Summary
Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.
Abstract
Citocinas desempenham um papel crucial na patogênese de doenças auto-imunes. Daí, a medição dos níveis de citocina tem sido o foco de vários estudos na tentativa de compreender os mecanismos precisos que levam ao colapso da auto-tolerância e auto-imunidade subsequente. Abordagens, até agora tem sido baseadas no estudo de um aspecto específico do sistema imunológico (um único ou alguns tipos de células ou citocinas) e não oferecer uma avaliação global da doença auto-imune complexa. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas. Uma abordagem abrangente de célula única para avaliar a produção de citocinas em vários subconjuntos de células imunes, dentro do contexto de "intrínseco" plasma paciente específico, fatores, de circulação é descrita aqui. Esta abordagem permite a monitoração do paciente específico imune fenótipo (marcadores de superfície) e função (citocinas), quer na sua nativa "intrínseco patogénicos" doença estadual, ou na presença de agentes terapêuticos (em vivo ou ex vivo).
Introduction
As doenças auto-imunes são das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando 3-8% da população. Nos Estados Unidos, desordens auto-imunes estão entre as principais causas de morte entre as mulheres jovens e de meia-idade (idades < 65 anos)1,2. Doenças auto-imunes são caracterizadas por apresentação clínica heterogênea e diversos processos imunológicos subjacentes. O espectro da heterogeneidade está bem representado através de diferentes transtornos, tais como a participação conjunta em artrite reumatoide (ar) e doença neurológica em esclerose múltipla (MS). No entanto, este nível de heterogeneidade também é exemplificado dentro de um único distúrbio, tais como Lúpus eritematoso sistémico (SLE): alguns pacientes podem apresentar com patologia renal, enquanto outros sofrem de envolvimento hematológicas ou comum3.
A imunopatogênese subjacente em desordens auto-imunes espelha a heterogeneidade clínica, envolvendo autoe hiperativação de vários subconjuntos de célula imune inata e adaptativa e desregulação concomitante produção de citocinas. Enquanto citocinas desempenham um papel crucial na patogênese da doença auto-imune, compreender o seu papel específico no mecanismo da doença tem provado para ser um desafio. Citocinas são caracterizadas por pleiotropia (uma citocina pode ter vários efeitos sobre diferentes tipos de células), redundância (várias citocinas podem ter o mesmo efeito), a dualidade (uma citocina pode ter efeitos pro ou anti angentes sob condições diferentes), e plasticidade (citocinas podem ser moldadas em um papel diferente do seu "original", dependendo do ambiente)4,5,6. Consequentemente, métodos de nível populacional não consegue distinguir heterogêneas respostas celulares para a mesma "cytokine milieu". Da mesma forma, os projetos de estudo que se concentram em um aspecto específico do sistema imunológico (um único tipo de células ou citocinas), não oferecem uma avaliação global de todos os elementos envolvidos na complexa doença auto-imune. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas.
Recentemente, desenvolvemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico "" plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. O fluxo de trabalho descrito aqui é caracterizado pelo uso de amostras de sangue periférico intacto, ao contrário de células mononucleares de sangue periférico isolado (PBMC). Sangue periférico representa o veículo fisiologicamente mais relevante para estudar a doença imune-mediada sistêmica, incluindo células de sangue 1) não-mononucleares frequentemente envolvidos em doenças autoimunes (isto é, neutrófilos, plaquetas) e 2) plasma circulantes de fatores, tais como ácidos nucleicos, complexos imunes e citocinas, que têm funções de ativação imunes. Para capturar o "intrínseco patogénicos" desregulação produção de citocinas, as amostras são processadas imediatamente após a recolha de sangue (T0, tempo zero) e após 6 horas de incubação a 37 ° C (temperatura do corpo fisiológico) com um transporte de proteína do sangue periférico inibidor na ausência de qualquer condição estimulante exógena (T6, tempo 6 h), para detectar a produção de citocinas (acumulação, T6-T0) que iria reflectir o estado de doença "intrínseco" (Figura 1). Para estudar os processos de desregulação que refletem sobre ou sob ativação da sinalização de caminhos envolvidos em respostas imunes pertinentes à doença, amostras de sangue periférico são tratados (incubação de 6 h a 37 ° C, com um inibidor de transporte de proteína) com uma exógena estimulando a condição que reflete a patogênese da doença, tais como agonistas do Receptor Toll-Like (TLR) no caso de SLE (T6 + R848, tempo 6 h com R848 de 1 µ g/mL), para detectar a produção de citocinas que refletisse uma resposta aos ácidos nucleicos (comparando T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Para estudar os efeitos imunomoduladores de terapêutica disponível ex vivo, como dizem respeito aos processos de desregulação imune precisos para pacientes específicos, amostras de sangue periférico são tratadas com um inibidor JAK no relevantes terapêutico concentração (aqui, 5 hum ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6 h com 5 hum ruxolitinib), para detectar alterações no estado de doença "intrínseco" em resposta à droga (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Um inibidor JAK foi escolhido para este estudo porque inibidores JAK foram mostrados para ser bem sucedido no tratamento de doenças auto-imunes como Rá
Para avaliar simultaneamente os processos de desregulação descritos acima em vários subconjuntos de células imunes, amostras de sangue periférico de SLE pacientes e controles saudáveis foram processados conforme descrito acima e analisadas por citometria de massa. Citometria de massa, também conhecido como citometria-tempo-de-voo, oferece análises de célula única de mais de 40 parâmetros sem problemas de espectral se sobrepõem7,8,9. Esta técnica utiliza isótopos metal de terra rara na forma de íons metálicos solúveis como tags vinculados aos anticorpos, ao invés de fluorophores10. Detalhes adicionais sobre a plataforma tecnológica de citometria em massa (ou seja, ajuste e calibração, aquisição de amostra) podem ser encontrados em Leipold et al e McCarthy et al 11 , 12 a alta-dimensionalidade da citometria de massa permite a medição simultânea de várias citocinas ao longo de subconjuntos de célula imune inata e adaptativa com granularidade de célula única (Tabela de materiais).
Parâmetros clínicos e laboratoriais convencionais atuais muitas vezes não são sensível ou específico o suficiente para a detecção de atividade da doença em curso ou a resposta de imunomoduladores específico13, refletindo a necessidade de melhor delinear o imunológico subjacente mudanças que impulsionam a flare-ups. Dada a abrangência do cytokine dysregulation na doença auto-imune, tem uma infinidade de abordagens de tratamento que usam anticorpos ou inibidores moleculares pequenos direcionamento citocinas ou sinalização de proteínas envolvidas na regulação da produção de citocinas recentemente surgiram. No seu formato básico, a abordagem analítica de sangue periférico, descrita aqui fornece uma plataforma para identificar subconjuntos de células específicas do paciente prejudicado e sua produção de citocina anormal na doença auto-imune com manifestações sistêmicas. Esta metodologia permite a personalização de opções terapêuticas como citocinas desregulação específicos podem ser identificadas, e tratamento específico, as opções podem ser testadas ex vivo para avaliar sua capacidade de immunomodulate a paciente doença específica processo.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por o Colorado múltiplos institucional Review Board (COMIRB) da Universidade do Colorado. Todos os procedimentos descritos abaixo devem ser executados em uma capa de cultura de tecidos estéreis, salvo indicação em contrário, com pontas de pipetas filtrada, e todos os reagentes filtrada.
1. preparação dos reagentes para o processamento de sangue periférico
- Prepare ruxolitinib estoque alíquotas (10 – 15 μL/frasco para uso individual) em 10mm diluindo o reagente liofilizado em DMSO, conforme as instruções do fabricante (loja a-80 ° C). Manter concentrações de DMSO em todos os ensaios, incluindo controles unstimulated inferior a 0,2% (vol/vol).
- Preparar R848 (resiquimod) alíquotas de estoque (10 – 15 μL/frasco para uso individual) em 1 μg/μL, diluindo o reagente liofilizado em água estéril como a instruções do fabricante. Loja a-80 ° C.
- Prepare lipopolissacarídeo (LPS) estoque partes alíquota (5 μL por frasco para um uso do tempo apenas) em 1 μg/μL diluindo o reagente liofilizado em água estéril, conforme as instruções do fabricante. Loja a-80 ° C.
- Prepare a célula coloração Media (CSM) usando PBS, 0,5% de BSA e 0,02% NaN3.
- Adquirir e manter pronto o coquetel de inibidor (PTI) de transporte de proteínas (Tabela de materiais).
- Descongelar e diluir o ruxolitinib frasco de estoque (10 mM) 01:10 em PBS estéril (1 mM). Reserve em temperatura ambiente em um capuz de cultura de tecidos.
- Descongelar e diluir o frasco de estoque R848 (1 μg / µ l) 01:10 em PBS estéril (0,1 μg / µ l). Reserve em temperatura ambiente em um capuz de cultura de tecidos.
- Descongelar e diluir o LPS frasco estoque 1: 100 (1 μg / µ l) em PBS estéril (0,01 μg / µ l). Reserve em temperatura ambiente em um capuz de cultura de tecidos.
- Pré-aquecer o RPMI estéril (sem L-glutamina) num banho de água padrão 37 ° C (pelo menos 10 min).
- Dilua o buffer de lyse/correção de 1:5 em ddH filtrado2O (concentração de trabalho) sobre a bancada (não precisa ser estéril).
Nota: 1 mL de sangue total requer 20 mL da concentração de trabalho de conserto/lyse buffer.- Fazer reserva de lyse/fix para 5 condições de 1 mL de sangue total (pelo menos 100 mL cada). Alíquota 20ml da concentração trabalho de conserto/lyse buffer para tubos cónico de 50 mL por mililitro de sangue total (manter a solução de conserto/lyse a 37 ° C, até que seja necessário). Rotular as condições dos tubos cónicos contendo tampão lyse/correção da seguinte forma: T0 (tempo zero), T6 + 5R (tempo: 6 h com 5 hum ruxolitinib), T6 + R848 (tempo: 6 h com R848 de 1 μg/mL), T6 + LPS (tempo 6 h com 0,1 μg/mL de LPS), T6 (tempo: 6 h).
- Rótulo redondo fundo tubos de poliestireno estéril com tampas e tubos de microcentrifuga 1 mL com a mesma nomenclatura como na etapa 1.10.
2. estimulação e processamento de sangue periférico (Figura 1)
- Coloque o rotulado redondo fundo tubos de poliestireno da etapa 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) em um rack.
Nota: Todas as etapas a seguir são realizadas neste tipo de tubo, a menos que especificado em contrário. Tampa os tubos ao transferir entre o capuz de cultura de tecidos e incubadora para manter a esterilidade. - Adicione 1 mL de 37 ° C RPMI (sem L-glutamina) para cada um dos tubos (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Inverter o tubo de coleta de sangue várias vezes, adicione 1 mL de sangue total a cada tubo e pipetar subindo e descendo várias vezes para homogeneizar com RPMI (diluição com RPMI impede a aglutinação do sangue durante o período de incubação de 6 h).
- Adicionar 10 μL das 01:10 ruxolitinib T6 + 5R. Misture bem com uma pipeta P1000. Coloque o suporte de tubos na incubadora a 37 ° C e iniciar a cronometragem da incubação (T = 0).
- Processe a amostra de T0 como segue.
- Pipete todo o conteúdo do tubo T0 para um tubo cónico rotulado contendo 20 mL de buffer de lyse/correção de concentração de trabalho 37 ° C. Para otimizar a recuperação celular, enxague o tubo com buffer de lyse/correção de concentração de trabalho. Misturar por inversão do tubo cónico.
- Incube a 37 ° C por 15 min permitir a Lise e fixação. Após fixação, execute todas as etapas subsequentes para a bancada. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Decante o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de PBS frio de gelo para romper a pelota e, em seguida, encha o erlenmeyer para um volume de 15 mL com PBS.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Decante o sobrenadante. Repita a lavagem PBS (passos 2.4.3–2.4.4) se pelotas são vermelhas. Ressuspender as células em 1 mL de CSM para romper a pelota e, em seguida, transferir para o tubo rotulado microcentrifuga (passo 1.11) para anticorpos. Tome uma amostra de 10 µ l para contar células usando um contador de célula automatizada ou hemocytometer.
Nota: Uma vez que todas as células são fixos neste ponto, não é necessário incluir uma mancha de viabilidade. - Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante, deixando a pelota em ~ 60 µ l de volume residual. Mantenha esta pelota no gelo até amostras de outras condições completaram o tratamento.
- Em T = 30 min, tirar a grade de tubo (passo 2.3) para o bairro de cultura de tecidos e faça o seguinte.
- Adicionar 10 μL da 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Misture bem com uma pipeta P1000.
- Adicione 10 μL da 0,01 μg/μL LPS para T6 + LPS. Misture bem com uma pipeta P1000.
- Adicionar 4 μL de inibidor de transporte de proteína (estoque em 500 X) T6, T6 + 5R e T6 LPS (mas não a T6 + R848) e retornou as amostras para a incubadora até T = 6 h. mistura cuidadosamente com uma pipeta P1000 cada 2 h.
Nota: R848 é um agonista TLR endoplasmic e, portanto, requer um atraso temporal na adição de inibidor de transporte da proteína para permitir o acesso para seu receptor-alvo.
- Em T = 2 h, adicionar 4 μL de proteína inibidor de transporte cocktail (estoque em 500 X) para o T6 + R848 tubo. Misturar todas as amostras com uma pipeta P1000 e retornar a cremalheira para a incubadora até T = 6 h.
- Misturar as amostras com um P1000, mais uma vez em T = 4 h.
- Em T = 6 h, processo T6 T6 + LPS, T6 + R848 e T6 + 5R tubos de amostra de sangue, como descrito no passo 2.4 para a amostra de T0.
- Armazene as pelotas de célula no volume residual do CSM a-80 ° C para processar em uma data futura. Alternativamente, proceda ao código de barras e anticorpo que mancha sem armazenar.
3. código de barras Lysed/fixo de células do sangue
- Descongelar as amostras de células lysed/fixo do armazenamento-80 ° C lentamente no gelo; um máximo de 20 amostras pode ser etiquetado com código de barras único e agrupado usando este sistema. Diluir o buffer de perm X barcoding 10 de 01:10 com PBS; fazer suficiente buffer para ~ 3 mL por amostra.
- Encha uma calha não estéreis com o CSM e um com 1 buffer perm X barcoding. Adicione 1 mL de gelo frio CSM para amostras recém descongeladas, misture bem com uma pipeta e transferir para os tubos de respectivos pre-rotulada cluster polipropileno.
- Tome uma amostra μL 10 para contar células usando um contador de célula automatizada ou hemocytometer. Normalizar a contagem de células de 1,5 a 2 x 106 células por amostra em cada tubo de cluster: Remova e descarte o volume de células em excesso acima de 2 x 106 células.
- Centrifugar as células a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender as células em 1 mL de 1 buffer de perm X barcoding com uma pipeta multicanal e centrifugar 600 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante.
- Alinhe os tubos de cluster em um rack na mesma ordem, conforme indicado na chave de código de barras para a amostra corresponde com seu código de barras. Adicione 800 μL 1 X buffer de código de barras perm por pipeta multicanal para todas as amostras em tubos de cluster sem tocar o centrifugado com as pontas de pipeta (sem mistura) para reduzir a perda de células. Reserve o rack com os tubos de cluster.
- Remova 20-plex Pd Barcoding Kit tubo tiras de-20 ° C e descongelar à temperatura ambiente. Adicionar 100 μL de tampão, perm X barcoding 1, homogeneizar e transferir 120 μL da mistura ressuspensão de código de barras para as amostras de células correspondentes em tubos de cluster.
- Misture bem com uma pipeta multicanal para que não haja nenhuma contaminação cruzada entre amostras de código de barras individualmente. Incube os tubos de cluster por 30 min à temperatura ambiente para permitir que o código de barras rotular as células.
- Centrifugar a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de CSM.
- Centrifugue e Resuspenda em CSM novamente como na etapa 3.8.
Nota: Cada amostra agora é rotulada com um único código de barras, e as amostras estão prontas ser colocados em pool. - Centrifugar a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. Com uma pipeta única e usando a mesma dica, transferir todos os chumbos de célula em ~ 70-80 volume residual μL para um tubo de poliestireno. Não ejetar a ponta da pipeta; Reserve a única pipeta com esta dica.
- Com uma pipeta multicanal e novas dicas, adicione ~ 100 μL CSM para cada tubo de cluster original para maximizar a recuperação celular. Com a pipeta única com a dica que foi reservada, transferi todos os chumbos de célula no volume residual do ~ 100 μL para o mesmo tubo de poliestireno.
- Adicione o CSM a parte de cima do tubo de poliestireno (~ 3 mL). Contagem e registo o número de células de código de barras em pool definem. Centrifugar a 600 x g durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. Proceda à mancha as amostras de código de barras no mesmo dia.
Nota: É normal esperar ~ 20-30% de perda de célula no processo de código de barras.
4. coloração de código de barras Lysed/fixo as células do sangue e preparação para análise Cytometry massa instrumento
Nota: Cada 1 X título do anticorpo de coloração (1 μL do anticorpo por 100 μL de reação de coloração), geralmente pode manchar a 3 – 4 x 106 células. Portanto, quando todas as amostras de código de barras são agrupadas em um tubo, a quantidade de anticorpos deve ser ampliada. Se a quantidade de amostras de código de barras 20 a 30 x 106 células e cada 1 título X pode manchar 3 – 4 x 106 células, a amostra de código de barras requer apenas um 10 X título, em vez de individualmente, cada amostra de coloração que exigiria um 20 X quantidade de anticorpo (1 X por tubo individual). A concentração do anticorpo para o número do celular deverá ser titulada cuidadosamente para cada anticorpo individual cocktail (não discutido aqui).
- Manche as células usando anticorpos (Tabela de materiais) para indução superfície de coloração e citocinas.
- Fazer a coloração da superfície coquetel pelo cálculo do montante a ser adicionado e contabilidade para pipetagem erro (i.e., se mancha 20 amostras de código de barras de 2 x 106 células em cada amostra, um 10 X mancha título é necessário; para cálculos de volume final, compensa erros de pipetagem, tornando um 10,5 X final solução de coloração).
- Adicione 10 X vale de superfície manchando o volume para o centrifugado de código de barras. Para reduzir a perda de células, com a mesma dica, misture e medir o volume de manchas superficiais e centrifugado.
- Com base no volume das células e cocktail de coloração, adicione CSM até um volume final de coloração de 50 μL por número de amostras de células (ou seja, se a execução de um conjunto de 20 amostras, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubar durante 30 min a 4 ° C. Agite a amostra cada 15 min para promover a coloração mesmo.
- Durante a incubação de superfície mancha, prepare o tampão de Perm/lavagem (Tabela de materiais) por diluição 01:10 com o ddH filtrado2O. Prepare volumes de 2ml de permeabilização e 5 mL para lavar. Manter a 4 ° C ou em gelo.
- Cubra a superfície de coloração do tubo com CSM e centrifugar 600 x g a 4 ° C por 5 min. Aspire o sobrenadante. Resuspenda a amostra de código de barras em 2 mL de 4 ° C, 01:10 tampão de diluição Perm/lavagem. Incube a 4 ° C por 20 a 30 min para permeabilize totalmente as células.
- Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante.
- Para coloracao intracelular, siga os passos de coloração semelhantes (quanto a coloração da superfície). No entanto, usar a 4 ° C, 01:10 tampão de diluição Perm/lavagem em vez do CSM tornar-se o total de volume de coloração para que as células permanecem em um ambiente permeabilizing em toda a coloracao intracelular.
- Adicione o anticorpo intracelular cocktail à superfície manchada e permeabilizado centrifugado (passos 4.1.2–4.1.17). Trazer o total de volume de 50 μL por número de amostras de células de coloração. Incubar durante 60 min a 4 ° C. Agite a amostra cada 15 min para assegurar mesmo a coloração.
- Durante a coloracao intracelular, preparar a solução intercalador: 900 μL de PBS filtrado + 100 μL de filtrado 16% PFA (concentração final de 1,6% PFA) + 0,2 µ l de 500 hum de corante intercalador (Tabela de materiais).
- Acima do centrifugado + intracelular anticorpo cocktail com frio 01:10 tampão de lavagem/Perm.
- Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante. Por cima do tubo de coloração com o CSM. Contar e registrar o número do celular. Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de solução de intercalador de passo 4.9. Incubar durante pelo menos 20 min em temperatura ambiente por completa intercalação, ou overnight a 4 ° C (amostras em solução intercalador podem ficar em 4 ° C por até 1 semana antes de executá-los no instrumento citometria em massa).
- Prepare as células para o instrumento de citometria em massa.
- Por cima do tubo com 3 mL de filtrado ddH2O e centrifugar 600 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 3 mL de filtrado ddH2O. passar essa suspensão através de 100 μm filtro para remover quaisquer detritos ou agregados que potencialmente podem entupir o instrumento citometria em massa.
- Contagem e registro da pós-filtragem número de celular. Centrifugar a 600 x g por 5 min a 4 ° C
- Preparar a solução de grânulo de calibração (Tabela de materiais), diluindo-01:10 em ddH filtrado2O.
- Ressuspender o manchado células no volume necessário de 01:10 diluído solução de grânulo de calibração para atingir uma concentração celular de ~ 1 x 106 células/mL.
Nota: Para um CyTOF1 em 45 µ l/min, o ideal recomendado é 5 x 105 células/mL; para Helios em 30 µ l/min, 7,5 x 105 células/mL. - Proceda para executar o exemplo no instrumento cytometry massa9.
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Representative Results
A Figura 1 demonstra o fluxo de trabalho para a estimulação e processamento das amostras de sangue periférico, incluindo a alocação das alíquotas de amostra de sangue, sincronismo da adição de agentes de estimulação, proteína de transporte inibidor cocktail e incubação vezes até o lysis da pilha de sangue vermelha (RBC) e fixação. A escolha dos agentes estimulantes dependerá as vias de sinalização e citocinas que são direcionadas para a avaliação. Por exemplo, o protocolo descrito aqui, agonistas TLR são usadas para avaliar os mecanismos de detecção imune inatos em vários tipos de célula. Representante extracelulares (LPS, TLR4 agonista) e endoplasmic (R848, TLR7/8 agonista) agonistas foram escolhidas. Outros agentes estimulantes incluem Phorbol Myristate 12 13-acetato (PMA) e Ionomycin (PMAIONO), que podem atuar como ativadores de células T. Citocinas específicas também podem ser usadas como estimulante agentes, juntamente com outros antígenos B e células T específicos.
Para demonstrar a abordagem experimental descrita neste protocolo, Figura 2, Figura 3e Figura 4 mostram resultados representativos obtidos usando LPS, R848 e PMAIONO como estimular condições. Enquanto o uso de PMAIONO não foi descrito no protocolo, os dados são mostrados na Figura 3 e Figura 4 para demonstrar que tipos diferentes (e seletivo) e citocinas são ativados/induzida em resposta aos agonistas TLR (LPS e R848) contra um T ativador de célula (PMAIONO). Dado que 26 marcadores de superfície (Tabela de materiais) têm sido utilizados para demarcar a vários subconjuntos de célula imune inata e adaptativa, vários T, B, NK, monócitos e subconjuntos de células dendríticas podem ser simultaneamente estudados dentro de uma única amostra. Além disso, os marcadores de ativação de células imunes também estão incluídos, como CD86 ou ICOS para células B e PD1 para células T. Um representante limitada gating estratégia demonstrando a avaliação de monócitos CD14hi é mostrado na Figura 2. No entanto, ainda mais detalhada e gating expandida de T, B, NK, monócitos, dendríticas e subconjuntos de célula granulocítica pode ser encontrado em nosso trabalho anteriormente publicado em O'Gorman e Hsieh et al e O'Gorman e Kong et al 14 , 15 além disso, sem supervisão de métodos de análise, incluindo (e não limitado a) SPADE16visNE17, Citrus18, Phenograph19e Xshift20 podem ser usados para avaliar dados citometria em massa (não discutidos aqui). Usando CD14hi de monócitos e células T CD4 como subconjuntos de representante célula imune inata e adaptativa, dados que demonstrem a indução de citocinas dentro destes tipos de células são mostrados na Figura 3. Um número seleto de citocinas foi escolhido para mostrar que R848 seletivamente induz a IL-12 (subunidade p40) e MCP1 em monócitos CD14hi enquanto LPS não (Figura 3). PMAIONO, um potente T cell activator não induz citocinas em monócitos CD14hi (Figura 3), mas induzir interferon gama (relato) e fator de necrose tumoral alfa (TNFa) em células T CD4 (Figura 4). Técnica bem sucedida na estimulação de amostra de sangue periférico e processamento irá demonstrar padrões de indução de citocinas específica condições estimulantes e subconjuntos imunes, como exemplificado na Figura 3 e Figura 4. Para análise completa das 14 citocinas descrito aqui nos tipos de célula capturados dentro os 26 marcadores de superfície, por favor consulte O'Gorman e Hsieh et ale O'Gorman e Kong et al 14 , 15
Para demonstrar como a abordagem experimental descrita neste protocolo captura estado patogénico "intrínseco" de uma doença autoimune sistêmica, tais como no Les, quando comparado com um doador saudável, a Figura 5 ilustra a indução de citocinas (Mip1β e MCP1) em monócitos CD14hi encontrados no sangue periférico doente amostra única (parte B), na ausência de qualquer estímulo exógeno (T6 comparado com T0). Estas citocinas são "modulada/diminuiu" terapia de inibição JAK ruxolitinib (T6 + 5R comparado a T6) no sangue periférico doente amostra única (parte B).
Figura 1. Fluxo de trabalho experimental para estimulação e processamento de sangue periférico para análise cytometry massa. Protocolo para lise de RBC e fixação de doença do sangue periférico imediatamente seguinte coleta de amostra (T0), ou após a incubação de 6 h a 37 ° C, com um inibidor da proteína de transporte (PTI) na ausência de qualquer agente exógeno (T6), ou com LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; proteína transporte inibidor incubação por 4h só), ou ruxolitinib (T6 + 5R). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Representante de retenção de estratégia para a identificação de monócitos CD14hi. Após fixação e lise de RBC, o indivíduo lysed/fixo amostras de células de um doador saudável eram o código de barras, rotulado com 26 anticorpos marcadores de superfície, permeabilizado e manchado com 14 anticorpos contra as citocinas (Tabela de materiais). A estratégia associada limitada que representa a identificação de monócitos CD14hi é mostrada. Da esquerda para a direita, cada parcela 2D representada é um subconjunto da população da população de pai que é fechado (caixa azul) do terreno 2D imediatamente para a esquerda. Uma estratégia associada estendida pode ser encontrada em O'Gorman e Hsieh et ale O'Gorman e Kong et al 14 , 15 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Exemplo de indução de citocinas em monócitos CD14hi após estimulação com LPS, R848 e PMAIONO. Uma análise cytometry massa representativa de sangue periférico amostras de um saudável doador no tempo zero (T0), unstimulated (T6) e após estimulação com LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), e PMAIONO (T6 + PMAIONO) é mostrado. É mostrado um exemplo da indução de citocinas em monócitos CD14hi; citocinas selecionadas com especificidade para o agente estimulante usado (agonista TLR vs T cell activator) são retratadas. Dados estendidos para todos indução de citocinas em vários subconjuntos de células imunes verificado com este painel de anticorpos de citometria em massa podem ser encontrados em O'Gorman e Hsieh et ale O'Gorman e Kong et al 14 , 15 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Exemplo de indução de citocinas em T CD4 células após estimulação com LPS, R848 e PMAIONO. Uma análise cytometry massa representativa de sangue periférico amostras de um saudável doador no tempo zero (T0), unstimulated (T6) e após estimulação com LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), e PMAIONO (T6 + PMAIONO) é mostrado. Exemplo de indução de citocinas em células T CD4 é mostrado; citocinas selecionadas com especificidade para o agente estimulante usado (agonista TLR vs T cell activator) são retratadas. Dados estendidos para todos indução de citocinas em vários subconjuntos de células imunes verificado com este painel de anticorpos de citometria em massa podem ser encontrados em O'Gorman e Hsieh et ale O'Gorman e Kong et al 14 , 15 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Exemplo de indução de citocinas em monócitos CD14hi de paciente de doença de SLE. Uma análise cytometry massa representativa das amostras de sangue periférico dos doadores saudáveis (A) e paciente de doença SLE (B) são mostrados. Exemplos da indução de citocinas em monócitos CD14hi; selecionados de citocinas com especificidade para SLE "intrínseco" patogénico processo doença (T6) (i.e., indução de MIP1β e MCP1 somente no paciente SLE), e o efeito de ruxolitinib imunomodulador (T6 + 5R) são descritos. Dados estendidos para todos indução de citocinas em vários subconjuntos de células imunes verificado com este painel de anticorpos de citometria em massa podem ser encontrados em O'Gorman e Kong et al . 15 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos um romance, unicelulares, abordagem proteômica para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico "" plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. Este método emprega o sangue periférico como o veículo analítico e citometria de massa como a ferramenta para a avaliação de anormalidades fenotípicas e funcionais de celulares imunes. O método é prontamente aplicável a estudos de humanos e ratos21e é compatível com outras análises funcionais imune, tais como detecção de sinalização de anomalias de14.
O usuário deve estar ciente de um número de variáveis que podem afetar o sucesso deste procedimento. Baseado em nossa experiência, amostras de sangue devem ser processadas até 2 horas após a coleta para evitar a indução de linha de base de citocinas intracelulares (dados não mostrados). Amostras de sangue devem permanecer à temperatura ambiente (25 ° C) enquanto se aguarda processamento. Amostras de sangue podem ser coletadas em sódio ou heparina ou EDTA tubos, sem interferência com o ensaio descrito. Viver e discriminação de célula morta pode ser avaliada por citometria em massa utilizando cisplatina22. No entanto, tal avaliação é omitida no protocolo descrito acima supondo que o sangue é processado imediatamente (ou até 2 horas) após a coleta. Além disso, mesmo se as amostras foram atrasadas em processamento, a falta de criopreservação permite a omissão de discriminação ao vivo/morto. Nós, no entanto, recomendamos o uso da Cisplatina para a discriminação de viabilidade para qualquer estudo em que a morte celular pode afetar o resultado da análise a jusante.
Além disso, nós encontramos que a escolha cuidadosa e titulação do agente estimulante é essencial para avaliar o alvo imune caminhos/cytokine indução. Primeiro, a escolha do agente estimulante deve basear 1) o imunológico vias pretende envolver/avaliar e 2) alvo leituras funcionais (se sinalizando a produção de proteínas ou citocinas). Por exemplo, se o objetivo avaliar a ativação de células T e diferentes subconjuntos de células auxiliares (Th) T e seu respectivos cytokine indução, PMAIONO ou uma combinação de anti-CD3/anti-CD28 seria uma condição adequada de estimulante. No entanto, se o objetivo era avaliar a ativação de subconjunto de monócitos, um agonista TLR (ou uma combinação deles) pode ser melhor. Em segundo lugar, a concentração de cada um desses agentes estimulantes precisa ser otimizado para eliciar a ativação de células e indução de citocinas, sem alterar severamente os marcadores de superfície celular. Uso de agente estimulante muito pouco não conduzirá à ativação de tipos de células desejada e sem indução de citocinas será observada, enquanto o uso de demais vai levar a morte celular excessiva, e mudanças no imune celular marcadores de superfície tal que populações identificadas na condição de unstimulated não estará presente na condição estimulada. Em terceiro lugar, a cinética da estimulação também é uma variável importante. Enquanto 6h foi anteriormente publicado como um período de estimulação ideal para capturar máxima indução de citocinas pró-inflamatórias em resposta a estimulação de TLR14,23, um Commit de estimulação diferentes pode ser necessários para outros agentes. Da mesma forma, o uso de qualquer droga terapêutica em vitro com as amostras de sangue periférico também deverá ser titulado da mesma maneira como o agente estimulante, ao mesmo tempo prestando atenção a concentração e Commit.
Neste protocolo, utilizamos amostras de sangue total periférico fresco, como indução de citocinas intracelulares (e detecção) são mais robusta e eficaz, quando comparado às amostras criopreservadas. Descrevemos o protocolo aqui o uso de sangue total em vez de PBMC, como a presença de plasma circulando fatores contribui para a natureza "intrínseca" das anormalidades imunes relacionadas com o processo da doença. Esses fatores circulantes de plasma podem interferir estimulando condições adicionadas para o sangue periférico, tais como a adição de anti-IgM e anti-IgG para envolver o receptor de células B, como eles estão ligados pelo plasma circulam anticorpos e células vermelhas do sangue. Portanto, a escolha cuidadosa da estimular condições quando usar sangue periférico é crucial para a experiência bem sucedida de ler out. Usar o sangue periférico tem suas vantagens (na vivo plataforma) e desvantagens (factores circulantes do plasma interferentes). No entanto, PBMCs oferecem um conjunto diferente de "prós" e "contras". Quando frescos PBMCs (em oposição ao sangue total) submeter-se o mesmo processo/protocolo e com estimulação utilizando diferentes agentes TLR, observamos o mesmo "padrão" da indução de citocinas, embora em um ligeiramente menor magnitude14,23. Na sequência deste protocolo, o uso de PBMC congelado leva a uma indução de citocinas menos robusta, e, por conseguinte, recomendamos contra diretamente comparando resultados de amostras processadas após criopreservação com aqueles processados frescos.
Tendo em conta a ressalva de fresco versus as amostras congeladas e a preferência para a utilização de amostras frescas de qualidade de dados ideal, o protocolo descrito aqui é apropriado para estudos prospectivos humanos onde as amostras são coletadas ao longo de um período de meses a anos. Amostras de sangue periférico podem ser processadas conforme descrito, e quando atingem a fase de Lise e fixação de RBC, amostras podem ser armazenadas em-80 ° C e manchadas em lotes mais tarde. Esta abordagem técnica, enquanto vantajoso para estudos mais humanos, também coloca o desafio de usar anticorpos que podem ligar para o epítopo alvo após a fixação. A Tabela de materiais listas os clones para os respectivos anticorpos que foram testados e demonstram a coloração específica post fixação. Código de barras de várias amostras (n = 20) oferece as vantagens de 1) diminuição da variabilidade de técnica, como múltiplas amostras são coradas juntos em um tubo, portanto, fazer comparações de amostras em condições razoavelmente consistente e confiável; 2) a redução do uso de anticorpo total (consulte a seção de protocolo 4.1); e 3) o esquema de códigos de barras de "6 paládio diferentes isótopos/escolher 3" leva à exclusão de parelhas (células positivas para mais de 4 isótopos de paládio). Estas vantagens são discutidas em detalhe no Zunder e Fick et al . 24 além disso, o processo de código de barras exige que as células ser fixo, como eles precisam ser permeabilizado suavemente para a intercalação do código de barras reagente (isótopos de paládio)24. Portanto, a coloração ao vivo não pode ser executada seguindo este protocolo. Note que barcoding célula viva (ao contrário do código de barras fixo celular descrito aqui) é uma possibilidade de25,26, mas no protocolo aqui, as células são fixos, então eles podem ser armazenados e lote processado juntos.
Processamento de amostra, enquanto vantajosa de um trabalho de lote e tempo do ponto de vista de eficiência, também tem seus próprios desafios. Com processamento em lote, há uma necessidade de um processo de normalização cuidadosamente curadoria. Esse processo de normalização pode ser abordado em diferentes etapas da massa citometria de fluxo de trabalho. Em primeiro lugar, a concentração de anticorpos para o número do celular deve ser mantida consistente em lotes. Achamos que uma maneira eficaz de atingir esta concentração consistente é por titulação 1) cuidadosa da concentração de anticorpos para o celular e 2) normalização do número de células de cada uma das amostras que são barcoded juntos (ou seja, 1 milhão células, por exemplo, para todas as 20 amostras de código de barras). Em segundo lugar, para compensar a variação de intensidade de sinal de instrumento (dias diferentes de ajuste, calibração e decaimento de sinal ao longo do tempo de execução), as amostras devem ser resuspended e analisadas sobre o citômetro de massa com uma solução de grânulo de normalização apropriada (tabela de materiais), seguido pela normalização do arquivo depois de aquisição de dados27 (mas antes da debarcoding). Amostras individuais são debarcoded depois que o arquivo de código de barras toda tem sido normalizado usando as ferramentas descritas em Zunder e Ferreira et al . 24 em terceiro lugar, para considerar manual anticorpo que mancha a variabilidade técnica, recomendamos a inclusão de uma amostra de "âncora", com cada conjunto de código de barras que é analisado para um único estudo, ou seja, uma única amostra que é de um doador (estudos humanos) e foi processado da mesma forma como os outros exemplos de estudo. Esta amostra deve ser gerada uma vez em quantidade grande o suficiente para ser distribuído em cada conjunto de código de barras analisado para o estudo. Estas amostras de âncora de cada código de barras serão usadas para gerar um coeficiente de variação para corrigir a variabilidade de sinal entre as amostras de estudo para esse código de barras (ou seja, amostra de âncora de código de barras 8 será usado para corrigir a variabilidade em código de barras 8).
Outro passo importante otimização é a montagem do painel de anticorpos citometria em massa, que avaliará as citocinas e subconjuntos de células imunes relevantes. Algumas das principais variáveis na Assembleia de painel de anticorpos incluem a escolha de clones (abordadas acima), sendo o título de anticorpos para o sinal de fundo mínimo, escolha de alvos de anticorpo e canais de isótopo com base na abundância de antigénio e sensibilidade do canal " compensação"das repercussões do sinal com base no isótopo impureza e oxidação e variabilidade de anticorpo individuais muito. Estas etapas de otimização são abordadas em outro lugar28 e não no âmbito do protocolo descrito aqui.
Usando essa abordagem proteômica de célula única para estudar anormalidades imunes em amostras de sangue periférico, é possível identificar fenótipos anormais de subconjuntos de células imunes, seja as diferenças de frequência de população ou alterações na expressão de marcadores de superfície de célula específica (como marcadores de ativação de células). Além disso, também é possível identificar anormalidades funcionais nos subconjuntos de células imunes, tais como abaixo ou superprodução de citocinas. Por último, o processo de comparar a amostra imediatamente fixo (T0) versus fixo após 6 h de incubação sem um agente exógeno (T6) demonstra "intrínsecos" processos patogênicos que levam a célula imune tipo e citocina anormalidades (T6-T0). Esta abordagem poderia ser adaptada para o estudo de uma variedade de processos sistêmicos imune-mediada e o engajamento dos vários subconjuntos de células imunes e caminhos dependendo do agente de estimulação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual e comentários úteis Aimee Pugh-Bernard. Este trabalho foi apoiado pelo Boettcher Fundação Webb-Waring Biomedical Research Award e prêmio número K23-1K23AR070897 do NIH para Elena W.Y. Hsieh. Ela também foi apoiada pelo prêmio número K12-HD000850 de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano e a Lucile Packard Foundation para saúde infantil, Stanford CTSA UL1 TR001085 e pesquisa de saúde infantil Instituto da Stanford University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A.
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
