Summary
Her beskriver vi en enkeltcelle proteomic tilnærming for å evaluere immun fenotypiske og funksjonell (intracellulær cytokin induksjon) endringer i eksterne hele blodprøver, som analyseres via masse cytometri.
Abstract
Cytokiner spille en sentral rolle i patogenesen av autoimmune sykdommer. Derfor har måling av cytokin nivåer vært fokus for flere studier i forsøk på å forstå nøyaktig mekanismer som fører til sammenbrudd av self-tolerance og påfølgende autoimmunitet. Tilnærminger hittil har vært basert på studier av et bestemt aspekt av immunsystemet (ett eller noen celletyper eller cytokiner), og tilbyr ikke en helhetsvurdering av komplekse autoimmun sykdom. Mens pasienten sera-baserte studier har råd viktig innsikt i autoimmunitet, gir de ikke bestemte cellulære kilden til dysregulated cytokiner oppdaget. En omfattende encellede tilnærming til evaluere cytokin produksjon i flere immun celle undergrupper, innenfor rammen av "indre" pasient-spesifikke plasma sirkulerende faktorer, er beskrevet her. Dette gir overvåking av pasient-spesifikk immun fenotypen (overflate markører) og funksjon (cytokiner), enten i sin innfødt "iboende patogene" sykdom stat, eller i nærvær av terapeutiske agenter (i vivo eller ex vivo).
Introduction
Autoimmune sykdommer er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet påvirker 3-8% av befolkningen. I USA, autoimmune sykdommer er blant de viktigste årsakene til dødsfall blant unge og middelaldrende kvinner (aldre < 65 år)1,2. Autoimmune sykdommer er preget av heterogene kliniske presentasjonen og forskjellige underliggende immunologiske prosesser. Spekteret av heterogenitet er godt representert på tvers av ulike lidelser, som felles engasjement i revmatoid artritt (RA) og nevrologiske sykdommer i multippel sklerose (MS). Men dette nivået av heterogenitet er også eksemplifisert i en enkelt lidelse, som systemisk lupus erythematosus (SLE): noen pasienter kan presentere med nyre patologi, mens andre lider hematologic eller felles engasjement3.
Den underliggende immunopathogenesis i autoimmune sykdommer gjenspeiler den klinisk heterogeniteten, med auto - og hyper-aktivering av flere medfødte og adaptive immunsystemet celle undergrupper, og samtidig dysregulated cytokiner produksjonen. Mens cytokiner spille en sentral rolle i patogenesen av autoimmune sykdommer, forstå deres spesifikke rolle i mekanismen av sykdommen har vist seg for å være utfordrende. Cytokiner er preget av pleiotropy (en cytokin kan ha flere effekter på ulike celletyper), avskjedigelse (flere cytokiner kan ha samme effekt), dualitet (en cytokin kan ha pro - eller anti - inflammatory effekter under ulike forhold), og plastisitet (cytokiner kan støpes inn i en rolle som er forskjellig fra den "originale", avhengig av miljøet)4,5,6. Følgelig kan ikke befolkningsnivå metoder skille heterogene mobilnettet svar til samme "cytokin miljøet". Tilsvarende tilbyr studie design som fokuserer på et bestemt aspekt av immunsystemet (en enkelt celle type eller cytokin), ikke en helhetsvurdering av alle elementer som er involvert i komplekse autoimmun sykdom. Mens pasienten sera-baserte studier har råd viktig innsikt i autoimmunitet, gir de ikke bestemte cellulære kilden til dysregulated cytokiner oppdaget.
Nylig har utviklet vi en enkeltcelle proteomic tilnærming for å vurdere samtidig flere immun celletyper, og oppdage deres ulike cytokin forstyrrelser i miljøet pasienten spesifikke "patogene" eksterne blodplasma sirkulerende faktorer. Arbeidsflyten beskrevet her er preget av bruk av intakt perifere hele blodprøver, i motsetning til isolerte perifert blod mononukleære celler (PBMCs). Eksterne fullblod representerer den mest fysiologisk relevante kjøretøyet for å studere systemisk immun-mediert sykdom, inkludert 1) ikke-mononukleære blodceller ofte involvert i autoimmune sykdommer (dvs., nøytrofile, blodplater) og 2) plasma sirkulerende faktorer, for eksempel nucleic syrer og immun komplekser cytokiner, som har immun aktivering roller. Å fange den "indre patogene" dysregulated cytokin produksjon, perifert blod prøver behandles umiddelbart etter blod trekningen (T0, tid null), og etter 6 h med inkubering på 37 ° C (fysiologiske kroppstemperatur) med et protein hemmer i fravær av enhver eksogene stimulerende tilstand (T6, tid 6 h), å oppdage cytokiner produksjonen (opphopning, T6-T0) som ville reflektere "indre" sykdom staten (figur 1). Å studere dysregulated prosesser som reflekterer over eller under aktivering av signalnettverk trasé involvert i immunreaksjoner relevant for sykdommen, perifert blodprøver er behandlet (6 h inkubasjon på 37 ° C med en protein transport hemmer) med et ytre stimulere tilstand som gjenspeiler sykdom patogenesen, for eksempel Toll-lignende reseptor (TLR) agonister ved SLE (T6 + R848, tid 6 h med 1 µg/mL R848), for å oppdage cytokiner produksjonen som ville reflektere svar på nucleic syrer (sammenligne T0 vs T6 vs T6 + R848, figur 1). For å studere immunmodulerende effekter av tilgjengelige therapeutics ex vivo, som de hører til presis immun dysregulated prosesser for bestemte pasienter, er perifert blodprøver behandlet med en JAK hemmer på relevante terapeutiske konsentrasjon (her, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tid 6t med 5 uM ruxolitinib), å oppdage endringer i "indre" sykdom tilstand som svar på stoffet (T0 vs T6 vs T6 + 5R, figur 1). En JAK hemmer ble valgt for denne studien fordi JAK hemmere har vist seg å være vellykket i behandlingen av autoimmune sykdommer som RA.
For å evaluere samtidig dysregulated prosesser beskrevet ovenfor i flere immun celle undergrupper, perifert blodprøver fra SLE ble pasienter og sunn kontroller behandlet som beskrevet ovenfor og analyseres av masse cytometri. Masse cytometri, også kjent som cytometri-tid-Of-Flight tilbyr én celle analyse av over 40 parametere uten spørsmål om spectral overlapper7,8,9. Denne teknikken bruker rare earth metall isotoper i form av løselig metall ioner som koder bundet til antistoffer, i stedet for fluorophores10. Flere detaljer om masse cytometri teknologisk plattform (dvs. tuning og kalibrering, prøven oppkjøp) finnes i Leipold et al. og McCarthy et al. 11 , 12 av høy-dimensjonalitet masse cytometri kan samtidig måling av flere cytokiner gjennom medfødte og adaptive immunsystemet celle undergrupper med encellede tetthet (Tabell for materiale).
Gjeldende konvensjonelle klinisk og laboratorie-parameterne er ofte ikke sensitive eller spesifikke nok til å oppdage pågående sykdommen aktiviteten eller responsen til bestemte immunomodulators13, reflekterer behovet for å avgrense arbeidet underliggende immun endringer som driver fakkel-ups. Gitt Gjennomtrengningskraft av cytokin feilregulering i autoimmune sykdommer, en mengde behandlingsmetoder som bruker antistoffer eller liten molekylær hemmere målretting cytokiner eller signalering proteiner involvert i regulering av cytokin produksjon har nylig dukket opp. I sin grunnleggende format gir perifert blod analytisk tilnærming beskrevet her en plattform for å identifisere pasient-spesifikke dysregulated celle undergrupper og unormale cytokin produksjon i autoimmune sykdommer med systemisk manifestasjoner. Denne metoden tillater tilpassing av terapeutiske valg som bestemte dysregulated cytokiner kan identifiseres, og spesifikk behandling alternativer kan være testet ex vivo å vurdere deres evne til å immunomodulate pasienten bestemt sykdommen prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av den Colorado flere institusjonelle Review Board (COMIRB) av University of Colorado. Alle beskrevet fremgangsmåtene nedenfor skal utføres i et sterilt vev kultur panseret ikke annet er angitt, med filtrerte pipette-spisser, og alle reagenser filtrert.
1. forberedelse av reagenser til eksterne fullblod behandling
- Forberede ruxolitinib lager dele (10-15 μL/hetteglass for engangsbruk) på 10 mM fortynne lyofilisert reagensen i DMSO henhold til produsentens instruksjoner (butikken ved-80 ° C). Holde DMSO konsentrasjoner i alle analyser inkludert unstimulated kontroller under 0,2% (vol/vol).
- Forberede R848 (resiquimod) lager dele (10-15 μL/hetteglass for engangsbruk) på 1 μg/μL fortynne lyofilisert reagensen i sterilt vann som i henhold til produsentens anvisninger. Butikken på-80 ° C.
- Forberede lipopolysakkarid (LPS) lager dele (5 μL per medisinglass for en gangs bruk bare) på 1 μg/μL fortynne lyofilisert reagensen i sterilt vann ifølge instruksjonene fra produsenten. Butikken på-80 ° C.
- Forberede celle flekker Media (CSM) PBS, 0,5% BSA og 0.02% NaN3.
- Kjøpe og holde klar protein transport hemmer (PTI) cocktail (Tabell for materiale).
- Tine og fortynne ruxolitinib lager medisinglass (10 mM) 1:10 i sterilt PBS (1 mM). Avsatt i romtemperatur i vev kultur hette.
- Tine og fortynne R848 lager ampullen (1 μg/µL) 1:10 i sterilt PBS (0,1 μg/µL). Avsatt i romtemperatur i vev kultur hette.
- Tine og fortynne LPS lager medisinglass (1 μg/µL) 1: 100 i sterilt PBS (0,01 μg/µL). Avsatt i romtemperatur i vev kultur hette.
- Forvarm sterilt RPMI (ingen L-glutamin) i et vannbad standard 37 ° C (for minst 10 min).
- Fortynne den lyse/fikse bufferen ved 1:5 i filtrert ddH2O (arbeider konsentrasjon) på Borstemmaskin (ikke trenger å være sterilt).
Merk: 1 mL av fullblod krever 20 mL arbeider konsentrasjon av lyse/fikse buffer.- Gjøre lyse/fikse buffer for 5 forhold med 1 mL av fullblod hver (minst 100 mL). Aliquot 20 mL arbeider konsentrasjonen av lyse/fikse buffer inn 50 mL konisk rørene per milliliter fullblod (hold den lyse/fikse løsningen på 37 ° C til nødvendig). Etiketten forholdene på konisk rør som inneholder lyse/fikse bufferen som følger: T0 (tid null), T6 + 5R (tid 6t med 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tid 6t med 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tid 6t med 0,1 μg/mL LPS), T6 (tid 6 h).
- Etiketten rundt bunnen sterilt polystyren rør med caps og 1 mL microcentrifuge rør med samme nomenklaturen som i trinn 1.10.
2. stimulering og behandling av perifer fullblod (figur 1)
- Plass den merket rundt bunnen polystyren rør fra trinn 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) i en reol.
Merk: Alle følgende trinn er utført i denne typen t hvis ikke annet. Cap rør ved overføringer mellom vev kultur panseret og inkubator å opprettholde sterilitet. - Legge 1 mL av 37 ° C RPMI (ingen L-glutamin) til hver av rør (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Invertere blod samling rør flere ganger, legge til 1 mL av fullblod hver rør og Pipetter opp og ned flere ganger til bland godt med RPMI (fortynning med RPMI hindrer klumper av blod under inkubasjonstiden 6 h).
- Tilsett 10 μL av 1:10 ruxolitinib T6 + 5R. Bland godt med en P1000 pipette. Montere rør i kuvøse på 37 ° C og begynne timing inkubering (T = 0).
- Behandle T0 eksemplet som følger.
- Pipetter T0 røret hele innholdet i en merket konisk rør som inneholder 20 mL 37 ° C arbeider konsentrasjon lyse/fikse buffer. For å optimalisere celle utvinning, skyll røret med arbeider konsentrasjon lyse/fikse buffer. Bland ved å snu konisk røret.
- Ruge på 37 ° C i 15 min for lyse og fiksering. Etter fiksering, utføre alle etterfølgende trinnene på Borstemmaskin. Sentrifuge celler på 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Dekanter nedbryting. Resuspend cellene i 1 mL av is kaldt PBS å bryte opp pellet, deretter fylle den koniske til et 15 mL volum med PBS.
- Sentrifuge cellene på 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Dekanter nedbryting. Gjenta PBS vask (trinn 2.4.3–2.4.4) hvis pellets er rød. Resuspend cellene i 1 mL av CSM å bryte opp pellet, deretter overføre til merket microcentrifuge røret (trinn 1,11) til antistoff farging. Ta en 10 µL prøve telle celler som bruker automatiserte celle counter eller hemocytometer.
Merk: Siden alle celler er faste på dette punktet, det er ikke nødvendig å inkludere en levedyktighet flekk. - Sentrifuge cellene på 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Sug opp nedbryting, forlater pellet i ~ 60 µL av residualvolum. Holde denne pellet på is inntil prøver fra andre forhold har fullført behandling.
- Ved T = 30 min, flytte tube stativet (trinn 2.3) til vev kultur panseret og utføre følgende.
- Legge til 10 μL 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Bland godt med en P1000 pipette.
- Legge til 10 μL 0,01 μg/μL LPS T6 + LPS. Bland godt med en P1000 pipette.
- Tilsett 4 μL av protein transport hemmer (stock på 500 X) T6, T6 + 5R, og T6 + LPS (men ikke til T6 + R848) og returnere prøvene til inkubator før T = 6 h. Bland godt med en P1000 pipette hver 2T.
Merk: R848 er en endoplasmic TLR Agonistiske og krever derfor en timelig forsinkelse i tillegg av protein transport inhibitor for å tillate tilgang til sine mål reseptor.
- Ved T = 2 h, tilsett 4 μL av protein transport hemmer cocktail (stock på 500 X) til T6 + R848 tube. Bland alle prøver med en P1000 pipette og returnere stativet til inkubator til T = 6 h.
- Bland prøvene med en P1000 en gang på T = 4 h.
- Ved T = 6 h, behandle T6, T6 + LPS, T6 + R848 og T6 + 5R blod prøve rør som beskrevet i trinn 2.4 for T0 prøven.
- Lagre celle pellets i CSM residualvolum ved-80 ° C å behandle på en fremtidig dato. Eventuelt gå videre til barcoding og antistoff flekker uten å lagre.
3. strekkode for Lysed/fast blodlegemer
- Tine lysed/fast celle prøvene fra-80 ° C lagring sakte på is; maksimalt 20 prøver kan merkes med unike strekkoder og samlet med dette systemet. Fortynne 10 X barcoding perm bufferen ved 1:10 med PBS; gjør nok buffer for ~ 3 mL per prøve.
- Fylle en ikke-sterilt gjennom med CSM og en 1 X barcoding perm bufferen. Legge 1 mL av is kaldt CSM til fersk tinte prøvene, bland godt med en pipette, og overføre til respektive forhåndsinnstilte merket polypropylen klynge rør.
- Ta en 10 μL prøve telle celler som bruker automatiserte celle counter eller hemocytometer. Normalisere celletall 1,5-2 x 106 celler per prøve i hver klynge tube: Kast volumet av overflødig celler over 2 x 106 celler.
- Sentrifuge cellene på 600 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspend cellene i 1 mL 1 X barcoding perm bufferen multikanal pipette og sentrifuge 600 x g for 5 min ved romtemperatur. Sug opp av nedbryting.
- Kø klynge rør på en rack i samme rekkefølge som indikert på nøkkelen strekkode slik prøven samsvarer med sin strekkode. Tilsett 800 μL 1 X barcoding perm buffer av flerkanals pipette alle prøvene i klyngen rørene uten å berøre det cellen pellet med Pipetter tips (ingen blande) for å redusere tap av cellen. Avsette stativet med klynge rør.
- Fjerne 20-plex Pd Barcoding Kit tube strimler fra 20 ° C og tine ved romtemperatur. Tilsett 100 μL 1 X barcoding perm bufferen, bland godt og overføre 120 μL resuspended strekkode blandingen i de tilsvarende cellen prøvene i klyngen rørene.
- Bland godt av flerkanals pipette slik at det er ingen krysskontaminering mellom individuelt barcoded prøvene. Inkuber klynge rør for 30 min ved romtemperatur å tillate strekkodene merke cellene.
- Sentrifuge 600 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Sug opp nedbryting, deretter resuspend i 1 mL av CSM.
- Virvel og resuspend i CSM igjen i trinn 3.8.
Merk: Hver prøve er nå merket med en unik strekkode, og prøvene er klar til å bli samlet. - Sentrifuge 600 x g i 5 minutter ved romtemperatur og Sug opp nedbryting. Med en enkelt pipette og bruker samme spissen, overføre alle cellen pellets ~ 70-80 μL residualvolum til en polystyren tube. Ikke løses pipette spissen; avsette den enkelt pipette med dette tipset.
- Med en flerkanals pipette og nye tips, tilsett ~ 100 μL CSM hver opprinnelige klynge rør å maksimere celle utvinning. Med den eneste pipette spissen som ble satt til side, overføre alle cellen pellets i ~ 100 μL residualvolum til samme polystyren rør.
- Legge til CSM til toppen av polystyren røret (~ 3 mL). Antall og post celle antall grupperte strekkoden satt. Sentrifuge 600 x g i 5 minutter ved romtemperatur og Sug opp nedbryting. Videre til farging barcoded prøvene på samme dag.
Merk: Det er normalt å forvente ~ 20-30% celle tap i barcoding prosessen.
4. farging av Barcoded fast Lysed/blodceller og forberedelse til analyse på masse cytometri Instrument
Merk: Hver 1 X titer for flekker antistoff (1 μL antistoff per 100 μL flekker reaksjon), kan vanligvis flekker 3 – 4 x 106 celler. Når alle barcoded prøver er samlet i en tube, må derfor mengden antistoff skaleres. Hvis 20 barcoded prøver beløpet til 30 x 106 celler, og hver 1 X titer kan flekken 3 – 4 x 106 celler, krever barcoded utvalget bare en 10 X titer, i motsetning til farging hver prøve, som ville kreve en 20 X mengde antistoff (1 X per individuelle rør). Konsentrasjonen av antistoffer mot celle nummer skal være nøye titreres for hver individuelle antistoff cocktail (ikke omtalt her).
- Stain celler ved hjelp av antistoffer (Table of Materials) til overflaten flekker og cytokin induksjon.
- Lage den overflaten flekker cocktail av beløpet skal legges og regnskap for pipettering feil (dvs.hvis flekker 20 barcoded prøver av 2 x 106 celler i hver prøve, en 10 X titer flekken er nødvendig, for siste bindet beregninger, kompensere for pipettering feil ved å gjøre en 10.5 X siste flekker løsning).
- Legge til 10 X overflaten flekker å barcoded celle pellets. For å redusere celle tap, med samme spissen, bland og måle opp volumet av overflaten flekker og celle pellets.
- Basert på volumet av celler og flekker cocktail, legge til CSM i et siste flekker volum på 50 μL per celle antalle (dvs.hvis kjører et sett med 20 prøver, 50 μL X 20 = 1 mL). Inkuber i 30 min på 4 ° C. Agitere prøven hvert 15 min for å fremme selv flekker.
- Under overflaten flekken incubation, forberede Perm/vaskebuffer (Tabell for materiale) ved utvannende 1:10 med filtrerte ddH2O. forberede mengder 2 mL for permeabilization og 5 mL for vask. Hold 4 ° C eller is.
- Toppen av overflaten flekker rør med CSM og sentrifuge 600 x g på 4 ° C for 5 min. Sug opp nedbryting. Resuspend barcoded prøven i 2 mL 4 ° c, 1:10 fortynning Perm/vaskebuffer. Inkuber ved 4 ° C i 20-30 min å fullt permeabilize cellene.
- Sentrifuge 600 x g ved 4 ° C i 5 min og Sug opp nedbryting.
- For intracellulær flekker, fremgangsmåten ligner flekker (som overflaten farging). Imidlertid bruke 4 ° C, 1:10 fortynning Perm/vaskebuffer i stedet for CSM å gjøre totalen flekker volumet slik at cellene forblir i et permeabilizing miljø gjennom den intracellulær flekker.
- Legge til intracellulær antistoffer cocktail til overflaten farget og permeabilized celle pellet (trinn 4.1.2–4.1.17). Bringe totalen flekker volumet til 50 μL per antall celle prøver. Inkuber for 60 min på 4 ° C. Agitere prøven hvert 15 min for å sikre selv flekker.
- Under intracellulær farging, forberede intercalator løsningen: 900 μL filtrerte PBS + 100 μL filtrerte 16% PFA (siste konsentrasjon av 1,6% PFA) + 0,2 μL 500 uM intercalator fargestoff (Tabell for materiale).
- Toppen av cellen pellet + intracellulær antistoff cocktail med kaldt 1:10 Perm/vaskebuffer.
- Sentrifuge 600 x g ved 4 ° C i 5 min og Sug opp nedbryting. Toppen av flekker røret med CSM. Telle og registrere cellen. Sentrifuge 600 x g ved 4 ° C i 5 min og Sug opp nedbryting. Resuspend cellene i 1 mL av intercalator løsning fra steg 4,9. Inkuber i minst 20 min ved romtemperatur for full innskudd eller overnatting på 4 ° C (prøver intercalator løsning kan bo på 4 ° C i opptil 1 uke før dem på masse cytometri apparatet).
- Forberede cellene masse cytometri instrumentet.
- Toppen av røret med 3 mL filtrerte ddH2O og sentrifuge 600 x g for 5 min på 4 ° C. Resuspend cellene i 3 mL filtrerte ddH2O. passere denne suspensjon gjennom et 100 μm-filter for å fjerne rusk eller aggregater som potensielt kan tette masse cytometri apparatet.
- Telle og registrere for celle nummer etter filtrering. Sentrifuger 600 x g i 5 min på 4 ° C
- Klargjør kalibrering perle løsningen (Tabell for materiale) ved å fortynne den 1:10 i filtrert ddH2O.
- Resuspend den fargede celler i et bestemt volum 1:10 utvannet kalibrering perle løsning å oppnå en celle konsentrasjon av ~ 1 x 106 celler/mL.
Merk: For en CyTOF1 på 45 µL/min, anbefalte optimal er 5 x 105 celler/mL; for Helios på 30 µL/min, 7.5 x 105 celler/mL. - Fortsette å løpe prøven på masse cytometri instrument9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser arbeidsflyten for stimulering og behandling av perifer blodprøvene, inkludert tildeling av blod prøve dele, tidspunktet for tillegg av stimulering agenter, protein transport hemmer cocktail og inkubasjon ganger før den røde blodlegemer (RBC) lyse og fiksering. Valg av stimulerende agenter vil avhenge signalisering og cytokin veier som er målrettet for vurdering. For eksempel i protokollen beskrevet her, brukes TLR agonister til å evaluere medfødte immunsystemet sensing mekanismer på tvers av flere celletyper. Representant ekstracellulære (LPS, TLR4 Agonistiske) og endoplasmic (R848, TLR7/8 Agonistiske) agonister ble valgt. Andre stimulerende stoffer inkluderer Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) og Ionomycin (PMAIONO), som kan T celle aktivator. Bestemt cytokiner kan også bli brukt som stimulerende agenter, sammen med andre spesifikke B og T-celle antigener.
For å demonstrere den eksperimentelle tilnærmingen er beskrevet i denne protokollen, figur 2og Figur 3 Figur 4 Vis representant resultatene LPS, R848 og PMAIONO som stimulere forhold. Mens bruken av PMAIONO ikke er beskrevet i protokollen, vises data i Figur 3 og Figur 4 for å vise at ulike (og selektiv) celletyper og cytokiner er aktivert/indusert svar TLR agonister (LPS og R848) versus en T celle aktivator (PMAIONO). Gitt at 26 overflate markører (Tabell for materiale) har blitt brukt til å avgrense flere medfødte og adaptive immunsystemet celle undergrupper, kan ulike T, B, NK, monocyte og dendrittiske celle undergrupper samtidig studeres i en enkelt prøve. I tillegg er angir immun celle aktivering også inkludert, for eksempel CD86 eller ICOS for B celler og PD1 for T-celler. En representant begrenset gating strategi demonstrere vurdering av CD14hi monocytter er vist i figur 2. Men mer detaljert og utvidet gating T, B, NK, monocyte, dendrittiske, og granulocytic celle undergrupper finnes i våre tidligere publiserte arbeid i O'Gorman og Hsieh et al. og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 i tillegg unsupervised analyseteknologi inkludert (og ikke begrenset til) SPADE16, visNE17, sitrus18, Phenograph19og Xshift20 kan brukes til å evaluere masse cytometri data (ikke diskutert her). Bruker CD14hi monocytter og CD4 T celler som representant medfødte og adaptive immunsystemet celle undergrupper, er data demonstrere cytokin induksjon i disse celletyper vist i Figur 3. Velg flere cytokiner ble valgt å vise at R848 induserer selektivt IL-12 (p40 delenhet) og MCP1 i CD14hi monocytter mens LPS ikke (Figur 3). PMAIONO, en potent T celle aktivator brekning ikke cytokiner i CD14hi monocytter (Figur 3), men indusere interferon-gamma (IFNγ) og tumor nekrose faktor alpha (TNFα) i CD4 T-celler (Figur 4). Vellykket teknikk i perifert blod prøve stimulering og behandling vil vise mønstre av cytokin induksjon gjelder stimulerende forhold og immun delsett, som eksemplifisert i Figur 3 og Figur 4. For fullstendig analyse av 14 cytokiner beskrevet her i celletyper tatt innenfor 26 overflate markører, se O'Gorman og Hsieh et al., og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15
Å demonstrere hvordan den eksperimentelle tilnærmingen er beskrevet i denne protokollen fanger "indre" patogene staten av en systemisk autoimmun sykdom som i SLE sammenlignet med en frisk donor, figur 5 illustrerer cytokin induksjon (Mip1β og MCP1) i CD14hi monocytter i den syke perifert blod sample bare (del B), i fravær av noen ytre stimulering (T6 sammenlignet T0). Disse cytokiner er "modulert/redusert" av JAK hemming terapi ruxolitinib (T6 + 5R sammenlignet T6) i syke perifert blod sample bare (del B).
Figur 1. Eksperimentell arbeidsflyt for stimulering og behandling av perifert blod for masse cytometri analyse. Protokoll for RBC lyse og fiksering av sykdom perifert blod prøve umiddelbart samling (T0) eller etter 6 h inkubasjon på 37 ° C med en protein transport hemmer (PTI) i fravær av noen eksogene agent (T6) eller LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; protein transport hemmer inkubasjon 4 h bare) eller ruxolitinib (T6 + 5R). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representant gating strategi for identifisering av CD14hi monocytter. Etter fiksering og RBC lysis fast den enkelte lysed/celle prøver fra en frisk donor var barcoded, merket med 26 antistoffer mot overflate markører, permeabilized og farget med 14 antistoffer mot cytokiner (Tabell for materiale). Begrenset gating strategien som representerer identifikasjonen av CD14hi monocytter vises. Fra venstre til høyre er hver 2D tomten representert et befolkningen delsett fra overordnede befolkningen som er gated (blå boks) fra 2D tomten umiddelbart til venstre. En utvidet gating strategi kan finnes i O'Gorman og Hsieh et al., og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksempel på cytokin induksjon i CD14hi monocytter etter stimulering med LPS, R848 og PMAIONO. En representant masse cytometri analyse av perifert blod prøver fra en frisk donor ved tidspunkt null (T0), unstimulated (T6), og etter stimulering med LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), og PMAIONO (T6 + PMAIONO) vises. Et eksempel på cytokin induksjon i CD14hi monocytter vises; valgte cytokiner med spesifisiteten til stimulerende agent brukt (TLR Agonistiske vs T celle Aktivator) vises. Utvidede dataene for alle cytokin induksjon over flere immun celle undergrupper konstatert med masse cytometri antistoff panelet kan finnes i O'Gorman og Hsieh et al., og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Eksempel på cytokin induksjon i CD4 T celler etter stimulering med LPS, R848 og PMAIONO. En representant masse cytometri analyse av perifert blod prøver fra en frisk donor ved tidspunkt null (T0), unstimulated (T6), og etter stimulering med LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), og PMAIONO (T6 + PMAIONO) vises. Eksempel på cytokin induksjon i CD4 T celler er vist; valgte cytokiner med spesifisiteten til stimulerende agent brukt (TLR Agonistiske vs T celle Aktivator) vises. Utvidede dataene for alle cytokin induksjon over flere immun celle undergrupper konstatert med masse cytometri antistoff panelet kan finnes i O'Gorman og Hsieh et al., og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Eksempel på cytokin induksjon i CD14hi monocytter fra SLE sykdom pasient. En representant masse cytometri analyse av perifert blodprøver fra frisk donor (A) og SLE sykdom pasient (B) vises. Eksempler på cytokin induksjon i CD14hi monocytter; valgt cytokiner med spesifisitet for SLE sykdom "indre" patogene prosessen (T6) (dvs., induksjon av MIP1β og MCP1 i SLE pasient) og effekten av immunomodulator ruxolitinib (T6 + 5R) vises. Utvidede dataene for alle cytokin induksjon over flere immun celle undergrupper konstatert med masse cytometri antistoff panelet kan finnes i O'Gorman og Kong et al. 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en roman, én celle, proteomic tilnærming til samtidig vurdere flere immun celletyper og oppdage deres ulike cytokin forstyrrelser i miljøet pasienten spesifikke "patogene" eksterne blodplasma sirkulerende faktorer. Denne metoden bruker eksterne fullblod som analytisk kjøretøy og masse cytometri som verktøyet for vurdering av immun mobilnettet fenotypiske og funksjonelle unormalt. Metoden gjelder lett menneskelige og mus studier21, og er kompatibel med andre immun funksjonell analyse, som oppdager signalnettverk unormalt14.
Brukeren bør være cognizant av et antall variabler som kan påvirke suksessen med denne fremgangsmåten. Basert på vår erfaring, bør blodprøver behandles innen 2 timer med samling å unngå planlagte induksjon av intracellulær cytokiner (data ikke vist). Blodprøver bør forbli ved romtemperatur (25 ° C) mens de venter på behandling. Blodprøver kan samles i enten natrium heparin eller EDTA rør uten innblanding beskrevet analysen. Live og død celle diskriminering kan vurderes av masse cytometri bruker cisplatin22. Men er slike vurderinger utelatt i protokollen beskrevet ovenfor forutsatt blod behandles umiddelbart (eller innen 2 timer) etter samling. I tillegg, selv om prøvene var forsinket i behandling, gir mangel på kryonisk bevaring til utelatelsen av live/dead diskriminering. Vi anbefaler imidlertid bruk av cisplatin for levedyktigheten diskriminering for noen studier som celledød kan påvirke utfallet av nedstrøms.
I tillegg har vi funnet at nøye utvalg og titrering av stimulerende agent er viktig å vurdere målrettet immun stier/cytokin induksjon. Først valg av stimulerende agent skal baseres på 1) immun veier skal engasjere eller evaluere, og 2) målrettet funksjonelle readouts (enten signalering proteiner eller cytokin produksjon). For eksempel, hvis målet var å evaluere T celle aktivering og ulike T hjelper celle (Th) delsett og deres respektive cytokin induksjon, ville PMAIONO eller en kombinasjon av anti-CD3/anti-CD28 være en passende stimulerende tilstand. Men hvis målet var å evaluere monocytt delsett aktivisering, kan en TLR Agonistiske (eller en kombinasjon) være best. Andre må konsentrasjonen for hver av disse stimulerende stoffer optimaliseres framprovosere cellen aktivisering og cytokin induksjon, uten å endre alvorlig celle overflate markører. Bruk av for lite stimulerende agent vil ikke fører til aktivering av ønsket celletyper og ingen cytokin induksjon vil bli observert, mens bruk av for mye vil føre til overdreven celledød, og endringer i immunforsvaret celle overflate markører slik at bestander identifisert unstimulated tilstanden vil ikke være tilstede i stimulert tilstand. Tredje er the kinetics av stimulering også en viktig variabel. Mens 6 h er tidligere publisert som en optimal stimulering tidsramme for å fange maksimal induksjon av pro-inflammatoriske cytokiner svar TLR stimulering14,23, kan en annen stimulering timepoint være nødvendig for andre agenter. Tilsvarende bør bruk av en terapeutisk medikament i vitro med eksterne blodprøvene også være titreres på samme måte som den stimulerende agenten, mens betalende hensyn til konsentrasjon og timepoint.
I denne protokollen bruker vi frisk perifere hele blodprøver, intracellulær cytokin induksjon (og gjenkjenning) er mer robust og effektiv i forhold til cryopreserved prøver. Vi beskriver i protokollen her bruk av fullblod i motsetning til PBMCs, som tilstedeværelse av plasma sirkulerende faktorer bidrar til den "iboende" naturen immun forandringene knyttet til sykdommen prosessen. Disse plasma sirkulerende faktorer kan påvirke stimulere forhold til perifert hele blod, som tillegg av anti-IgM og anti-IgG for å engasjere B-celle reseptor, de er bundet av plasma sirkulerende antistoffer og røde blodlegemer. Derfor nøye utvalg av den stimulerende forhold ved bruk eksterne fullblod er avgjørende for vellykket eksperiment lese outs. Bruke eksterne fullblod har sine fordeler (i vivo plattform) og ulemper (forstyrrende plasma sirkulerende faktorer). Men tilby PBMCs et annet sett av "eksperter" og "cons". Når fersk PBMCs (i motsetning til fullblod) gjennomgår den samme prosess/protokollen og med stimulering bruke forskjellige TLR agenter, observerte vi samme "mønster" cytokin induksjon, om enn i en litt mindre størrelsesorden14,23. Etter denne protokollen, bruk av frosne PBMCs fører til en mindre robust cytokin induksjon, og derfor vi vil anbefale mot direkte sammenligne resultatene fra prøver behandlet etter kryonisk bevaring med de behandlet frisk.
Gitt påminnelse av fersk versus frosne prøvene, og bruk av fersk eksempler for optimal kvalitet foretrekker, er protokollen beskrevet her egnet for potensielle menneskelige studier der pasientprøvene er samlet over en tidsramme på måneder til år. Perifert blodprøver kan bli behandlet som beskrevet, og når de når RBC lyse og fiksering scenen, prøver kan lagres i-80 ° C og farget i grupper senere. Denne tekniske utgjør mens fordelaktig for mest menneskelige studier, også utfordringen med hjelp av antistoffer som kan binde til målet epitope etter fiksering. Tabell for materiale viser kloner for respektive antistoffer som har blitt testet og vise bestemt flekker innlegget fiksering. Barcoding av flere prøver (n = 20) gir fordeler av 1) redusert tekniske variasjon, som flere eksempler er farget sammen i en tube, derfor gjør sammenligninger av prøver over betingelser ganske konsekvent og pålitelig. 2) reduksjon av totale antistoff (se protokollen kapittel 4.1); og 3) barcoding ordningen med "6 forskjellige palladium isotoper/Velg 3" leder av doublets (celler positivt for mer enn 4 palladium isotoper). Disse fordelene er diskutert i detalj i Zunder og Fick et al. 24 i tillegg barcoding prosessen krever at fikses celler, som de trenger for å være mildt permeabilized for innskudd barcoding reagens (palladium isotoper)24. Derfor lever flekker kan ikke utføres etter denne protokollen. Det bør bemerkes at levende celle barcoding (i motsetning til fast celle barcoding beskrevet her) er en mulighet for25,26, men i protokollen her, celler er løst slik at de kan lagres og satsvise behandlet sammen.
Batch eksempel prosessering, mens en fordel fra et arbeid og tid effektivitet ståsted, har også sine egne utfordringer. Med satsvis behandling er det behov for en nøye kuratert normalisering prosess. Normalisering prosessen kan håndteres i forskjellige trinn av arbeidsflyten for masse cytometri. Først bør konsentrasjonen av antistoff celle nummer holdes konsekvent på tvers av grupper. Vi har funnet at en effektiv måte å oppnå dette konsekvent konsentrasjon er 1) forsiktig titrering av antistoff konsentrasjonen til celle nummer og 2) normalisering av cellen hvor hvert av eksemplene er barcoded sammen (dvs.1 million celler per eksempel for alle 20 barcoded utvalg). Andre kontoen for instrumentet signal intensitet variasjoner (forskjellige dager tuning, kalibrering og signal forfall over kjøring), skal prøver resuspended og analysert på masse cytometer med en passende normalisering perle løsning (tabell materialer), etterfulgt av filen normalisering etter data oppkjøpet27 (men før debarcoding). Enkelte eksempler er debarcoded etter filen hele barcoded har blitt normalisert med verktøyene som beskrives i Zunder og Finck et al. 24 tredje kontoen for manuell antistoff flekker tekniske variasjon, anbefaler vi at inkludering av en "anker" prøve med hver strekkode som analyseres for en enkelt studie, dvs., et enkelt eksempel som er fra en donor (menneskelige studier) og er behandlet på samme måte som andre studien prøvene. Dette eksemplet skal genereres når i store nok mengder skal fordeles til hver strekkode sett analysert for studien. Prøvene anker fra hver strekkoden skal brukes å generere en koeffisient avvik korrigere signal variasjon over studie prøvene for at strekkode (i.e.anker sample fra strekkode 8 skal brukes til å korrigere variasjon i strekkoden 8).
En annen viktig optimalisering trinnet er montering av masse cytometri antistoff panelet, som vil vurdere aktuelle immun celle undergrupper og cytokiner. Noen av nøkkelen variablene i samlingen antistoff panelet inkluderer valg av kloner (omtalt ovenfor), antistoff titer for minimal bakgrunn signal, antistoff mål og isotop kanaler basert på antigen overflod og kanal følsomhet " kompensasjon"av signalet smitteeffekter basert på isotop urenhet og oksidasjon og personlige antistoff mye variasjon. Følgende optimalisering er adressert andre steder28 og ikke innenfor rammen av protokollen beskrevet her.
Bruker denne encellede proteomic å studere immun unormalt i perifert blodprøver, er det mulig å identifisere unormal fenotyper av immun celle undergrupper, befolkningen frekvens forskjeller eller endringer i uttrykk for bestemt celle overflate markører (for eksempel markører for celle aktivering). I tillegg er det også mulig å identifisere funksjonelle unormalt i immun celle undergrupper, slik som under eller overproduksjon av cytokiner. Til slutt, prosessen med å sammenligne utvalget umiddelbart fast (T0) versus fast etter 6 h med inkubering uten en eksogene agent (T6) viser "indre" patogene prosessene som fører til immun celle type og cytokin unormalt (T6-T0). Denne tilnærmingen kan skreddersys til studiet av en rekke systemisk immun-mediert prosesser og engasjement av flere immun celle undergrupper og veier avhengig av stimulering agent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Aimee Pugh-Bernard for sin intellektuelle inngang og nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av Boettcher Foundation Webb-Waring biomedisinsk forskning Award og award tallet K23-1K23AR070897 fra NIH Elena W.Y. Hsieh. Hun ble også støttet av prisen K12-HD000850 fra Eunice Kennedy Shriver National Institute barnehelse og menneskelig utvikling og Lucile Packard Foundation for barns helse, Stanford CTSA UL1 TR001085 og Child Health Research Institutt for Stanford University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A.
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
