Summary
Qui presentiamo un metodo di cytometry di flusso basato su cellulare per rilevare anticorpi neutralizzanti o altri fattori che interferiscono con l'assorbimento cellulare di terapie sostitutive enzima in una matrice umana, come un liquido spinale cerebrale (CSF) o siero umano.
Abstract
La somministrazione di terapie sostitutive di enzima (ERTs) e altre terapie biologiche ai pazienti possono suscitare una risposta immunitaria anti-droga. La caratterizzazione di questi anticorpi anti-droga (ADA), in particolare quelli che possono neutralizzare l'attività biologica della droga, chiamata anticorpi neutralizzanti (NAbs), è cruciale nella comprensione degli effetti di questi anticorpi sulla droga profilo farmacologico. Questo protocollo descrive un metodo di citometria a flusso basati su cellule per rilevare i fattori che neutralizzano l'assorbimento cellulare di un rappresentante di ERT lisosomiale in matrice umana. Il protocollo è costituito da tre procedure: screening, un passaggio di conferma e le analisi di titolo per rilevare, identificare e stabilire il livello relativo di neutralizzazione anticorpale nei campioni di soggetto.
In questo metodo, i campioni sono prima mescolati con il prodotto ERT fluorophore-coniugato, quindi incubati con [ad es., i linfociti T umani (cellule di Jurkat)] le cellule che esprimono un recettore di superficie cellulare indipendenti del catione mannosio 6-fosfato (CI-M6PR), e Infine, analizzati con un citometro a flusso. Un campione senza NAbs determinerà l'assorbimento del fluorophore-coniugato ERT prodotto via CI-M6PR, mentre, la presenza di NAbs si legano alla droga e interferire con l'associazione di CI-M6PR e l'assorbimento. La quantità di coniugato fluoroforo ERT interiorizzata dalle cellule Jurkat è misurata da citometria a flusso e valutata come l'inibizione del segnale di percentuale (%) rispetto alla risposta ottenuta in presenza di una matrice rappresentativa droga-ingenuo. Nel passaggio conferma, i campioni sono pre-incubati con biglie magnetiche ERT-coniugati per vuotare i fattori farmaco-specifici che si legano alla droga (ad esempio NAbs) prima di un'incubazione con le cellule. Campioni che dello schermo e la confermano positiva per droga-specific NAbs nell'analisi sono quindi diluiti in serie per generare un titolo anticorpale. I titoli dell'anticorpo semi-quantitativa possono essere correlati con le misure di sicurezza dei farmaci e l'efficacia.
Introduction
Valutazione di immunogenicità è una parte importante della sicurezza e dell'efficacia di monitoraggio programma per qualsiasi prodotto terapeutico biologico, compresi ERTs. I pazienti possono sviluppare una risposta immunitaria che possono influire direttamente sulla sicurezza dei farmaci, efficacia e farmacocinetica/farmacodinamica profili. Un sottoinsieme di questi ADA, chiamato Navarro, può inibire l'efficacia ERT in due modi: attraverso l'inibizione dell'assorbimento ERT nella cella mirata o inibendo l'attività catalitica di ERT. Il metodo presentato qui è progettato per misurare NAbs che interferiscono con l'assorbimento ERT nelle cellule. Per controllare completamente la sicurezza e l'efficacia di ERT terapeutica, monitoraggio continuo di Nefertari è cruciale nel delucidamento eventuali potenziali correlazioni con i risultati clinici o effetti farmacodinamici1.
Piattaforme di valutazione NAbs contro terapie proteiche includono attività enzimatica, basati su cellule e ligand-legantesi saggi1. La piattaforma di analisi ottimale viene selezionata in base a una serie di criteri: il meccanismo di azione del prodotto terapeutico, la sensibilità di piattaforma di analisi, selettività, precisione e soprattutto, sua capacità di imitare l'azione inibitoria del NAbs in vivo . Ligand-legantesi saggi possono essere opportuno in alcuni casi (ad esempio, quando una riga di celle rilevanti non può essere identificata o se la sensibilità appropriata non può essere raggiunto in un'analisi basata su celle). Tuttavia, nel draft 2016 linee guida FDA per industria documento e altri white paper accettati dal settore, basati su cellule NAb saggi sono raccomandati perché essi possono meglio riflettere il meccanismo biologico del farmaco in vivo1,2 , 3.
I componenti critici per lo sviluppo di un'analisi di NAb basati su celle di flusso cytometry includono una linea cellulare adeguata che risponde alla stimolazione di droga, un surrogato positiva-controllo NAb che neutralizza l'ERT, un fluoroforo-coniugato ERT e la specie in esame biologica matrice4,5,6. La selezione di riga della cella è dipenda sul meccanismo di azione ERT e linee cellulari multiple devono essere valutate nel corso del test sviluppo3. Nel metodo descritto qui, le cellule di T di Jurkat umane sono state selezionate per la loro espressione endogena di CI-M6PR sulla superficie delle cellule e la mancanza di recettori di frammento di anticorpo (FCR) che legano indiscriminatamente la regione Fc di più anticorpi7,8 . Durante lo sviluppo di analisi, è importante stabilire un controllo negativo per gli studi di convalida e campione di prova, come siero riunito da individui che non sono stati trattati con la prova articolo1. Linee cellulari dovrebbero anche tollerare pertinenti matrici da specie diverse per la continuità tra le fasi non clinici, cliniche e dopo la commercializzazione del farmaco sviluppo1. Un altro componente è la selezione del controllo positivo del dosaggio. Il controllo positivo per l'analisi di assorbimento delle cellule ERT è stato scelto in base alla sua capacità di legare il terapeutico e neutralizzare l'assorbimento attraverso CI-M6PR9,1. Spesso è difficile ottenere gli importi utili o sostenibili di antisieri neutralizzanti da soggetti umani per uso come un controllo di dosaggio, soprattutto in popolazioni di pazienti di malattia rara2. Alternative includono antisieri da animali immunizzati iper o purificato per affinità policlonali o monoclonali anticorpi a spillo nel dosaggio pertinenti matrice1. Durante l'utilizzo di una matrice specie-specifica, è possibile che fattori inibitori diversi anticorpi presenti nella matrice possono inibire l'assorbimento ERT. Un altro componente fondamentale del dosaggio è la ERT fluorophore-coniugati. La selezione del fluoroforo per la coniugazione di ERT dovrebbe essere valutata per ogni ERT, basato sul bisogno del dosaggio per luminosità, stabilità del pH e potenziale sovrapposizione spettrale in altri canali sul citofluorimetro.
Il test descritto qui è un esempio per la misurazione di un NAb a proteina terapeutica, ad esempio un ERT, che entra la cella via CI-M6PR. ERTs diversi, destinati a trattare i disordini da accumulo lisosomiale (LSD), utilizzare questo percorso per uptake cellulare e lisosomiale targeting, tra cui alfa elosulfase per la sindrome di Morquio A, cerliponase alfa per la malattia di Batten CLN2, agalsidasi alfa per la malattia di Fabry, e alglucosidasi alfa per Pompe malattia10,11. Lo scopo di questo metodo è quello di misurare i livelli relativi di Nefertari che interferiscono con la droga associazione e interiorizzazione via CI-M6PR. Questa operazione viene eseguita su più livelli dello screening, conferma, e titolo i passi3. Campioni sono proiettati per NAb positività e poi confermati positivi nel passaggio conferma. Infine, campioni che dello schermo e la confermano positiva possono essere diluiti in serie per generare un anticorpo titolo1. Questa analisi di assorbimento del farmaco citometria a flusso basati su cellule fornisce un metodo sensibile e meccanicistico pertinenti in vitro di misurazione NAbs sostanze specifiche che possono influenzare il profilo farmacologico di un farmaco. Abbiamo tradotto il metodo validato e testato campioni clinici utilizzando questa piattaforma per il farmaco elosulfase alfa8. Qui descriviamo il protocollo dettagliato passo-passo che può essere applicato ad altre proteine terapeutiche o ERTs.
Protocol
Matrici umani sono stati acquistati da fonti commerciali con approvazione da loro Institutional Review Board (IRB) ma devono essere trattati come potenzialmente infettivi. Assicurarsi che l'ambiente di laboratorio utilizzato mantiene una cultura di sicurezza12.
1. prima di iniziare l'analisi
- Preparare la streptavidina coniugata ERT biglie magnetiche secondo istruzioni13 del produttore.
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Preparare i campioni per il controllo qualità (QCs): spike un anticorpo di controllo positivo (PC) (ad es., un NAb) nella matrice specie-specifico (ad es., pool CSF o siero).
Nota: Guida FDA ed EMA consiglia di preparare un alto e un basso QC per la validazione di test e test1,14di routine.- Ad esempio, per ottenere un QC a 10 µ g/mL, aggiungere 10 µ l di controllo positivo dello stock di 1 mg/mL in 990 µ l della matrice pertinente (ad es., CSF) per un volume totale di 1.000 µ l.
- Aliquotare i campioni QC in un volume adatto per un singolo utilizzano (ad esempio, 50 µ l) e congelare le aliquote a -60 a-80 ° C1.
- Aliquotare un taglio-punto-controllo (CC), specie-matrice non trattati con l'articolo di prova (ad esempio, in pool CSF o siero) per un singolo utilizzo (ad es., 50 µ l) e congelare le aliquote a -60 a-80 ° C1.
- Eseguire una reazione di coniugazione tra il fluoroforo ed ERT utilizzando un contrassegno della proteina kit secondo protocollo15 del produttore. Aliquotare il campione in un volume adatto per un singolo utilizzare (ad esempio, 50 µ l) e congelare le aliquote a -60 a-80 ° C.
2. giorno 1: Cella placcatura e preparazione del campione
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Preparazione delle cellule
- Utilizzare una cappa di coltura del tessuto e mantenere un ambiente asettico per le fasi successive. Spruzzare ogni oggetto che verrà inserito nella cappa con etanolo al 70% e manutenzione un ambiente pulito16,17,18.
- Riscaldare il medium di crescita cellulare (ad es., RPMI-1640 con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina-streptomicina) in un bagno di acqua o perlina a 37 ° C19.
- Cellule di Jurkat linfociti totali T umani e piastra 100 µ l per pozzetto a 7,5 x 105 cellule/mL in un turno di 96 pozzetti-fondo cella piastra di coltura appropriato per l'utilizzo su un citometro a flusso dotato di un caricatore di piastra.
- Ad esempio, utilizzare un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato per contare le celle20,21.
- Garantire che le cellule hanno almeno il 70% redditività prima di procedere con l'esperimento (ad esempio, valutare la vitalità con la macchiatura blu di trypan)17.
- Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO2 e 95% di umidità durante la notte per 14 – 20 h.
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Preparazione del campione di screening
- Diluire il soggetto o l'analisi di campioni di controllo utilizzando mezzi di comunicazione privo di siero (ad es., RPMI-1640). Nel metodo di esempio qui, diluire i campioni 1: 2,5 in RPMI-1640 aggiungendo 60 µ l del campione a 90 µ l di terreni privi di siero. (ad es., striscia di 8 tubi). Procedere al punto 3.1 per la procedura di dosaggio preparare un fluoroforo ERT.
Nota: La diluizione di 1: 2.5 è stata determinata sperimentalmente ed è ottima per il metodo presentato qui. Diluizioni del campione ottimale devono essere determinate per ogni metodo che si è sviluppato.
- Diluire il soggetto o l'analisi di campioni di controllo utilizzando mezzi di comunicazione privo di siero (ad es., RPMI-1640). Nel metodo di esempio qui, diluire i campioni 1: 2,5 in RPMI-1640 aggiungendo 60 µ l del campione a 90 µ l di terreni privi di siero. (ad es., striscia di 8 tubi). Procedere al punto 3.1 per la procedura di dosaggio preparare un fluoroforo ERT.
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Conferma della perla e preparazione di campioni
- Calcolare il numero di perline ERT-coniugato necessaria per i campioni di conferma.
- Per esempio, per 10 campioni, utilizzare 10 campioni x 100 µ l di coniugato ERT perline per esempio + 30% extra per compensare eventuali perdite durante la fase di lavaggio = 1.300 µ l di coniugato ERT perline.
- Vortice le perline accuratamente. Aggiungere il numero calcolato di perline di una provetta conica da 15 mL per il lavaggio.
- Lavare i branelli magnetici ERT-coniugati aggiungendo 1.300 µ l di tampone di accoppiamento o come suggerito dal produttore (ad es., con tampone fosfato salino con 0,1% polisorbato 20) seguendo i passi qui sotto13.
- Vortice del tubo accuratamente. Posizionare il tubo in una cremagliera del tubo magnetico per 2 min. Senza disturbare le perline, attentamente aspirare e scartare il surnatante.
Nota: La soluzione si trasformerà da marrone scuro a chiaro quando perline sono tirati dal magnete. - Risospendere le perline con 1.300 µ l di tampone di accoppiamento. Ripetere i passaggi di lavaggio per un totale di quattro lavaggi.
- Dopo il lavaggio finale, è necessario sospendere le perline in 1.300 µ l di tampone (calcolati in precedenza nel passaggio 2.3.1.1) di accoppiamento. Aggiungere 100 µ l per bene a 96 pozzetti, bianca, rotonda-parte inferiore, il piatto in polipropilene vincolanti secondo la mappa di piastra (per esempio, una conferma, anche a campione o QC; la volontà di campione suddiviso in duplicati quando incubati con ERT fluoroforo).
- Collocare la piastra su un magnete di lato-minigonna di 96 pozzetti e consentire le perline formare una pallina. Attentamente, aspirare il supernatante chiaro ed eliminarlo.
Nota: La soluzione diventerà da scuro al marrone chiaro dopo circa 1 – 2 min sul magnete Minigonna laterale. Le perle ottenute sono chiamate le perle "a secco". - Se i campioni sottoposti a screening positivi e sono sia confermati, aggiungere 100 µ l di ciascun campione con e senza perle ERT-coniugati in caso/assegnate. Sigillare la piastra con una pellicola di plastica e agitare per almeno 60 minuti su un agitatore rotante a circa 800 giri/min a temperatura ambiente (TA).
Nota: Precedentemente preparato e congelato positivi e negativi QCs e la CC devono essere inclusi in ogni piatto. - Dopo l'incubazione, posizionare la piastra conferma sul magnete minigonna lato 96 pozzetti e consentire le perline formare una pallina.
- Calcolare il numero di perline ERT-coniugato necessaria per i campioni di conferma.
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Preparazione di titolo diluizione serie
- Per preparare una serie di titolo, in serie di diluire il campione nella matrice riunito un numero sufficiente di volte per attraversare il titolo predeterminato taglio punto1.
- Per esempio, mix 30 µ l del campione a 60 µ l di matrice aggregata in una serie di diluizione di 1:3 per un totale di 8 diluizioni (ad es., striscia di 8 tubi). Procedere al punto 3.1 per la procedura di dosaggio preparare fluoroforo ERT.
3. giorno 1: Procedura di dosaggio
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Preparare il fluoroforo ERT nel medium privo di siero (ad es., 60 µ l per pozzetto, o circa 6 mL/piastra).
- Ad esempio, per preparare 10 mL di 1 µ g/mL fluoroforo ERT, aggiungere 10 µ l di 1 mg/mL stock fluoroforo ERT a 9,99 mL di siero-free media (ad es., RPMI-1640).
- In un'incubazione di nuova piastra (ad es., lastra in polipropilene 96 pozzetti, bianco, fondo tondo, non vincolante), aggiungere i campioni preparati da passo 2.2, 2.3, o 2.4 e un fluoroforo ERT in una miscela 1:1 in pozzetti duplicati (ad es., trasferimento 60 µ l di ogni preparato campione e aggiungere 60 µ l della ERT fluoroforo per pozzetto).
Nota: Un esempio di mappatura per piastra esperimento è fornito nella Figura 1.
Figura 1: esempio di esperimento piastra layout. Campioni e un fluoroforo ERT sono state incubate overnight a 2 – 8 ° C. Controlli quali controllo di alta qualità (HQC), bassa qualità (LQC) e controllo di qualità negativo (NQC) sono stati proiettati e confermati su angoli opposti della piastra per valutare l'uniformità di piastra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Mescolare i campioni e il fluoroforo ERT pipettando su e giù più volte con una pipetta multicanale. Avvolgere le piastre nell'estruso e incubare per loro una notte a 2 – 8 ° C per 14 – 20 h.
4. giorno 2: Aggiungere i campioni preparati alle cellule
- Rimuovere le piastre di incubazione del campione dall'incubazione a 2 – 8 ° C e riscaldare le piastre inserendoli in un bagno di perle a 37 ° C per 10 – 15 min.
- Rimuovere le celle dall'incubatrice di CO2 . Effettuare un controllo visivo delle cellule placcate utilizzando un microscopio invertito per assicurare che le cellule appaiono sani e uniformemente distribuito attraverso i pozzi17,19.
- Aggiungere 100 µ l dei campioni precedentemente misti ed ERT fluoroforo ad una piastra di cella secondo la mappa di piastra sperimentale.
- Inserire nuovamente la piastra delle cellule con i campioni aggiunto CO2 incubatore a 37 ° C. Incubare la piastra per 3 h e ± 15 min.
Nota: Questa volta nasce in laboratorio come ottimale per la risposta di segnale-rumore nel dosaggio. - Centrifugare la piastra di cella per 6 min a 320 x g in una centrifuga da tavolo 14 – 18 ° c. Confermare la presenza di un pellet cellulare in fondo i pozzetti della piastra.
- Tenere la piastra ad un angolo di 30 – 45°. Rimuovere attentamente il surnatante da ogni pozzetto senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere 200 µ l di 1 x DPBS sul pellet cellulare in ogni pozzetto per risospendere le cellule.
- Ripetere la cella fasi per un totale di 3 lavaggi di lavaggio. Procedere immediatamente al passaggio 5 per la macchiatura di attuabilità delle cellule.
5. giorno 2: Cella vitalità colorazione
- Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 µ l di una soluzione di lavoro di macchia Live/Dead: 1x in ciascun pozzetto, selezionato per una lunghezza d'onda di emissione diversa da quella della ERT fluoroforo e preparati secondo istruzioni22 del produttore.
- Incubare la piastra per 15 min a RT nel buio. Centrifugare la piastra per 6 min a 320 x g in una centrifuga da tavolo 14 – 18 ° c.
- Rimuovere attentamente il surnatante da ogni pozzetto senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule 1 x con 1 x DPBS.
6. giorno 2: Fissaggio delle cellule con paraformaldeide 1%
- Usando una pipetta multicanale, dispensare 100 µ l di refrigerati (a 2 – 8 ° C) 1% paraformaldeide (PFA) in ciascun pozzetto.
- Sigillare le piastre e delicatamente impulso vortice per miscelare. Avvolgere la piastra il cartoccio e posizionarlo a 2 – 8 ° C per almeno 10 minuti per consentire la fissazione.
Nota: Fare attenzione per evitare gli schizzi sulla guarnizione del piatto. - Aggiungere 50 µ l di 1 x DPBS in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale su e giù prima dell'analisi.
7. flusso Cytometry
- Posizionare le piastre sul citofluorimetro con il caricatore di piastra e di eseguirli.
- Acquisire e registrare l'intensità della fluorescenza mediano misurato (MFI) utilizzando il software di citometria a flusso (Vedi Tabella materiali).
Nota: Vedere la Figura 2 come esempio per le impostazioni del caricatore. La portata del campione, volume di campione, volume, velocità di miscelazione e numero di miscele di miscelazione sono ottimizzati per questo test. Questi criteri possono essere regolati utilizzando i tasti "frecce up" o "giù" accanto ai numeri per ciascun criterio, a seconda del flusso cytometry acquisizione software23.
Figura 2: esempio delle impostazioni caricatore citometro a flusso. Le impostazioni del caricatore devono essere ottimizzate per ogni analisi che si sono sviluppato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Creare un citometro analisi/cancelli/trame come mostrato nella Figura 3.
Nota: La creazione del cancello e l'applicazione può variare per ogni flusso cytometry software23.
Figura 3: flusso cytometry strategia di gating. Cellule Jurkat sono state separate dagli eventi totali e raccolti tracciando i forward-scatter (FSC) vs side scatter (SSC) canali e disegnando un cancello intorno alla popolazione di destinazione. Canottiere (cellule singole) sono stati separati da doppietti o cellula più grande aggrega utilizzando l'area FSC (FSC-A) e FSC (FSC-altezza) canali. Cellule vive sono stati scelti da gating sulle cellule di singoletto negative per una macchia di attuabilità. L'intensità di fluorescenza media (MFI) è stata misurata in cellule Jurkat unica, vivere e viene tracciata come un istogramma. I valori MFI delle celle con l'assorbimento di droga bloccato (ad es., HQC) e delle cellule con controllo vengono visualizzati valori di assorbimento (rosso e blu, rispettivamente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Escludere le cellule morte dall'analisi e registrare circa 10.000 eventi23.
8. analisi dei dati
- Esportare i dati (crudo MFI) per il software di analisi (Vedi Tabella materiali).
Nota: A seconda l'analisi necessaria, la seguente analisi di dati può essere eseguita utilizzando software di analisi. - Calcolare la media delle IFM di pozzetti duplicati (QCs e campioni) e il coefficiente di variazione (% CV) per valutare la variabilità di diffusione dei duplicati dalla media.
- Per campioni e QCs che sono stati proiettati nell'analisi, calcolare la percentuale di segnale di inibizione (% SI) rispetto la media MFI della per la matrice aggregata di QCs CC.
- Se necessario, è possibile calcolare i rapporti di recupero (RRs) per il QCs e i campioni riguardante i corrispondenti valori di schermo confermato.
Representative Results
Il primo giorno del metodo, un'aliquota congelata di cellule Jurkat è stata scongelata e placcata, e sono stati preparati i campioni di prova. La figura 1 Mostra un esempio di mappatura per piastra. Il secondo giorno, i campioni sono stati mescolati con le cellule Jurkat e incubati a 37 ° C per circa 3 h e 15 min. Le cellule sono state poi lavate, fisso con PFA e analizzate su un citometro a flusso. La figura 2 Mostra esempio di flusso cytometer impostazioni.
Il flusso cytometry gating strategia è stato progettato per misurare la quantità di farmaco fluorophore-coniugati in diretta singolo Jurkat cells24 (Figura 3). Le cellule sono state separate dai detriti disegnando un cancello che esclude i detriti cellulari [solito, bassa dispersione avanti (FSC)] e le cellule morte [solitamente, high-side scatter (SSC)], lasciando solo le cellule vive per analisi25. Cellule singole sono stati quindi separate da aggregati di cellule disegnando un cancello che esclude l'alta zona FSC e il basso FSC altezza26. Le cellule sono state trattate con una macchia di vitalità che etichettati qualsiasi cellule morte o non sane senza una membrana intatta, e un ulteriore cancello è stato creato per escludere le cellule morte22. L'IFM di singole cellule vive è stato utilizzato per l'analisi dell'assorbimento ERT fluorophore-coniugati. Come un esempio di potenziale risultati di questo test di screening, la matrice a spillo con una quantità elevata di controllo positivo dell'anticorpo anti-droga di surrogato [ad es., controllo di qualità (HQC)] hanno inibito fluorophore-coniugato l'assorbimento ERT, risultante in un basso MFI di circa 300 (Figura 3). Al contrario, cellule incubate con la matrice in assenza dell'anticorpo positivo controllo dovrebbero avere un più alto MFI (MFI = 37.830 nella Figura 3), dimostrando l'assorbimento della ERT fluorophore-coniugati.
La neutralizzazione dell'anticorpo di controllo positivo per l'esempio qui è stato selezionato basato sul meccanismo di azione del farmaco (cioè, l'assorbimento ERT attraverso CI-M6PR). Un pannello di fluorofori è stato anche testato e confrontato per ottimale sensibilità e gamma dinamica1. 5e cypHer è stato testato a causa del suo aumento della fluorescenza a un pH acido, che potrebbero essere rilevanti per alcuni ERTs come misura aggiuntiva di targeting lysosomal della droga27. Un colorante fluorescente verde (ad es., Alexa Fluor 488) e un colorante fluorescente da' (ad es., Alexa Fluor 647) inoltre sono stati esaminati. Un esempio di come i diversi fluorofori potrebbe eseguire è presentato in Figura 4a e 4b. Nell'esempio, Alexa Fluor 647 ERT aveva le migliori prestazioni grazie alla sua sensibilità superiore (ad es., la più alta % SI alla concentrazione più bassa del PC) e l'ampia gamma dinamica (~ 3 ordini di grandezza).
Figura 4: esempio di risultati da diversi fluorophore-ERT coniugati. (A) durante lo sviluppo di analisi, una curva di diluizione del controllo positivo (PC) dovrebbe essere valutata utilizzando diversi ERTs fluorophore-coniugati. Nell'esempio mostrato qui, due fluorophore-coniugato ERTs (Alexa Fluor 488 e CypHer 5e) 6,25 µ g/ml e un più luminoso fluorophore-coniugato ERT (Alexa Fluor 647) 1,56 µ g/ml sono stati testati in presenza di concentrazioni crescenti del controllo positivo NAbs. (B), questo pannello mostra le curve da pannello A rappresentati graficamente, utilizzando IFM per mostrare il significativo aumento della gamma dinamica utilizzando un ERT Alexa Fluor 647-coniugati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il metodo descritto è un approccio a più livelli per il rilevamento, confermando e interpolando un livello quasi-quantitativo di NAb titolo3. Per stabilire il dosaggio è pronto per la convalida, i parametri tra cui sensibilità, precisione, selettività, specificità, tolleranza al farmaco, robustezza, e i punti di taglio devono essere valutati secondo stabilito guidances1,3 .
I campioni sono stati considerati potenzialmente positivi con questo test quando % SI valori superiori a tagliata lo screening point (SCP) sono stati ottenuti. Il SCP è stato determinato statisticamente test droga-ingenuo campioni da una popolazione rappresentativa e misurando una diminuzione relativa nel segnale intensità (SI)3. Orientamento (per esempio della FDA) consiglia il SCP è stabilito presso il 95° percentile del set di dati distribuiti normalmente, e metodi per il calcolo il SCP sono stati descritti dettagliatamente altrove1. Qualsiasi campione che ha fatto diminuire il segnale di test (misurato come un aumento in % SI) o sopra il SCP è stato determinato per essere potenzialmente positivo e campioni con risultati superiori il SCP (senza modificare o ridurre in % SI) sono considerati negativi.
Campioni che proiettato positiva (% SI sopra il SCP) sono stati analizzati con il test conferma per determinare la specificità di Nefertari a ERT. L'analisi conferma è stata eseguita incubando pre-campioni con biglie magnetiche ERT-coniugati per rimuovere gli anticorpi farmaco-specifici o fattori inibitori. Il RR (il rapporto di conferma IFM IFM di screening) è stato valutato per determinare che il numero di NAbs rimosso dal campione. Un RR supera alla soglia calcolata di positività [vale a dire, il punto di taglio confermativo (CCP)] hanno indicato la presenza di anti-droga Navarro. Come test di screening, il CCP dovrebbe essere fondato valutando naïve al trattamento campioni da una popolazione rappresentativa nell'analisi di conferma. CCP si basava su un determinato statisticamente 1% tasso di falsi positivi ed era la soglia che designa un campione confermato positivamente (Figura 5)3.
Campioni che proiettato e confermato positivo in serie erano diluiti e analizzati con il test di titolo per determinare il livello relativo o titolo di Nefertari in ciascun campione. La diluizione più alta a cui un campione test positivo quando ha attraversato una soglia designata [ad esempio, il titolo tagliato punto (TCP)] è il campione titolo (Figura 5)1,3.
Figura 5: esempio sample test risultati. Questi pannelli mostrano esempi di campioni che testato positivo o negativo di screening sopra o sotto un SCP del 17,51% SI. Campioni positivi sono stati quindi analizzati con il test di conferma utilizzando biglie magnetiche coniugato di droga per vuotare l'anticorpo specifico per farmaco dai campioni prima del test nell'analisi. Campioni con un rapporto di recupero (RR) maggiore nel punto di taglio confermativo (cioè, RR = 1,315) sono stati considerati essere confermati positivi. Campioni che confermato positivo sono stati diluiti fino a quando il segnale oltrepassato il titolo punto (TCP) per stabilire il titolo (fattore di diluizione) a cui il risultato del campione è uguale il titolo punto di taglio di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Variabilità e ripetibilità di dosaggio sono stati testati per diversi giorni e con più di un analista. Il QCs erano inizialmente preparati in un unico batch e sub-aliquotati per 1 x uso. Nel corso di 3 d, due analisti eseguito il test con diversi set di QCs per dimostrare la precisione del dosaggio. Nei dati di esempio riportati, il CV % della precisione inter - e intra-saggio per il QCs sono meno di raccomandazione, della guida FDA del < 20% CV % (Figura 6)1.
Figura 6: esempio di QC precisione dati generati in tre giorni con due analisti. I dati di precisione sono stati calcolati da un'analisi della varianza (ANOVA), utilizzando la formula presentata in DeSilva et al. 28. il intra-batch (all'interno di piste) e Inter-batch (tra piste) statistiche vengono segnalate come % CV Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Anticorpi neutralizzanti o altri fattori che impediscono l'assorbimento ERT attraverso CI-M6PR hanno il potenziale di impatto ERT sicurezza o efficacia1. Pertanto, è importante valutare NAbs in campioni di soggetto utilizzando un modello affidabile di rilevante per il meccanismo della droga di azione. Noi ed altri abbiamo trovato che le prestazioni di alcuni formati di analisi biologica (ad es., la dimerizzazione del recettore, espressione di luciferase, ecc.) non si allineano con raccomandazioni di autorità di salute per dosaggio precisione, riproducibilità e sensibilità 29. nel metodo di analisi biologico descritto qui, le cellule Jurkat che esprimono endogena CI-M6PR sono impiegate per monitorare NAbs specifici per l'assorbimento ERT lisosomiale. Combinato con una lettura di citometria a flusso, questo saggio utilizza un modello fisiologico delle cellule con precisione dosaggio adatto, sensibilità, riproducibilità e campione alto throughput. NAb rilevamento con un flusso cytometry della lettura è stata applicata anche ad altre indicazioni. Ad esempio, sono stati sviluppati metodi per rilevare gli anticorpi preesistenti contro epatite E e virus adeno-associato (AAV)30,31.
Fasi critiche nel protocollo è inoltre possibile selezionare un fluoroforo adatto, che incorpora un LQC che monitor test sensibilità, assicurando un livello sufficiente di attuabilità delle cellule e mantenendo scrupolosamente i tempi di incubazione. Nell'esempio presentato qui, fluorofori (ad es., Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 e CypHer 5e), coniugata con una ERT lisosomiale, variato ampiamente nelle loro prestazioni. Alexa Fluor 647, che era anche il fluoroforo testato più brillanti32, è stato selezionato per ulteriore sviluppo di analisi. Suggeriamo che diversi fluorofori essere valutati molto presto nello sviluppo del dosaggio per fornire la migliore sensibilità e gamma dinamica. Sensibilità del test durante il test di esempio devono essere monitorati includendo un LQC che è abbastanza vicino al limite di sensibilità che non riuscirà a 1% del test viene eseguito1. Insieme con il HQC, il LQC funge anche da un'idoneità sistema QC per monitorare il dosaggio deriva nel tempo3. Prestazioni e vitalità cellulare ottimale si ottiene preparando una banca di cellule di aliquote monouso e qualificazione di nuove banche di cellule basate su paragonabile QC Risultati3,18. Cella e tempi di incubazione del coniugato fluoroforo droga sono anche centrali ad una prestazione di analisi coerente poiché l'assorbimento del farmaco aumenta con la quantità di tempo che il farmaco viene incubato con le cellule. Per ridurre al minimo quotidiano variabilità nell'assorbimento del farmaco, dati di esempio possono essere normalizzati in campioni di controllo matrice aggregata su ogni piatto (ad esempio, i campioni di controllo punto di taglio nel metodo precedente). Un altro fattore importante nella produzione di dati coerenti con questo metodo è quello di monitorare l'uniformità della piastra e ridurre al minimo i possibili effetti di bordo. Un esperimento iniziale può includere il dosaggio usando un singolo controllo di qualità attraverso l'intero piatto, mentre gli esperimenti più robusti possono essere eseguiti durante il test di convalida (ad es., precisione e accuratezza)1. Questo dimostra l'importanza della piastra mappa layout33. Come illustrato nell'esempio di mappa di piastra, controllo di qualità campioni posti su entrambi i lati del monitor piatto un'uniformità che possa essere monitorata nel tempo con Levey-Jennings grafici34.
Mentre questo test controlla Navarro e altri fattori che possono inibire l'assorbimento ERT lisosomiale, ulteriori esperimenti possono essere condotta per confermare un'inibizione di assorbimento dovuto gli anticorpi. È possibile trattare i campioni con la proteina A/G/L, che associa non specifico dell'immunoglobulina35. Se campioni continuano a test positivo dopo lo svuotamento A/G/L di proteina, un fattore inibitorio non-anticorpo può essere responsabile di bloccare l'assorbimento del farmaco. Il metodo qui descritto è stato progettato per misurare l'inibizione di assorbimento dell'anticorpo-mediato e il controllo positivo e altre analisi di parametri devono essere rivalutati se un'alta percentuale di campioni di soggetto con fattori inibitori non-anticorpo è trovata.
Il dosaggio può essere anche ulteriormente caratterizzato per dimostrare i traffici di droga con fluoroforo per il compartimento cellulare appropriato basato sul meccanismo di azione del farmaco. Nell'esempio presentato qui, un ERT dovrebbe associare CI-M6PR sulla superficie delle cellule e il traffico e per il lisosoma. Precedentemente abbiamo segnalato i risultati di molti esperimenti che indicano che quasi tutto il segnale fluorescente osservato nei risultati del metodo dal fluoroforo ERT nel lisosoma8. Abbiamo trovato che il segnale ERT fluoroforo è stato eliminato a seguito di un trattamento delle cellule con citocalasina B, che sconvolge interiorizzazione attraverso l'inibizione della riorganizzazione dell'actina. Inoltre, esperimenti che estiguuto fluoroforo esterno con trypan blu o rallentato interiorizzazione inserendo le cellule a 4 ° C, indicano che la ERT fluoroforo è rapidamente interiorizzata e fluorescenza molto poco è dovuto un ERT associato alla superficie delle cellule. Lysosomal targeting è stato confermato dalla visualizzazione la co-localizzazione di pH sensibili lysotracker colorante con il farmaco coniugato fluoroforo usando la microscopia confocal. Una specificità per l'assorbimento attraverso CI-M6PR può anche essere verificata utilizzando M6P esogeno per competere con i farmaci etichettati per grippaggio del ricevitore. Esperimenti simili dovrebbero essere effettuati per verificare la cinetica di assorbimento e la localizzazione cellulare di farmaci fluorophore-coniugati in altri saggi.
Questa piattaforma di analisi basati su celle è stata utilizzata per studiare NAbs per farmaci terapeutici che utilizzano endocytosis ricevitore-mediato di CI-M6PR. Recentemente abbiamo riferito risultati utilizzando questa piattaforma di test che hanno dimostrato nessuna correlazione tra lo sviluppo di un'efficacia NAb e droga per elosulfase alfa36,37. Per convalidare il test per campioni clinici, test, i parametri, tra cui sensibilità, precisione, selettività, specificità, tolleranza al farmaco, robustezza e tagliare i punti, devono essere valutati secondo i guidances stabilito3, 4. si deve anche osservare, per lysosomal ERTs, che NAbs possono sviluppare con il potenziale di interferire con attività di droga tramite l'associazione nei pressi del sito catalitico dell'enzima. In generale, riteniamo che il monitoraggio di questo tipo di NAb a essere una priorità più bassa poiché il duro ambiente siliceo e proteolitica del lisosoma non è favorevole a anticorpo-ERT interazioni2,39,40. Tuttavia, è possibile che proteolitici-resistente NAbs esiste e può inibire la porzione catalitica di un farmaco40. Questo test monitor fluoroforo ERT assorbimento per il lisosoma e una limitazione del dosaggio è l'incapacità di monitorare NAbs proteolitici-resistente. Se questo tipo di NAb è ritenuto sospetto basato su dati di sicurezza o efficacia, un'analisi che controlla l'attività ERT dovrebbe essere sviluppata e usata per testare campioni.
La valutazione dell'immunogenicità è importante nella comprensione degli effetti di NAbs sulla droga sicurezza ed efficacia. L'identificazione di Nefertari in grado di inibire in vitro droga assorbimento tramite CI-M6PR fornisce un'opportunità per comprendere NAb attività in vivo. Il metodo presentato qui utilizza una linea cellulare umana che esprime CI-M6PR per misurare l'interferenza del fluoroforo-coniugato assorbimento cellulare lysosomal ERT. Questo metodo è già stato utilizzato per il monitoraggio NAbs ERTs diversi destinati a trattare malattie lisosomiali. Questa piattaforma di analisi può applicare ad altri metodi per studiare gli effetti di Navarro sulle terapie biologiche che richiedono un'internalizzazione cellulare per il loro corretto funzionamento.
Disclosures
Gli autori sono dipendenti e gli azionisti di BioMarin Pharmaceutical Inc.
Acknowledgments
Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks | Corning | CLS430769 | |
| Round Bottom 96-well culture plates | Thermo-Nunclon | 163320 | |
| Sterile reagent reservoirs | VistaLab | 3054-1004 | |
| 96 well white round bottom polystyrene microplate plate | Corning | 3605 | |
| 96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips | Corning | 4408 | |
| Magnetic bead separator tube rack | V&P Scientific, Inc | VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3 | |
| DynaMag -2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| DynaMag -96 Side Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| BD High Throughput Sampler (HTS) | BD Biosciences | ||
| BioRad TC20 Automated Cell Counter | BioRad | 1450103 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-928 | |
| Galaxy MiniStar Microcentrifuge | VWR | C1413 | |
| tissue culture CO2 incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| Biosafety cabinet | Labcono | Purifier Cell Logic + | |
| Jurkat Cell Line | ATCC | TIB152™ | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | A20173 | |
| Dynabeads M270 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 65306 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| RPMI-1640 1x Medium | Life Technologies | A10491-01-500mL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
| Pen-Strep (100x) liquid formulation | Corning | 30-002-CI | |
| 1x DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| 4% Para-formaldehyde | Electron Microscopy Science | 15735-85 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Life Technologies | L34955 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-100mL | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 3059 | |
| Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) | Bioreclamation IVT | request a quote from website | |
| VWR Polyester Plate Film | VWR | 60941 | |
| Seal & Sample Aluminum Foil | Beckman Coulter | 538619 |
References
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