kan hæmme lysosomale ERT optagelse, kan yderligere forsøg foretages for at bekræfte en optagelse hæmning på grund af antistoffer. En mulighed er at behandle prøver med protein A/G/L, som ikke-specifikt binder immunoglobulin35. Hvis prøver fortsætte med at teste positiv efter protein A/G/L udtynding, kan en ikke-antistof hæmmende faktor være ansvarlig for at blokere for drug optagelsen. Metoden beskrevet her var designet til at måle antistof-medieret optagelse hæmning, og den positive kontrol og andre assay parametre bør revurderes, hvis en høj procentdel af emnet prøver med ikke-antistof hæmmende faktorer er fundet.

Analysen kan også karakteriseres yderligere for at vise fluorophore-mærket lægemiddel trafikker til den passende cellulære rum baseret på lægemidlets virkningsmekanisme. I eksemplet præsenteres her, er en ERT forventes at binde CI-M6PR på celleoverfladen og trafik det til lysosomet. Vi tidligere rapporteret resultaterne af flere forsøg, som viser, at næsten alle de fluorescerende signal observeret i metode resultaterne fra fluorophore-mærket ERT i lysosomet8. Vi fandt, at fluorophore-mærket ERT signal blev elimineret efter en behandling af celler med cytochalasin B, som forstyrrer internalisering gennem hæmning af actin reorganisering. Eksperimenter, der slukkes eksterne fluorophore med trypan blå, eller bremset internalisering ved at placere celler ved 4 ° C, viser også, at den fluorophore-mærket ERT er hurtigt internaliseret og meget lidt Fluorescens er en ERT bundet på cellens overflade. Lysosomale målretning blev bekræftet ved at visualisere Co lokaliseringen af pH-følsom lysotracker farvning med fluorophore-konjugeret stoffet ved hjælp af Konfokal mikroskopi. En specificitet for optagelse gennem CI-M6PR kan også kontrolleres ved hjælp af eksogene M6P til at konkurrere med mærket narkotika for receptor binding. Lignende forsøg skal udføres for at kontrollere optagelse kinetik og cellulære lokalisering af fluorophore-konjugeret narkotika i andre assays.

Denne celle-baserede assay platform er blevet brugt til at studere NAbs for terapeutiske lægemidler, der udnytter CI-M6PR receptor-medieret endocytose. Vi har for nylig rapporteret resultater ved hjælp af denne analyse platform, som viste ingen korrelation mellem udviklingen af en NAb og medicin effektivitet for elosulfase alfa36,37. For at validere assay for klinisk prøve test, parametre, herunder assay følsomhed, præcision, selektivitet, specificitet, drug tolerance, robusthed, og cut point, bør vurderes efter etablerede vejledninger3, 4. det skal også bemærkes, for lysosomale ERTs, at Davids kan udvikle med potentiale til at blande sig med narkotika aktivitet gennem bindende nær enzym katalytiske site. Generelt skal overveje vi at overvåge denne type af NAb er af en lavere prioritet, da lysosomet barske sure og proteolytiske miljøet ikke er gunstig til antistof-ERT interaktioner2,39,40. Det er imidlertid muligt, at proteolytiske-resistente NAbs findes og kan hæmme den katalytiske del af et stof40. Denne assay skærme fluorophore-mærket ERT optagelse til uspecifikke, og en begrænsning af analysen er den manglende evne til at overvåge proteolytiske-resistente Nimb. Hvis denne type af NAb er mistanke baseret på sikkerhed eller effektivitetsdata, bør en analyse, der overvåger ERT aktivitet udviklet og brugt til at teste prøver.

Vurdering af immunogenicitet er vigtig i forståelsen af virkningerne af Nimb vedrørende lægemiddelsikkerhed og effektivitet. Identifikation af Nimb i stand til at hæmme in vitro- drug optagelse via CI-M6PR giver mulighed for at forstå NAb aktivitet in vivo. Metoden præsenteres her udnytter en human cellelinie, der udtrykker CI-M6PR for at måle forstyrrelser af fluorophore-konjugeret lysosomale ERT cellulære optagelse. Denne metode er allerede blevet brugt til at overvåge NAbs for flere ERTs beregnet til behandling af opbevaring af lysosomale sygdomme. Denne analyse platform kan anvende andre metoder til at studere virkningerne af Nimb på biologiske lægemidler, der kræver en cellulær internalisering for deres rette funktion.

Disclosures

Forfatterne er medarbejdere og aktionærer i BioMarin Pharmaceutical Inc.

Acknowledgments

Forfatterne har ingen anerkendelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks Corning CLS430769
Round Bottom 96-well culture plates Thermo-Nunclon 163320
Sterile reagent reservoirs VistaLab 3054-1004
96 well white round bottom polystyrene microplate plate Corning 3605
96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips Corning 4408
Magnetic bead separator tube rack V&P Scientific, Inc VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3
DynaMag -2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
DynaMag -96 Side Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD Biosciences
BD High Throughput Sampler (HTS) BD Biosciences
BioRad TC20 Automated Cell Counter BioRad 1450103
Microplate Shaker VWR 12620-928
Galaxy MiniStar Microcentrifuge VWR C1413
tissue culture CO2 incubator Nuaire NU-4750
Biosafety cabinet Labcono Purifier Cell Logic +
Jurkat Cell Line ATCC TIB152™
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific A20173
Dynabeads M270 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 65306
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21343
RPMI-1640 1x Medium Life Technologies A10491-01-500mL
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC 30-2020
Pen-Strep (100x) liquid formulation Corning 30-002-CI
1x DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
4% Para-formaldehyde Electron Microscopy Science 15735-85
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Life Technologies L34955
Tween 20 Sigma P1379-100mL
Bovine Serum Albumin Sigma 3059
Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) Bioreclamation IVT request a quote from website
VWR Polyester Plate Film VWR 60941
Seal & Sample Aluminum Foil Beckman Coulter 538619

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDER. Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , FDA Guidance for Industry. (2016).
  2. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).
  3. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).
  4. Pedras, A. NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays. BEBPA Forum. , (2015).
  5. Stovold, C. NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow. Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).
  6. Kromminga, A. Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , IPM Biotech. (2013).
  7. Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).
  8. Melton, A. C., et al. Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome. Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).
  9. U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , ICH. (2012).
  10. Lee, K., et al. A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease. Glycobiology. 13, 305-313 (2003).
  11. Kirkegaard, T. Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases. Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).
  12. Miller, J. M., et al. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report. , Available from: https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm 1-101 (2012).
  13. Invitrogen by ThermoFisher Scientific. Dynabeads M-270 Streptavidin. , (2015).
  14. European Medicines Agency. Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , European Medicines Agency. (2017).
  15. ThermoFisher Scientific. Molecular Probes Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).
  16. JoVE Science Education Database. An Introduction to Working in the Hood. Journal of Visualized Experiments. , General Laboratory Techniques (2018).
  17. Invitrogen and Gibco. Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific Inc. (2010).
  18. Coecke, S., et al. Guidance on Good Cell Culture Practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).
  19. ThermoFisher Scientific. Introduction to Cell Culture. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html (2018).
  20. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Journal of Visualized Experiments. , Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  21. Bio-Rad Laboratories. Counting Cells with Bio-Rad's TC20(TM) Automated Cell Counter. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M (2012).
  22. ThermoFisher Scientific. User Guide LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).
  23. Biosciences. Getting Started with BD FACSDiva Software. , BD Biosciences. (2007).
  24. Biosciences. BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).
  25. Quirke, P. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide. Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).
  26. Bio-Rad Laboratoratories. A guide to gating in flow cytometry. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html (2016).
  27. Minor, L. K. Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
  28. Desilva, B., et al. Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules. Pharmaceutical Research. 20, (2003).
  29. Hu, J., et al. Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins. Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).
  30. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Scientific Reports. 6, (2016).
  31. Charles River. A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors. Charles River Researcher. , (2015).
  32. Biosciences. BD Biosciences Relative Fluorochrome Brightness. BD Biosciences. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/us/applications/research/multicolor-flow/m/745795/overview 16181 (2014).
  33. Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays. MethodsX. 4, 153-165 (2017).
  34. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).
  35. Thermo Fisher Scientific. Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).
  36. Long, B., et al. Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study. Clinical Therapeutics. 39, (2017).
  37. Schweighardt, B., et al. Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial. Clinical Therapeutics. 37, (2015).
  38. Schneider, Z. Importance of isoelectric point (pI) of antibodies. Antibody Society. , Available from: http://www.antibodysociety.org/importance-isoelectric-point-pi-antibodies/ (2017).
  39. Mellman, I. R. A., Plutner, H. Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes. The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).
  40. Wang, J., et al. Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment. Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).

Tags

Immunologi og infektion sag 139 Neutralizing antistof assay lysosomale opbevaring sygdom enzym substitutionsbehandling flowcytometri celle-baserede assays assay udvikling og validering
Påvisning af antistoffer, som neutraliserer den cellulære optagelse af enzymet udskiftning behandlingsformer med en celle-baseret analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheung, R., deHart, G. W., Jesaitis, … More

Cheung, R., deHart, G. W., Jesaitis, L., Zoog, S. J., Melton, A. C. Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay. J. Vis. Exp. (139), e57777, doi:10.3791/57777 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter