Summary
Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.
Abstract
Citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi delle malattie autoimmuni. Quindi, la misurazione dei livelli di citochine è stata al centro di molteplici studi nel tentativo di capire i meccanismi precisi che portano alla rottura della tolleranza al self e autoimmunità successive. Approcci finora sono stati basati sullo studio di un aspetto specifico del sistema immunitario (un singolo o pochi tipi di cellule o citochine) e non offrono una valutazione globale della malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate. Un approccio globale di singola cellula per valutare la produzione di citochina in più sottoinsiemi di cellule immuni, all'interno del contesto di "intrinseco" plasma paziente-specifici fattori, di circolazione è descritto qui. Questo approccio consente il monitoraggio del fenotipo immune paziente-specifici (marcatori di superficie) e funzione (citochine), sia nella sua nativa "intrinseco patogeni" malattia stata, o in presenza di agenti terapeutici (in vivo o ex vivo).
Introduction
Le malattie autoimmuni sono delle principali cause di morbilità e mortalità che colpisce 3-8% della popolazione. Negli Stati Uniti, disordini autoimmuni sono tra le principali cause di morte tra le donne giovani e di mezza età (età < 65 anni)1,2. Disordini autoimmuni sono caratterizzati dalla presentazione clinica eterogenea e diversificati processi immunologici sottostanti. Lo spettro di eterogeneità è ben rappresentato in diversi disturbi, come la partecipazione unita nell'artrite reumatoide (RA) e malattia neurologica nella sclerosi multipla (MS). Tuttavia, questo livello di eterogeneità è esemplificato anche all'interno di un singolo disordine, come il lupus eritematoso sistemico (Les): alcuni pazienti possono presentare con patologia renale, mentre gli altri soffrono di coinvolgimento ematologico o misto3.
Immunopatogenesi sottostante nei disordini autoimmuni rispecchia l'eterogeneità clinica, che coinvolge e iper-attivazione automatica di più sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili e dysregulated concomitante produzione di citochine. Mentre citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi della malattia autoimmune, comprendere il loro ruolo specifico nel meccanismo di malattia ha dimostrato di essere impegnativo. Le citochine sono caratterizzate da pleiotropia (una citochina può avere molteplici effetti su diversi tipi di cellule), ridondanza (citochine multiple possono avere lo stesso effetto), la dualità (una citochina può avere effetti pro - o anti - infiammatori in condizioni diverse), e plasticità (citochine possono essere modellate in un ruolo diverso da quello "originale", a seconda dell'ambiente)4,5,6. Di conseguenza, metodi a livello di popolazione non possono distinguere le risposte cellulari eterogenee per la stessa "milieu citochinico". Allo stesso modo, progettazione degli studi che si concentrano su un aspetto specifico del sistema immunitario (una citochina o tipo unicellulare), non offrono una valutazione globale di tutti gli elementi coinvolti nella malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate.
Recentemente, abbiamo sviluppato un approccio di proteomica di singola cellula per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell'ambiente del paziente specifico "patogeni" plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Il flusso di lavoro descritto qui è caratterizzato dall'uso di campioni di sangue intero periferico intatto, al contrario di cellule mononucleari di sangue periferico isolato (PBMCs). Sangue periferico intero rappresenta il veicolo più fisiologicamente rilevante per studiare la malattia immune-mediata sistematica, compreso globuli 1) non-mononucleari spesso coinvolti nella malattia autoimmune (cioè, neutrofili, piastrine) e 2) del plasma circolazione di fattori, quali gli acidi nucleici, i complessi immuni e citochine, che hanno ruoli di attivazione immunitario. Per catturare il "intrinseco patogeni" produzione dysregulated di citochina, sangue periferico campioni vengono elaborati immediatamente dopo il prelievo del sangue (T0, tempo zero) e dopo 6 h di incubazione a 37 ° C (temperatura corporea fisiologica) con un trasporto di proteine inibitore in assenza di qualsiasi condizione di stimolazione esogena (T6, tempo 6 h), per rilevare la produzione di citochine (accumulo, T6-T0) che rifletta lo stato di malattia "intrinseca" (Figura 1). Per studiare processi dysregulated che riflettono sopra o sotto-attivazione di vie di segnalazione coinvolte nelle risposte immunitarie pertinenti alla malattia, campioni di sangue periferici sono trattati (6 ore di incubazione a 37 ° C con un inibitore della proteina di trasporto) con un esogeno stimolando la condizione che riflette la patogenesi della malattia, quali gli agonisti del recettore Toll-Like (TLR) nel caso di SLE (T6 + R848, tempo 6 h con R848 1 µ g/mL), per rilevare la produzione di citochine che riflettesse una risposta agli acidi nucleici (confronto tra T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Per studiare gli effetti immunomodulatori di terapie disponibili ex vivo, come si riferiscono ai processi dysregulated immune preciso per specifici pazienti, campioni di sangue periferici sono trattati con un inibitore JAK alle pertinenti terapeutico concentrazione (qui, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6h con 5 uM ruxolitinib), per rilevare le modifiche nello stato di malattia "intrinseca" in risposta al farmaco (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Un inibitore JAK è stato scelto per questo studio perché gli inibitori JAK sono stati indicati per avere successo nel trattamento di malattie autoimmuni come ra
Per valutare contemporaneamente i processi di dysregulated sopra descritti in più sottoinsiemi di cellule immunitarie, i campioni di sangue periferico da SLE pazienti e controlli sani sono stati trattati come descritto in precedenza e analizzati mediante citometria a massa. Citometria a massa, noto anche come Cytometry-Time-Of-Flight, offre analisi unicellulare di oltre 40 parametri senza problemi di spettrale si sovrappongono7,8,9. Questa tecnica utilizza terre rare isotopi del metallo sotto forma di ioni metallici solubili come tag associato agli anticorpi, invece di fluorofori10. Ulteriori dettagli riguardanti la piattaforma tecnologica di citometria a massa (cioè, tuning e calibrazione, acquisizione di esempio) possono essere trovati in Leipold et al e McCarthy et al. 11 , 12 l'alta-dimensionalità di massa cytometry consente la misura simultanea delle citochine multiple in tutta sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili con granularità di singola cellula (Tabella materiali).
Corrente convenzionale di parametri clinici e di laboratorio spesso non sono sufficientemente specifiche per la rilevazione di attività di malattia in corso o la risposta a specifici immunomodulatori13, che riflette la necessità di delineare meglio il sistema immunitario sottostante o sensibili modifiche che guidano le fiammate. Data la pervasività della citochina disregolazione nella malattia autoimmune, hanno una pletora di approcci terapeutici che utilizzano gli anticorpi o piccoli inibitori molecolari targeting citochine o segnalazione di proteine coinvolte nella regolazione della produzione di citochine recentemente è emerso. Nella sua forma base, l'approccio analitico di sangue periferico qui descritto fornisce una piattaforma per identificare dysregulated paziente-specifici sottoinsiemi di cellule e la loro produzione di citochina anormale nella malattia autoimmune con le manifestazioni sistematiche. Questa metodologia permette per la personalizzazione delle scelte terapeutiche come citochine dysregulated specifici possono essere identificate, trattamento specifico di opzioni possono essere esaminato ex vivo per valutare la loro capacità di immunomodulate il paziente malattia specifica processo.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da il Colorado più istituzionale Review Board (COMIRB) dell'Università del Colorado. Tutte le procedure descritte qui sotto dovrebbero essere effettuate in un cappuccio sterili per coltura, salvo diversa indicazione, con puntali filtrata, e tutti i reagenti filtrata.
1. preparazione dei reagenti per la lavorazione del sangue intero periferico
- Preparare ruxolitinib stock aliquote (10 – 15 μL/flaconcino monouso) a 10mm diluendo il reagente liofilizzato in DMSO secondo le istruzioni del produttore (conservare a-80 ° C). Mantenere le concentrazioni di DMSO in tutte le analisi compreso non stimolati controlli sotto 0.2% (vol/vol).
- Preparare R848 (resiquimod) stock aliquote (10 – 15 μL/flaconcino monouso) a 1 μg/μL diluendo il reagente liofilizzato in acqua sterile come il secondo le istruzioni del produttore. Conservare a-80 ° C.
- Preparare lipopolysaccharide aliquote d'archivio (LPS) (5 μL per fiala per un solo utilizzo di tempo) a 1 μg/μL diluendo il reagente liofilizzato in acqua sterile secondo le istruzioni del produttore. Conservare a-80 ° C.
- Preparare la cella colorazione Media (CSM), utilizzo di PBS, 0,5% BSA e 0,02% NaN3.
- Acquisire e tenere pronto il cocktail di inibitore (PTI) di trasporto della proteina (Tabella materiali).
- Scongelare e diluire il ruxolitinib stock flaconcino (10 mM) 01:10 in PBS sterile (1 mM). Mettere da parte a temperatura ambiente in una cappa di coltura del tessuto.
- Scongelare e diluire il flaconcino stock R848 (1 µ g / µ l) 01:10 in PBS sterile (0,1 µ g / µ l). Mettere da parte a temperatura ambiente in una cappa di coltura del tessuto.
- Scongelare e diluire il LPS flaconcino stock (1 µ g / µ l) 1: 100 in PBS sterile (0,01 µ g / µ l). Mettere da parte a temperatura ambiente in una cappa di coltura del tessuto.
- Preriscaldare la sterile RPMI (nessun L-Glutammina) in un bagno d'acqua normali 37 ° C (per almeno 10 min).
- Diluire il tampone lisante/correzione di 1:5 in ddH filtrata2O (concentrazione di lavoro) sul banco (non deve necessariamente essere sterile).
Nota: 1 mL di sangue intero richiede 20 mL di concentrazione di lavoro di tampone di lisi/correzione.- Rendere il buffer di lisi/fix per 5 condizioni di 1 mL di sangue intero ogni (almeno 100 mL). Aliquota 20 mL di concentrazione di lavoro di tampone lisante/fix in provette coniche da 50 mL per millilitro di sangue intero (tenere la soluzione lisante/fix a 37 ° C fino a quando necessario). Etichettare le condizioni sui tubi conici contenente tampone di lisi/correzione come segue: T0 (tempo zero), T6 + 5R (tempo 6 h con 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tempo 6 h con 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tempo 6 h con 0,1 μg/mL LPS), T6 (tempo 6 h).
- Etichetta fondo sterile polistirolo tubi rotondi con tappi e provette per microcentrifuga da 1 mL con la stessa nomenclatura come descritto al punto 1.10.
2. stimolazione e lavorazione del sangue intero periferico (Figura 1)
- Posizionare l'etichetta fondo polistirolo tubi rotondi da passo 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) su una cremagliera.
Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite in questo tipo di tubo, se non specificato diversamente. Cap i tubi durante il trasferimento tra la cultura del tessuto cappuccio e incubatrice per mantenere la sterilità. - Aggiungere 1 mL di 37 ° C RPMI (nessun L-Glutammina) in ciascuna delle provette (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Capovolgere la provetta di raccolta di sangue più volte, aggiungere 1 mL di sangue intero in ogni provetta e pipettare su e giù più volte per mescolare accuratamente con RPMI (diluizione con RPMI impedisce l'agglutinamento del sangue durante il periodo di incubazione di 6 h).
- Aggiungere 10 μL del 01:10 ruxolitinib T6 + 5R. Mescolare accuratamente con una pipetta P1000. Posizionare il portaprovette nell'incubatore a 37 ° C e iniziare a cronometrare l'incubazione (T = 0).
- Processo come segue l'esempio di T0.
- Pipettare l'intero contenuto del tubo T0 in una provetta conica etichettata contenente 20 mL di buffer di lisi/correzione di 37 ° C lavoro concentrazione. Per ottimizzare il recupero delle cellule, sciacquare il tubo con buffer di lavoro concentrazione lisare/correzione. Mescolare capovolgendo la provetta conica.
- Incubare a 37 ° C per 15 min consentire per lisi e la fissazione. A seguito di fissazione, eseguire tutti i passaggi successivi al banco. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Decantare il supernatante. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS freddo ghiaccio per rompere in sul pellet, quindi riempire la forma conica per un volume di 15 mL di PBS.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Decantare il supernatante. Ripetere il lavaggio con PBS (misure 2.4.3–2.4.4) se le palline sono di colore rossi. Risospendere le cellule in 1 mL di CSM per spezzare il pellet, poi il trasferimento al tubo del microcentrifuge con etichetta (passo 1.11) per macchiatura dell'anticorpo. Prendere un 10 µ l di campione per contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.
Nota: Poiché tutte le cellule sono fissi a questo punto, non è necessario includere una macchia di attuabilità. - Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lasciando il pellet in ~ 60 µ l di volume residuo. Mantenere questo precipitato sul ghiaccio fino a quando i campioni da altre circostanze hanno completato l'elaborazione.
- A T = 30 min, spostare il portaprovette (punto 2.3) alla cappa di coltura del tessuto ed eseguire le operazioni seguenti.
- Aggiungere 10 μL di 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Mescolare accuratamente con una pipetta P1000.
- Aggiungere 10 μL di 0,01 μg/μL LPS a T6 + LPS. Mescolare accuratamente con una pipetta P1000.
- Aggiungere 4 μL di inibitore del trasporto di proteine (stock a 500 X) a T6, T6 e T6 + 5R, LPS (ma non a T6 + R848) e restituire i campioni nell'incubatore fino a T = h. 6 Mix accuratamente con una pipetta P1000 ogni 2 h.
Nota: R848 è un agonista TLR reticolo endoplasmatico e quindi richiede un ritardo temporale nell'aggiunta dell'inibitore della proteina trasporto per consentire l'accesso al suo recettore di destinazione.
- A T = 2h, aggiungere 4 μL di inibitore del trasporto della proteina cocktail (stock a 500 X) al T6 + R848 tubo. Mescolare tutti i campioni con una pipetta P1000 e tornare il rack in incubatrice fino a T = 6 h.
- Mescolare i campioni con un P1000 ancora una volta a T = 4 h.
- A T = 6 h, elaborare T6, T6 + LPS, T6 + R848 e T6 + 5R provette di sangue come descritto passaggio 2.4 per il campione di T0.
- Conservare il pellet cellulare in volume residuo del CSM a-80 ° C per elaborare in una data futura. In alternativa, procedere per codici a barre e anticorpo che macchia senza memorizzare.
3. codice a barre delle cellule del sangue lisato/fisso
- Scongelare i campioni di cellule lisate/fisso dall'archiviazione di-80 ° C lentamente sul ghiaccio; un massimo di 20 campioni possa essere etichettato con codici a barre univoci e riuniti usando questo sistema. Diluire il tampone di perm X barcoding 10 01:10 con PBS; rendere sufficiente buffer per ~ 3 mL per campione.
- Riempire una depressione non sterili con il CSM e uno con il buffer di perm X barcoding 1. Aggiungere 1 mL di ghiaccio freddo CSM per campioni appena scongelati, mescolare accuratamente con una pipetta e trasferire ai tubi rispettivi cluster pre-etichettata in polipropilene.
- Prendere un 10 μL di campione per contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Normalizzare i conteggi delle cellule a 1.5 – 2 x 106 cellule per esempio in ciascun tubo di cluster: rimuovere e scartare il volume delle cellule in eccesso sopra 2 x 106 cellule.
- Centrifugare le cellule a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di perm X barcoding 1 con una pipetta multicanale e centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il sovranatante.
- Allineare i tubi di cluster su un rack nello stesso ordine come indicato sulla chiave codice a barre in modo il campione corrisponde con il codice a barre. Aggiungere 800 μL 1 X buffer di perm barcoding pipetta multicanale a tutti i campioni nei tubi cluster senza toccare il pellet cellulare con le punte di pipetta (Nessuna miscelazione) per ridurre la perdita delle cellule. Mettere da parte il rack con i tubi di cluster.
- Rimuovere le strisce di 20-plex Pd Barcoding Kit tubo da-20 ° C e scongelare a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μL di tampone di perm X barcoding 1, mescolare accuratamente e trasferire 120 μL del sedimento barcode mix in campioni di cellule corrispondenti provette di cluster.
- Mescolare accuratamente mediante pipetta multicanale così che non c'è nessuna contaminazione incrociata tra individualmente i campioni con codice a barre. Incubare le provette di cluster per 30 min a temperatura ambiente per consentire i codici a barre etichettare le cellule.
- Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere in 1 mL di CSM.
- Centrifugare e risospendere in CSM nuovamente come al punto 3.8.
Nota: Ciascun campione ora è etichettato con un codice a barre univoco e campioni sono pronti per essere messe in comune. - Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il supernatante. Con una pipetta singola e con la stessa punta, trasferire tutte le palline delle cellule in ~ 70 – 80 il volume residuo μL di una provetta di polistirene. Non espellere il puntale della pipetta; mettere da parte la pipetta singola con questo suggerimento.
- Con una pipetta multicanale e nuovi suggerimenti, è possibile aggiungere ~ 100 μL CSM ad ogni provetta di cluster originale per massimizzare il recupero delle cellule. Con la pipetta singola con la punta che è stata accantonata, trasferire tutte le palline delle cellule nel volume residuo di ~ 100 μL nella provetta polistirolo stessa.
- Aggiungere CSM a coronamento la provetta polistirolo (~ 3 mL). Conteggio e registrare il numero di cellulare il codice a barre in pool set. Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il supernatante. Procedere alla colorazione degli esempi di codice a barre sullo stesso giorno.
Nota: È normale aspettarsi ~ 20 – 30% perdita delle cellule nel processo di codici a barre.
4. colorazione del codice a barre lisate/fisso globuli e preparazione per l'analisi sullo strumento di massa citometria a
Nota: Ogni 1 X titolo di macchiatura dell'anticorpo (1 μL di anticorpo a 100 μL reazione di colorazione), solitamente può macchiare il 3 – 4 x 106 celle. Pertanto, quando tutti gli esempi di codice a barre sono riuniti in una provetta, alla quantità di anticorpo deve essere scalata. Se la quantità di campioni con codice a barre 20 a 30 x 106 cellule e ogni titolo X 1 può macchiare 3 – 4 x 106 cellule, nell'esempio di codice a barre richiede solo un 10 titolo X, al contrario di ogni campione di colorazione individualmente, che richiederebbe una quantità X 20 dell'anticorpo (1 X ogni singolo tubo). La concentrazione dell'anticorpo al numero di cellulare dovrà essere titolata con attenzione per ogni singolo anticorpo cocktail (non discusso qui).
- Macchia le celle utilizzando anticorpi (Tabella materiali) per induzione di citochina e di colorazione superficiale.
- Rendono la colorazione superficiale cocktail calcolando la quantità per essere aggiunto e contabile per pipettaggio errore (cioè, se macchiatura 20 campioni di codice a barre di 2 x 106 cellule in ogni campione, un 10 X macchia di titolo è necessario; per i calcoli di volume finale, compensare per pipettaggio errore facendo un 10.5 X colorazione soluzione finale).
- Aggiungere 10 X vale la pena di superficie macchiatura volume per il pellet cellulare con codice a barre. Per ridurre la perdita di cellule, con la stessa punta, mescolare e misurare il volume delle macchie superficiali e pellet cellulare.
- Basato sul volume delle cellule e la macchiatura cocktail, aggiungere CSM ad un volume di colorazione finale di 50 μL per il numero di campioni di cellule (cioè, se in esecuzione di un insieme di 20 campioni, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubare per 30 min a 4 ° C. Agitare il campione ogni 15 min per promuovere anche la macchiatura.
- Durante l'incubazione di superficie macchia, preparare il tampone di Perm/lavaggio (Tabella materiali) diluendo 01:10 con ddH filtrata2O. Prepare volumi di 2 mL per permeabilizzazione e 5 mL per il lavaggio. Conservare a 4 ° C o su ghiaccio.
- Top fuori la superficie tubo con CSM di colorazione, e centrifuga a 600 x g a 4 ° C per 5 min. aspirare il supernatante. Risospendere il campione di codice a barre in 2 mL di 4 ° C, 01:10 tampone di diluizione Perm/lavaggio. Incubare a 4 ° C per 20-30 min a completamente permeabilize le cellule.
- Centrifugare a 600 x g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.
- Per la colorazione intracellulare, seguire una procedura simile colorazione (per quanto riguarda la marcatura di superficie). Tuttavia, utilizzare i 4 ° C, 01:10 diluizione Perm/Wash buffer anziché il CSM per il totale di macchiatura volume in modo che le cellule rimangono in un ambiente permeabilizing durante la colorazione intracellulare.
- Aggiungere l'anticorpo intracellulare cocktail alla superficie macchiata e permeabilizzate pellet cellulare (passi 4.1.2–4.1.17). Portare il totale volume da 50 µ l per numero di campioni di cellule di colorazione. Incubare per 60 min a 4 ° C. Agitare il campione ogni 15 min per garantire anche la macchiatura.
- Durante la colorazione intracellulare, preparare la soluzione di intercalator: 900 μL di PBS filtrata + 100 μL di filtrato 16% PFA (concentrazione finale pari all'1,6% PFA) + 0,2 μL di 500 uM di tintura intercalator (Tabella materiali).
- Coronare il pellet cellulare + intracellulare anticorpo cocktail con freddo 01:10 Perm/tampone.
- Centrifugare a 600 x g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante. Top fuori il tubo di colorazione con il CSM. Contare e registrare il numero di cellulare. Centrifugare a 600 x g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante. Risospendere le cellule in 1 mL di soluzione di intercalator dal punto 4.9. Incubare per almeno 20 min a temperatura ambiente per intercalazione completo, o durante la notte a 4 ° C (campioni in soluzione intercalator possono rimanere a 4 ° C per fino a 1 settimana prima della loro esecuzione sullo strumento citometria a massa).
- Preparare le celle per lo strumento di massa cytometry.
- Coronare il tubo con 3 mL di filtrato ddH2O e centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 3 mL di filtrato ddH2O. passare questa sospensione attraverso un filtro 100 μm per rimuovere eventuali detriti o aggregati che potenzialmente potrebbero intasare lo strumento citometria a massa.
- Contare e registrare la post-filtrazione numero di cellulare. Centrifuga a 600 x g per 5 min a 4 ° C
- Preparare la soluzione di perlina di taratura (Tabella materiali) diluendo esso 01:10 in ddH filtrata2O.
- Risospendere il macchiato le cellule nel volume richiesto di 01:10 diluito soluzione di perlina di taratura per raggiungere una concentrazione di cellule di ~ 1 x 106 cellule/mL.
Nota: Per un CyTOF1 a 45 µ l/min, l'ottimale consigliata è 5 x 105 cellule/mL; per Helios a 30 µ l/min, 7,5 x 105 cellule/mL. - Procedere per eseguire l'esempio sulla massa cytometry strumento9.
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Representative Results
Nella figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro per la stimolazione e l'elaborazione dei campioni di sangue periferico, compresa l'assegnazione di aliquote del campione di sangue, temporizzazione dell'aggiunta di agenti di stimolazione, proteina trasporto inibitore cocktail e incubazione volte fino alla lisi di globuli rossi (RBC) e la fissazione. La scelta degli agenti stimolanti dipenderà le vie di segnalazione e citochine che sono mirate per la valutazione. Ad esempio, nel protocollo descritto qui, agonisti TLR sono utilizzati per valutare i meccanismi immuni innati di rilevamento in più tipi di cellule. Rappresentante extracellulare (LPS, agonista di TLR4) e reticolo endoplasmatico (R848, TLR7/8 agonista) agonisti sono stati scelti. Altri agenti stimolanti includono Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) e ionomicina (PMAIONO), che può agire come attivatori delle cellule T. Citochine specifiche possono essere utilizzate anche come agenti, insieme con altri antigeni specifici delle cellule T e B stimolanti.
Per illustrare l'approccio sperimentale descritto in questo protocollo, Figura 2, Figura 3e Figura 4 Visualizza risultati rappresentativi ottenuti con LPS, R848 e PMAIONO come condizioni di stimolazione. Mentre l'uso di PMAIONO non è stato descritto nel protocollo, i dati sono mostrati in Figura 3 e Figura 4 per dimostrare che citochine e tipi di cellule diverse (e selettivo) sono attivati/indotta in risposta ad agonisti TLR (LPS e R848) contro un T attivatore cellulare (PMAIONO). Dato che 26 marcatori di superficie (Tabella materiali) sono stati utilizzati per delimitare più sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili, vari T, B, NK, monociti e sottoinsiemi di cellule dendritiche possono essere studiati simultaneamente all'interno di un singolo campione. Inoltre, gli indicatori di attivazione delle cellule immuni sono inclusi anche, come CD86 o ICOS per le cellule B e PD1 per le cellule T. Un rappresentante limitato gating strategia dimostrando la valutazione dei monociti CD14hi è illustrato nella Figura 2. Tuttavia, ulteriormente dettagliata e gating espansa di T, B, NK, monociti, dendritiche e sottoinsiemi di cellule granulocytic può essere trovato nel nostro lavoro precedentemente pubblicato in o ' Gorman e Hsieh et al e o ' Gorman e Kong et al. 14 , 15 senza supervisione inoltre, metodi di analisi tra cui (e non limitati a) SPADE16, visNE17, agrumi18, Phenograph19e Xshift20 può essere utilizzati per valutare i dati di massa cytometry (non discusso qui). Utilizzando CD14hi monociti e cellule T CD4 come sottoinsiemi rappresentativi delle cellule immuni innate ed adattabili, dati che dimostrano la citochina induzione all'interno di questi tipi di cellule sono mostrati nella Figura 3. Un numero selezionato di citochine è stato scelto per mostrare che R848 induce selettivamente IL-12 (subunità p40) e MCP1 in monociti CD14hi mentre LPS non (Figura 3). PMAIONO, un attivatore potente delle cellule di T non induce citochine nei monociti CD14hi (Figura 3) ma indurre interferone gamma (IFNγ) e fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα) in cellule di T di CD4 (Figura 4). Tecnica di successo nella stimolazione del campione di sangue periferico e lavorazione dimostrerà modelli di induzione di citochine specifiche condizioni stimolanti e sottoinsiemi immuni, come esemplificato nella Figura 3 e Figura 4. Per un'analisi completa delle 14 citochine qui descritto nei tipi cellulari catturati entro i 26 marcatori di superficie, si prega di consultare o ' Gorman e Hsieh et al.and o ' Gorman e Kong et al. 14 , 15
Per dimostrare come l'approccio sperimentale descritto in questo protocollo acquisisce lo stato di patogeno "intrinseco" di una malattia autoimmune sistemica come in SLE rispetto ad un donatore sano, la figura 5 illustra l'induzione di citochine (Mip1β e MCP1) in monociti CD14hi trovati nella malato sangue periferico campione unico (parte B), in assenza di qualsiasi stimolazione esogena (T6 rispetto a T0). Queste citochine sono "modulato/diminuito" JAK inibizione terapia ruxolitinib (T6 + 5R rispetto a T6) nella sangue periferico malato campione unico (parte B).
Figura 1. Flusso di lavoro sperimentale per la stimolazione e la lavorazione di sangue periferico per la massa di citometria. Protocollo per lisi RBC e la fissazione della raccolta del campione immediatamente seguente di malattia sangue periferico (T0), o dopo 6 ore di incubazione a 37 ° C con un inibitore del trasporto di proteine (PTI) in assenza di qualsiasi agente esogeno (T6), o con LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; proteina trasporto inibitore incubazione per solo 4 h), o ruxolitinib (T6 + 5R). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rappresentante gating strategia per l'identificazione dei monociti CD14hi. A seguito di fissazione e Lisi RBC, l'individuo lisate/fisso campioni di cellule da un donatore sano erano con codice a barre, etichettati con 26 anticorpi contro i marcatori di superficie, permeabilizzate e macchiato con 14 anticorpi contro citochine (Tabella materiali). La strategia di gating limitata che rappresenta l'identificazione dei monociti CD14hi è indicata. Da sinistra a destra, ogni trama 2D rappresentato è un sottoinsieme della popolazione dalla popolazione genitore che è recintato (scatola blu) dalla trama 2D immediatamente a sinistra. Un'estesa strategia di gating può essere trovata in o ' Gorman e Hsieh et al.and o ' Gorman e Kong et al. 14 , 15 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Esempio di induzione di citochina in monociti CD14hi seguito alla stimolazione con LPS, R848 e PMAIONO. Un'analisi di citometria rappresentativa di massa di sangue periferico campioni da un donatore sano al tempo zero (T0), non stimolata (T6) e in seguito a stimolazione con LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), e PMAIONO (T6 + PMAIONO) viene visualizzato. È riportato un esempio dell'induzione citochina in monociti CD14hi; sono raffigurate selezionate citochine con specificità per l'agente stimolante usato (agonista TLR vs attivatore delle cellule T). Dati estesi per tutta l'induzione di citochina attraverso più sottoinsiemi delle cellule immuni accertato con questo pannello di anticorpi citometria a massa si trovano in o ' Gorman e Hsieh et al.and o ' Gorman e Kong et al. 14 , 15 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Esempio di induzione di citochina in T CD4 cellule dopo stimolazione con LPS, R848 e PMAIONO. Un'analisi di citometria rappresentativa di massa di sangue periferico campioni da un donatore sano al tempo zero (T0), non stimolata (T6) e in seguito a stimolazione con LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), e PMAIONO (T6 + PMAIONO) viene visualizzato. Esempio di induzione di citochina in cellule di T di CD4 è mostrato; sono raffigurate selezionate citochine con specificità per l'agente stimolante usato (agonista TLR vs attivatore delle cellule T). Dati estesi per tutta l'induzione di citochina attraverso più sottoinsiemi delle cellule immuni accertato con questo pannello di anticorpi citometria a massa si trovano in o ' Gorman e Hsieh et al.and o ' Gorman e Kong et al. 14 , 15 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Esempio di induzione di citochina in CD14hi monociti dal paziente di malattia di SLE. Un'analisi di citometria a massa rappresentativo di campioni di sangue periferico da donatore sano (A) e (B) paziente di malattia di SLE sono mostrati. Esempi di induzione citochina in monociti CD14hi; selezionata di citochine con specificità per il processo patogeno "intrinseco" (T6) di malattia SLE (cioè, induzione di MIP1β e MCP1 soltanto nel paziente di SLE), e l'effetto di immunomodulatore ruxolitinib (T6 + 5R) sono raffigurati. Dati estesi per tutta l'induzione di citochina attraverso più sottoinsiemi delle cellule immuni accertato con questo pannello di anticorpi citometria a massa si trovano in o ' Gorman e Kong et al. 15 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo un romanzo, unicellulare, approccio proteomico per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell'ambiente del paziente specifico "patogeni" plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Questo metodo utilizza sangue intero periferici come il veicolo analitico e citometria a massa come lo strumento per la valutazione di anomalie fenotipiche e funzionali cellulari immuni. Il metodo è facilmente applicabile a studi umani e topi21ed è compatibile con altre analisi funzionale immune, quali il rilevamento di segnalazione anomalie14.
L'utente deve essere consapevole di un certo numero di variabili che possono influenzare il successo di questa procedura. Basandoci sulla nostra esperienza, i campioni di sangue devono essere elaborati entro 2 h dalla raccolta per evitare l'induzione della linea di base delle citochine intracellulari (dati non mostrati). I campioni di sangue dovrebbero rimanere a temperatura ambiente (25 ° C), in attesa di elaborazione. I campioni di sangue possono essere raccolti in entrambi sodio eparina o EDTA tubi, senza interferenze con il dosaggio descritto. Vivere e discriminazione cellula morta può essere valutato mediante citometria a massa con cisplatino22. Tuttavia, tale valutazione viene omesso nel protocollo descritto sopra assumendo sangue viene elaborato immediatamente (o entro 2 h) dopo la raccolta. Inoltre, anche se i campioni sono stati ritardati nella lavorazione, la mancanza di crioconservazione consente l'omissione di live/dead discriminazione. Tuttavia, consigliamo l'uso di cisplatino per discriminazione di attuabilità per qualsiasi studio in cui la morte delle cellule potrebbe influenzare l'esito dell'analisi a valle.
Inoltre, abbiamo trovato che la scelta accurata e la titolazione dell'agente stimolante è essenziale per la valutazione mirata immuni vie/citochina induzione. In primo luogo, la scelta dell'agente stimolante dovrebbe essere basata su 1) il sistema immunitario percorsi destinati a impegnarsi, valutare e 2) mirati letture funzionale (se la produzione di proteine o citochina di segnalazione). Ad esempio, se l'obiettivo era di valutare l'attivazione delle cellule T e diversi sottoinsiemi di cellule helper (Th) di T e loro rispettivi citochina induzione, PMAIONO o una combinazione di anti-CD3/anti-CD28 sarebbe una condizione di stimolazione appropriata. Tuttavia, se l'obiettivo era di valutare l'attivazione di sottoinsieme del monocito, un agonista TLR (o una loro combinazione) potrebbe essere migliore. In secondo luogo, la concentrazione per ciascuno di questi agenti stimolanti deve essere ottimizzato per provocare l'attivazione delle cellule e l'induzione di citochina, senza alterare gravemente gli indicatori di superficie delle cellule. Utilizzo dell'agente stimolante troppo poco non porterà all'attivazione dei tipi di cella desiderata e nessuna induzione di citochina sarà osservata, mentre uso di troppo porterà alla morte eccessiva delle cellule, e cambiamenti nel sistema immunitario cellulare marcatori di superficie tale che popolazioni identificato nella condizione di non stimolata non sarà presente nella condizione stimolata. In terzo luogo, la cinetica della stimolazione è anche un'importante variabile. Mentre h 6 precedentemente è stato pubblicato come un arco di tempo di stimolazione ottimale per catturare la massima induzione di citochine pro-infiammatorie in risposta alla stimolazione dei TLR14,23, un timepoint di stimolazione differenti possono essere necessari per altri agenti. Allo stesso modo, l'uso di qualsiasi droga terapeutica in vitro con i campioni di sangue periferico dovrebbe essere titolato anche nello stesso modo come l'agente stimolante, pur prestando molta attenzione alla concentrazione e timepoint.
In questo protocollo, utilizziamo campioni di sangue intero periferico fresco, induzione di citochine intracellulari (e rilevamento) è più affidabile ed efficace rispetto ai campioni crioconservati. Descriviamo nel protocollo qui l'uso di sangue intero, al contrario di PBMCs, come la presenza di plasma circolanti fattori contribuisce alla natura "intrinseca" delle anomalie immunitarie legate al processo di malattia. Questi fattori circolanti del plasma possono interferire con stimolando condizioni aggiunte per il sangue intero periferico, come l'aggiunta di anti-IgM e anti-IgG per innestare il recettore delle cellule B, se essi sono vincolati dal plasma circolanti di anticorpi e globuli rossi. Pertanto, un'attenta scelta della stimolazione condizioni quando si utilizza sangue intero periferico è cruciale per esperimento riuscito leggere outs. Utilizzando sangue intero periferico ha i suoi vantaggi (in vivo piattaforma) e svantaggi (fattori d'interferenza sul plasma circolanti). Tuttavia, PBMCs offrono un set diverso di "Pro" e "contro". Quando fresco PBMCs (al contrario di sangue intero) subiscono lo stesso processo/protocollo e con stimolazione utilizzando agenti diversi TLR, abbiamo osservato lo stesso "modello" di induzione di citochina, seppure in una leggermente minore grandezza14,23. A seguito di questo protocollo, l'uso di PBMCs congelati conduce ad un'induzione di citochine meno robusta e quindi lo consigliamo contro confrontare direttamente i risultati di campioni elaborati dopo crioconservazione con quelli elaborati freschi.
Dato l'avvertimento di fresco contro campioni congelati e la preferenza per l'utilizzo di campioni freschi per qualità ottimale dei dati, il protocollo descritto qui è adatto per gli studi prospettivi umani dove campioni dei pazienti vengono raccolti su un arco di tempo di mesi e anni. Campioni di sangue periferico possono essere elaborati come descritto, e una volta che raggiungono la fase di lisi e la fissazione di RBC, i campioni possono essere conservati a-80 ° C e macchiati in batch più tardi. Questo approccio tecnico, mentre è vantaggioso per gli studi più umani, pone anche la sfida di utilizzare anticorpi che possono legarsi all'epitopo di destinazione dopo la fissazione. La Tabella materiali elenca i cloni per i rispettivi anticorpi che sono stati testati e dimostrano specifica colorazione post fissazione. Codici a barre dei campioni multipli (n = 20) offre i vantaggi di 1) diminuita variabilità tecnica, come campioni multipli sono macchiati insieme in una provetta, pertanto fare paragoni di campioni in condizioni abbastanza coerente e affidabile; 2) riduzione dell'uso di anticorpo totale (cfr. protocollo punto 4.1); e 3) il regime di codici a barre di "6 palladium diversi isotopi/scegliere 3" conduce all'esclusione di doppietti (cellule positive per più di 4 isotopi di Palladio). Questi vantaggi sono discussi in dettaglio nel Zunder e Fick et al. 24 inoltre, il processo di codici a barre richiede che le cellule fissate, come hanno bisogno di essere leggermente permeabilizzate per l'intercalazione dei codici a barre reagente (isotopi di Palladio)24. Di conseguenza, la macchiatura diretta non può essere eseguita seguendo questo protocollo. Dovrebbe essere notato che barcoding di cellule vive (al contrario di cella fissa barcoding descritto qui) è una possibilità25,26, ma nel protocollo qui, le cellule sono fissate così che possano essere archiviate e batch elaborato insieme.
Trattamento del campione, mentre vantaggiosa da un lavoro in lotti e punto di vista l'efficienza del tempo, inoltre ha le proprie sfide. Con l'elaborazione in batch c'è la necessità di un processo di normalizzazione attentamente curata. Questo processo di normalizzazione possa essere indirizzato alle diverse fasi del flusso di lavoro massa cytometry. In primo luogo, la concentrazione di anticorpi del numero delle cellule dovrebbe essere tenuta coerenza in batch. Abbiamo trovato che un modo efficace per ottenere questa concentrazione coerenza è di 1) un'attenta titolazione della concentrazione dell'anticorpo al numero di cellulare e 2) normalizzazione del numero delle cellule di tutti gli esempi che sono insieme con codice a barre (cioè, 1 milione cellule per campione, per tutti i 20 campioni di codice a barre). In secondo luogo, per rappresentare la variabilità di intensità segnale strumento (diversi giorni di tuning, calibrazione e decadimento del segnale nel corso della fase di esecuzione), campioni dovrebbero essere risospesi e analizzati sul citometro a massa con una soluzione di perlina di normalizzazione appropriata (tabella di materiali), seguita dalla normalizzazione di file dopo l' acquisizione di dati27 (ma prima del debarcoding). Campioni individuali sono debarcoded dopo il file intero con codice a barre è stato normalizzato utilizzando gli strumenti descritti in Zunder e Finck et al. 24 in terzo luogo, per tenere conto dell'anticorpo manuale tecnico variabilità di colorazione, si consiglia l'inserimento di un campione di "ancoraggio" con ogni set di codici a barre che viene analizzato per un singolo studio, cioè, un singolo campione che è da un donatore (studi umani) e è stato elaborato nello stesso modo degli altri esempi di studio. Questo esempio deve essere generato una volta in quantità abbastanza grande per essere distribuito in ogni set di codici a barre analizzati per lo studio. Questi campioni di ancoraggio da ogni codice a barre verranno utilizzati per generare un coefficiente di variazione per correggere la variabilità del segnale attraverso i campioni di studio per quel codice a barre (cioè, campione di ancoraggio da codice a barre 8 saranno usati per correggere la variabilità nel codice a barre 8).
Un altro passo importante ottimizzazione è l'assemblaggio del pannello dell'anticorpo citometria a massa, che valuterà le citochine e sottoinsiemi relativi delle cellule immuni. La scelta dei cloni (indirizzati di sopra), titolo dell'anticorpo per il segnale di fondo minimo, la scelta degli obiettivi dell'anticorpo e canali di isotopo basati su abbondanza di antigene e la sensibilità del canale, sono alcuni delle variabili chiave nell'assembly pannello dell'anticorpo" compensazione"di spillover segnale basato su impurità dell'isotopo e l'ossidazione e variabilità sacco singolo anticorpo. Queste fasi di ottimizzazione sono indirizzati altrove28 e non rientrano nell'ambito del protocollo descritto qui.
Utilizzando questo approccio di proteomica di singola cellula per studiare le anomalie immuni in campioni di sangue periferico, è possibile individuare fenotipi anormali dei sottoinsiemi delle cellule immuni, che si tratti di differenze di frequenza della popolazione o cambiamenti nell'espressione di indicatori di superficie di cella specifica (ad esempio i segni di attivazione delle cellule). Inoltre, è anche possibile identificare le anomalie funzionali in sottoinsiemi delle cellule immuni, tali come sotto o iperproduzione di citochine. Infine, il processo di confronto il campione immediatamente fisso (T0) rispetto al fisso dopo 6 h di incubazione senza un agente esogeno (T6) viene illustrato "intrinseci" processi patogeni che portano ad anomalie di tipo e citochina delle cellule immuni (T6-T0). Questo approccio potrebbe essere adattato per lo studio di una varietà di processi sistemici di immuno-mediata e l'impegno di più sottoinsiemi delle cellule immuni e percorsi a seconda dell'agente di stimolazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Aimee Pugh-Bernard per suo input intellettuale e utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award e il premio numero K23-1K23AR070897 dal NIH per Elena W.Y. Hsieh. Lei era anche supportata da premio numero K12-HD000850 da Eunice Kennedy Shriver National Institute di salute del bambino e lo sviluppo umano e la Lucile Packard Foundation per la salute dei bambini, Stanford CTSA UL1 TR001085 e ricerca di salute dei bambini Istituto della Stanford University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
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