Summary
هنا يصف لنا نهجاً البروتين وحيد الخلية لتقييم المناعة المظهرية والوظيفية (سيتوكين داخل الخلايا التعريفي) تعديلات في عينات الدم كله المحيطية، حلل عبر الخلوي الشامل.
Abstract
السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية. ومن ثم تم قياس مستويات سيتوكين تركيز دراسات متعددة في محاولة لفهم آليات محددة تؤدي إلى انهيار سيلفتوليرانسي والمناعة الذاتية اللاحقة. النهج حتى الآن قد تم استناداً إلى دراسة جانب محدد من الجهاز المناعي (واحد أو بعض أنواع الخلايا أو السيتوكينات)، ولا توفر تقييما شاملا لأمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة. اتباع نهج شامل في خلية واحدة لتقييم إنتاج سيتوكين في عدة مجموعات فرعية في الخلايا المناعية، في سياق "الجوهرية" الخاصة بالمريض البلازما تعميم العوامل، يرد هنا. هذا النهج يتيح رصد النمط الظاهري المناعي الخاصة بالمريض (علامات السطحية) والدالة (السيتوكينات)، أما لأن أصلي "الجوهرية المسببة للأمراض" مرض الدولة، أو في وجود العوامل العلاجية (في فيفو أو السابقين فيفو).
Introduction
أمراض المناعة الذاتية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات التي تؤثر على 3-8 في المائة من السكان. في الولايات المتحدة، اضطرابات المناعة الذاتية من بين الأسباب الرئيسية للوفاة بين الشباب ومتوسطي العمر النساء (الإعمار < 65 سنة)1،2. اضطرابات المناعة الذاتية تتميز بعرض السريرية غير متجانسة والعمليات المناعية الأساسية المتنوعة. كذلك تمثل الطيف من عدم التجانس عبر الاضطرابات المختلفة، مثل مشاركة المشترك في التهاب المفاصل الرثياني (RA) والأمراض العصبية في التصلب المتعدد (MS). ومع ذلك، يتمثل هذا المستوى من عدم التجانس أيضا داخل اضطراب واحد، مثل الذئبة الحمامية الجهازية (SLE): يجوز تقديم بعض المرضى بأمراض الكلي، بينما يعاني الآخرون من مشاركة الدموية أو المشتركة3.
إيمونوباثوجينيسيس الكامنة في اضطرابات المناعة الذاتية مرايا التغايرية السريرية، التي تشمل وفرط-التنشيط التلقائي لعدة مجموعات فرعية الخلايا المناعية الفطرية والتكيف، وإنتاج سيتوكين dysregulated المصاحبة. بينما السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية، فهم دورها المحدد في إليه المرض ثبت أن التحدي. تتميز السيتوكينات pleiotropy (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار متعددة على أنواع مختلفة من الخلية)، التكرار (السيتوكينات متعددة يمكن أن يكون نفس التأثير)، وازدواجية (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار برو أو مكافحة inflammatory تحت ظروف مختلفة)، واللدونه (يمكن أن يكون مصبوب السيتوكينات في دوراً مختلفاً عن واحدة "الأصلي"، اعتماداً على البيئة)4،،من56. ونتيجة لذلك، لا يميز أساليب السكان مستوى الاستجابات الخلوية غير المتجانسة لنفس "سيتوكين الوسط". وبالمثل، لا تقدم تصاميم الدراسة التي تركز على جانب واحد من جوانب محددة في الجهاز المناعي (نوع وحيد الخلية أو سيتوكين)، تقييما شاملا لجميع العناصر المتورطة في أمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة.
مؤخرا، طورنا نهجاً البروتين وحيد الخلية تقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض "الممرضة" بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. سير العمل الموضحة هنا يتسم باستخدام عينات الدم كله الطرفية سليمة، بدلاً من خلايا الدم المحيطية المنعزلة وحيدات النوى (ببمكس). الدم كله هامشية تمثل المركبة الأكثر فسيولوجيا ذات الصلة لدراسة المرض المناعي بوساطة النظامية، بما في ذلك خلايا الدم 1) غير-وحيدات النوى غالباً ما تشارك في أمراض المناعة الذاتية (أي، العَدلات، والصفائح الدموية)، و 2) البلازما تعميم العوامل، مثل الأحماض النووية ومجمعات محصنة السيتوكينات، التي لها أدوار تفعيل المناعة. للقبض "الجوهرية المسببة للأمراض" إنتاج سيتوكين dysregulated، الدم المحيطي معالجة العينات مباشرة بعد سحب الدم (T0، الساعة الصفر)، وبعد ح 6 من الحضانة عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم الفسيولوجية) مع نقل بروتين المانع في غياب أي شرط تحفيز خارجية (T6، ح 6 الوقت)، للكشف عن إنتاج سيتوكين (تراكم، T6-T0) التي تعكس حالة المرض "الجوهرية" (الشكل 1). دراسة العمليات dysregulated التي تعكس مدى أو التنشيط الناقص من إشارات سبل المشاركة في الاستجابات المناعية ذات الصلة بالمرض، وعينات الدم المحيطي تعامل (ح 6 الحضانة عند 37 درجة مئوية مع مثبط نقل بروتين) مع خارجية حفز شرط أن يعكس منشأ المرض، مثل عدد القتلى-مثل-مستقبلات (TLR) يضع في حالة الذئبة الحمامية المجموعية (T6 + R848، الساعة 6 ح مع 1 ميكروغرام/مل R848)، للكشف عن إنتاج سيتوكين التي تعكس استجابة للأحماض النووية (مقارنة T0 مقابل T6 مقابل T6 + R848، الشكل 1). دراسة الآثار إيمونومودولاتوري للعلاجات المتاحة السابقين فيفو، كما أنها تتصل بالعمليات الدقيقة dysregulated المناعة للمرضى محددة، يتم التعامل مع عينات الدم المحيطي مع مثبط جاك في ذات الصلة تكون العلاجية تركيز (هنا، 5 أم روكسوليتينيب؛ T6 + 5R، الوقت ح 6 مع 5 أم روكسوليتينيب)، للكشف عن التغييرات في حالة المرض "الجوهرية" في الاستجابة للدواء (T0 مقابل T6 مقابل T6 + 5R، الشكل 1). وقد اختير مثبط جاك لهذه الدراسة لمثبطات جاك قد ثبت نجاحها في علاج أمراض المناعة الذاتية مثل رع.
في نفس الوقت تقييم dysregulated العمليات الوارد وصفها أعلاه في متعددة الخلايا المناعية مجموعات فرعية، عينات الدم المحيطي من الذئبة الحمامية المجموعية معالجتها كما هو موضح أعلاه وتحليلها بواسطة الخلوي الشامل المرضى وضوابط صحية. الشامل الخلوي، المعروف أيضا قياس الوقت-الطيران، يقدم التحليل خلية واحدة من المعلمات ما يزيد على 40 دون تداخل القضايا الطيفي7،،من89. ويستخدم هذا الأسلوب نظائر المعادن الأرضية النادرة في شكل أيونات المعادن القابلة للذوبان كعلامات ملزمة للأجسام المضادة، بدلاً من فلوروفوريس10. ويمكن الاطلاع على تفاصيل إضافية فيما يتعلق بمنصة تكنولوجية الخلوي الشامل (أي ضبط ومعايرة، والحصول على عينة) في Leipold et al. ومكارثي et al. 11 , 12 العالية-أبعاد للخلوي الشامل تمكن قياس السيتوكينات متعددة في جميع أنحاء الخلية المناعية الفطرية وتكيفية مجموعات فرعية متزامنة مع خلية واحدة الحبوبية (جدول المواد).
معلمات السريرية والمختبرية التقليدية الحالية غالباً ليست حساسة أو محددة بما يكفي للكشف عن نشاط المرض الجارية أو الرد على إيمونومودولاتورس محددة13، مما يعكس الحاجة إلى ترسيم أفضل المناعة الكامنة التغييرات التي تدفع تفجر. نظراً لانتشار التقلبات سيتوكين في أمراض المناعة الذاتية، وقد حشدا نهج العلاج باستخدام الأجسام المضادة أو مثبطات الجزيئية صغيرة تستهدف السيتوكينات أو إشارات البروتينات المشاركة في تنظيم إنتاج سيتوكين ظهرت مؤخرا. في شكله الأساسي، النهج التحليلي الدم المحيطي الموصوفة هنا منبرا لتحديد مجموعات فرعية خلية dysregulated الخاصة بالمريض وإنتاج سيتوكين غير طبيعي في أمراض المناعة الذاتية مع مظاهر جهازية. تسمح هذه المنهجية لتخصيص الخيارات العلاجية كما يمكن التعرف على السيتوكينات dysregulated محددة، ومعاملة محددة يمكن أن تكون خيارات اختبار فيفو السابقين لتقييم قدرتها على إيمونومودولاتي المرض محددة المريض عملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بولاية كولورادو متعددة المؤسسية استعراض المجلس (كوميرب) من جامعة كولورادو. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة أدناه في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم ينص على خلاف ذلك، مع نصائح الماصة التي تمت تصفيتها، وتصفية جميع المواد الكاشفة.
1. إعداد الكواشف لتجهيز الدم كله الطرفية
- تحضير روكسوليتينيب مختبرين الأسهم (10 – 15 ميكروليتر/قنينة للاستخدام مرة واحدة) في 10 ملم بتمييع الكاشف المجففة بالتبريد في [دمس] وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (مخزن في-80 درجة مئوية). الحفاظ على تركيزات [دمس] في جميع الاختبارات بما في ذلك عناصر التحكم أونستيمولاتيد أقل من 0.2 في المائة (المجلد/المجلد).
- إعداد R848 مختبرين الأسهم (10 – 15 ميكروليتر/قنينة للاستخدام الفردي) (ريسيكويمود) في 1 ميكروغرام/ميكروليتر بتمييع الكاشف المجففة بالتبريد في الماء المعقم ككل إرشادات الشركة المصنعة. مخزن في-80 درجة مئوية.
- إعداد lipopolysaccharide (لبس) مختبرين الأسهم (5 ميكروليتر كل قنينة للاستخدام مرة واحدة فقط) في 1 ميكروغرام/ميكروليتر بتمييع الكاشف المجففة بالتبريد في الماء المعقم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. مخزن في-80 درجة مئوية.
- تعد وسائل الإعلام تلوين الخلية (CSM) باستخدام برنامج تلفزيوني وجيش صرب البوسنة 0.5% 0.02% نان3.
- اكتساب وتبقى جاهزة كوكتيل المانع (الوكالة) النقل البروتين (جدول المواد).
- ذوبان الجليد وتمييع في روكسوليتينيب الأسهم قنينة (10 ملم) 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة (1 مم). جانبا في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة.
- ذوبان الجليد وتمييع القنينة R848 الأسهم (1 ميكروغرام/ميليلتر) 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة (0.1 ميكروغرام/ميليلتر). جانبا في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة.
- ذوبان الجليد وتمييع لبس قنينة الأسهم (1 ميكروغرام/ميليلتر) 1: 100 في برنامج تلفزيوني العقيمة (0.01 ميكروغرام/ميليلتر). جانبا في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة.
- قبل الحارة ربمي العقيمة (لا لام الجلوتامين) في حمام مائي القياسية في 37 درجة مئوية (على الأقل 10 دقيقة).
- تمييع المخزن المؤقت ليس/الإصلاح من 1:5 في ddH المصفاة2س (تركيز العامل) في benchtop (لا تحتاج لأن تكون عقيمة).
ملاحظة: 1 مل دم الكامل يتطلب 20 مل تركيز العمل ليسي/إصلاح المخزن المؤقت.- جعل المخزن المؤقت ليس الإصلاح لظروف 5 1 مل من الدم الكامل كل (على الأقل 100 مل). اليكووت 20 مل تركيز العمل ليسي/إصلاح المخزن المؤقت إلى 50 مل الأنابيب المخروطية في المليلتر من الدم كله (إبقاء ليسي/الحل في 37 درجة مئوية حتى اللازمة). تسمية الشروط على أنابيب مخروطية الشكل الذي يحتوي على المخزن المؤقت ليس الإصلاح كما يلي: T0 T6 (الوقت صفر)، + 5R (الوقت ح 6 مع 5 أم روكسوليتينيب)، T6 + R848 (الوقت ح 6 مع 1 ميكروغرام/مل R848)، T6 + T6 من لبس (الوقت ح 6 مع 0.1 ميكروغرام/مل لبس)، (الوقت ح 6).
- جولة التسمية أسفل أنابيب البوليستيرين العقيمة مع قبعات وأنابيب ميكروسينتريفوجي 1 مل مع نفس المصطلحات كما هو الحال في الخطوة 1، 10.
2-تحفيز وتجهيز الدم كله الطرفية (الشكل 1)
- ضع المسمى جولة أسفل البوليستيرين أنابيب من الخطوة 1، 11 (T0، 5R، لبس، T6 + T6، T6 + R848 + T6) على رف.
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية، ما لم يحدد خلاف ذلك في هذا النوع من أنبوب. كاب الأنابيب عند نقل بين هود زراعة الأنسجة وحاضنة للحفاظ على العقم. - إضافة 1 مل من 37 درجة مئوية ربمي (لا لام الجلوتامين) لكل واحدة من هذه الأنابيب (T0، T6 + 5R، لبس، T6 + T6، T6 + R848). عكس أنابيب جمع الدم عدة مرات وإضافة 1 مل دم الكامل لكل أنبوبة "الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات مزيج دقيق مع ربمي (تمييع مع ربمي يمنع التثاقل من الدم أثناء فترة الحضانة ح 6).
- إضافة 10 ميكروليتر من 01:10 روكسوليتينيب T6 + 5R. مزيج دقيق مع ماصة P1000. وضع على رف الأنابيب في الحضانة عند 37 درجة مئوية ويبدأ التوقيت في الحضانة (T = 0).
- عملية العينة T0 كما يلي.
- "الماصة؛" محتويات الأنبوبة T0 في أنبوب مخروطي مسمى الذي يحتوي على 20 مل من 37 درجة مئوية العامل تركيز ليسي/إصلاح المخزن المؤقت. لتحسين استرداد الخلية، شطف الأنبوب مع تركيز العمل ليس إصلاح المخزن المؤقت. مزج بعكس الأنبوبة المخروطية.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لتحلل والتثبيت. بعد التثبيت، القيام بكافة الخطوات اللاحقة في benchtop. الطرد المركزي خلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- صب المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد لتفريق بيليه، ثم ملء المخروطية إلى حجم 15 مل مع برنامج تلفزيوني.
- الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب المادة طافية. تكرار الغسيل PBS (الخطوات 2.4.3–2.4.4) إذا كانت الكريات الحمراء. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المجلس الأعلى للقضاء لتفريق بيليه، ثم نقل إلى الأنبوبة المسماة ميكروسينتريفوجي (الخطوة 1، 11) لتلوين الأجسام المضادة. يأخذ عينة 10 ميليلتر عد الخلايا استخدام العداد الآلي الخلية أو هيموسيتوميتير.
ملاحظة: حيث يتم إصلاح كافة الخلايا في هذه المرحلة، من الضروري لا تشمل صلاحية وصمة عار. - الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية، تاركاً بيليه في ~ 60 ميليلتر من وحدة التخزين المتبقية. إبقاء هذا بيليه على الجليد حتى إكمال تجهيز عينات من الشروط الأخرى.
- عند T = 30 دقيقة، نقل رف أنبوب (الخطوة 2، 3) إلى هود زراعة الأنسجة والقيام بما يلي.
- إضافة 10 ميكروليتر من 0.1 ميكروغرام/ميكروليتر R848 T6 + R848. مزيج دقيق مع ماصة P1000.
- إضافة 10 ميكروليتر من 0.01 ميكروغرام/ميكروليتر لبس T6 + لبس. مزيج دقيق مع ماصة P1000.
- إضافة 4 ميكروليتر من البروتين النقل المانع (الأسهم في 500 X) إلى لبس (ولكن ليس إلى T6 + R848)، T6 + T6 و T6 + 5R، والعودة العينات إلى الحاضنة حتى T = 6 حاء مزيج دقيق مع ماصة P1000 كل ح 2.
ملاحظة: R848 هو مؤثر TLR اندوبلاسميك ويتطلب بالتالي تأخير الزمانية في إضافة مثبط النقل البروتين للسماح بالوصول إلى مستقبلات المستهدفة به.
- عند T = 2 ح، إضافة 4 ميكروليتر من البروتين النقل المانع كوكتيل (الأسهم في 500 X) إلى T6 + R848 الأنبوبة. يخلط جميع العينات ماصة P1000 والعودة على الرف للحاضنة حتى T = ح 6.
- خلط العينات مع P1000 أكثر من مرة واحدة في T = ح 4.
- عند T = 6 ح، عملية T6، T6 + لبس، T6 + R848، و T6 + أنابيب عينات الدم 5R كما هو موضح في الخطوة 2.4 للعينة T0.
- تخزين الكريات الخلية في حجم المجلس الأعلى للقضاء المتبقية في-80 درجة مئوية عملية في تاريخ في مستقبل. وبدلاً من ذلك، انتقل إلى المتوازية وجسم تلطيخ دون تخزين.
3-الرمز الشريطي لتفكيك/إصلاح خلايا الدم
- ذوبان الجليد العينات الثابتة/تفكيك خلية من التخزين-80 درجة مئوية ببطء على الجليد؛ يمكن أن يكون المسمى مع الباركود فريدة كحد أقصى 20 عينة وتجميع باستخدام هذا النظام. تمييع المخزن المؤقت بيرم X barcoding 10 من 01:10 مع برنامج تلفزيوني؛ جعل ما يكفي المخزن المؤقت ل ~ 3 مل كل عينة.
- ملء الحوض غير معقمة واحد مع واحد مع المخزن المؤقت بيرم X barcoding 1 والمجلس الأعلى للقضاء. أضف 1 مل جليد الباردة المجلس الأعلى للقضاء لعينات طازجة المذابة، مزيج دقيق مع ماصة، ونقل إلى أنابيب كل كتلة البوليبروبيلين المسمى مسبقاً.
- يأخذ عينة 10 ميكروليتر عد الخلايا استخدام العداد الآلي الخلية أو هيموسيتوميتير. تطبيع التهم الخلية إلى 1.5 – 2 × 106 خلايا كل عينة في كل أنبوبة الكتلة: إزالة وتجاهل حجم الخلايا الزائدة أعلاه 2 × 106 خلايا.
- الطرد المركزي الخلايا في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المخزن المؤقت بيرم X barcoding 1 مع ماصة متعددة القنوات وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح قبالة المادة طافية.
- خط الأنابيب الكتلة على رف بنفس الترتيب كما هو مبين على مفتاح الرمز الشريطي حتى تطابق العينة مع الرمز الشريطي به. إضافة ميكروليتر 800 1 × المتوازية بيرم المخزن المؤقت ماصة متعددة القنوات لجميع العينات في أنابيب الكتلة دون لمس بيليه الخلية مع نصائح ماصة (لا خلط) الحد من الخسائر في الخلية. جانبا على الرف مع أنابيب الكتلة.
- إزالة 20-من نوع plex Pd المتوازية كيت الأنبوبة شرائط من-20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إضافة 100 ميكروليتر 1 المخزن المؤقت بيرم X barcoding ومزيج دقيق ونقل 120 ميكروليتر من مزيج حراكه الرمز الشريطي في عينات الخلايا المناظرة في أنابيب الكتلة.
- مزيج دقيق من الأقنية ماصة حيث لا يوجد أي تلوث الصليب بين فرادى المراقب عينات. احتضان أنابيب الكتلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للرموز الشريطية لتسمية الخلايا.
- الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية، ثم ريسوسبيند في 1 مل من المجلس الأعلى للقضاء.
- الطرد المركزي وريسوسبيند في المجلس الأعلى للقضاء مرة أخرى كما في الخطوة 3، 8.
ملاحظة: كل عينة يسمى الآن مع باركود فريدة من نوعها، وعلى استعداد لتجميع عينات. - الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. ماصة واحدة واستخدام تلميح نفسه، نقل جميع الخلايا الكريات في ~ 70 – 80 ميكروليتر حجم المتبقية إلى أنبوب البوليستيرين واحد. قم بإخراج طرف ماصة؛ جانبا ماصة واحدة مع هذا التلميح.
- ماصة متعددة القنوات ونصائح جديدة، إضافة ~ 100 ميكروليتر المجلس الأعلى للقضاء لكل أنبوبة الكتلة الأصلي إلى أقصى حد خلية الإنعاش. مع ماصة واحدة مع التلميح الذي كان جانبا، نقل جميع الخلايا الكريات في ~ 100 ميكروليتر حجم المتبقية إلى أنبوب البوليستيرين نفسه.
- أضف المجلس الأعلى للقضاء إلى أعلى قبالة أنبوب البوليستيرين (~ 3 مل). تعيين العد وسجل عدد الخلايا المجمعة الباركود. الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. المضي قدما إلى تلطيخ عينات المراقب في نفس اليوم.
ملاحظة: من الطبيعي أن نتوقع فقدان الخلية ~ 20 – 30% في عملية المتوازية.
4-تلوين للمراقب تفكيك/ثابت خلايا الدم والتحضير لتحليل على صك الخلوي الشامل
ملاحظة: كل 1 X عيار لتلطيخ جسم (1 ميكروليتر من جسم كل 100 ميكروليتر تلطيخ رد فعل)، وعادة ما يمكن وصمة عار 3 – 4 × 106 خلايا. ولذلك، عندما يتم تجميع جميع العينات المراقب في أنبوب واحد، كمية الأجسام المضادة يجب الارتقاء. إذا كان يمكن وصمة عار المراقب عينات مبلغ 20 إلى 30 x 106 خلايا، وكل عيار X 1 3 – 4 × 106 خلايا، العينة المراقب يتطلب فقط من 10 X عيار، مقابل تلطيخ كل عينة على حدة، مما يتطلب كمية X 20 من جسم (1 X الواحدة أنبوب الفردية). ينبغي أن يكون تركيز الضد إلى عدد الخلايا تيتراتيد بعناية لكل جسم الفرد كوكتيل (لم تناقش هنا).
- وصمة عار في الخلايا باستخدام الأجسام المضادة (جدول المواد) لتحريض تلطيخ وسيتوكين السطحية.
- جعل تلطيخ السطح كوكتيل بحساب المبلغ الذي يكون خطأ بيبيتينج المضافة والمحاسبة ل (أيإذا تلطيخ 20 المراقب عينات من 2 × 106 خلايا في كل عينة، 10 X عيار وصمة عار مطلوب؛ وحسابات الحجم النهائي، التعويض عن خطأ بيبيتينج بجعل من 10.5 X تلطيخ الحل النهائي).
- إضافة 10 X قيمة من سطح تلطيخ وحدة التخزين إلى بيليه خلية المراقب. للحد من فقدان الخلية، مع تلميح نفسه، مزيج وقياس حجم البقع السطحية وبيليه الخلية.
- استناداً إلى حجم الخلايا وتلطيخ كوكتيل، إضافة المجلس الأعلى للقضاء إلى وحدة تخزين المصبوغة نهائي من 50 ميكروليتر الواحدة وعدد العينات الخلية (أي، في حالة تشغيل مجموعة من عينات 20، 50 ميكروليتر × 20 = 1 مل). احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحرض عينة كل 15 دقيقة لتشجيع حتى تلطيخ.
- أثناء الاحتضان وصمة عار السطحية، إعداد المخزن المؤقت بيرم/يغسل (جدول المواد) بتمييع 01:10 مع ddH المصفاة2O. تحضير كميات من 2 مل بيرميبيليزيشن، و 5 مل للغسيل. تبقى عند 4 درجة مئوية أو على الجليد.
- أعلى قبالة السطح تلطيخ أنبوب مع المجلس الأعلى للقضاء، وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 نضح المادة طافية. ريسوسبيند العينة المراقب في 2 مل 4 درجة مئوية، 01:10 إضعاف بيرم/يغسل المخزن المؤقت. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة الكامل بيرميبيليزي الخلايا.
- الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية.
- لتلوين داخل الخلايا، اتبع الخطوات المصبوغة مماثلة (وبالنسبة لتلطيخ السطحية). ومع ذلك، استخدام 4 درجات مئوية، 01:10 إضعاف بيرم/يغسل المخزن المؤقت بدلاً من المجلس الأعلى للقضاء جعل إجمالي تلوين وحدة التخزين حتى تظل الخلايا في بيئة بيرميبيليزينج في جميع أنحاء تلطيخ داخل الخلايا.
- إضافة الأجسام المضادة داخل الخلايا كوكتيل إلى السطح الملون وبيرميبيليزيد بيليه الخلية (الخطوات 4.1.2–4.1.17). يصل إجمالي تلوين وحدة التخزين إلى 50 ميكروليتر الواحدة وعدد العينات الخلية. احتضان لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحرض عينة كل 15 دقيقة لضمان حتى تلطيخ.
- خلال تلطيخ داخل الخلايا، إعداد الحل إينتيركالاتور: 900 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني المصفاة + 100 ميكروليتر من المصفاة 16% منهاج عمل بيجين (التركيز النهائي من 1.6% منهاج عمل بيجين) + 0.2 ميكروليتر من 500 أم لصبغ إينتيركالاتور (جدول المواد).
- أعلى مقابل بيليه خلية + جسم داخل الخلايا كوكتيل مع الباردة 01:10 بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
- الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية. أعلى قبالة أنبوب المصبوغة مع المجلس الأعلى للقضاء. عد وسجل عدد الخلايا. الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من محلول إينتيركالاتور من الخطوة 4.9. احتضانها لمالا يقل عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة الالكترود كاملا، أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية (يمكن أن يبقى عينات في حل إينتيركالاتور عند 4 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع واحد قبل تشغيلها على الصك الخلوي الشامل).
- إعداد الخلايا للصك الخلوي الشامل.
- أعلى قبالة الأنبوب مع 3 مل من المصفاة ddH2س، وأجهزة الطرد المركزي في ز 600 x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند الخلايا في 3 مل من المصفاة ddH2"سين تمرير" هذا التعليق من خلال عامل تصفية 100 ميكرومتر إزالة أي الحطام أو المجاميع التي يمكن أن تسد يحتمل أن الصك الخلوي الشامل.
- عد وسجل الترشيح بعد رقم في الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية
- إعداد الحل حبة المعايرة (جدول المواد) باذابته 01:10 في المصفاة ddH2o.
- ريسوسبيند ملطخة الخلايا في الحجم المطلوب من 01:10 إضعاف المعايرة حبة حل لتحقيق تركيز خلية ~ 1 × 106 خلايا/مل.
ملاحظة: CyTOF1 في ميليلتر في الدقيقة 45، المثلى الموصى به 5 × 105 خلايا/مل؛ هيليوس في 30 ميليلتر في الدقيقة، 7.5 × 105 خلايا/مل. - الشروع في تشغيل العينة على صك الخلوي الشامل9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يوضح سير العمل للتحفيز وتجهيز عينات الدم المحيطية، بما في ذلك تخصيص مختبرين عينة الدم، النقل توقيت إضافة عوامل التحفيز، بروتين مثبط كوكتيل، والحضانة مرات حتى تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) والتثبيت. وسيتوقف اختيار عوامل حفز على مسارات الإشارات وسيتوكين التي تستهدف تقييم. على سبيل المثال، تستخدم في البروتوكول هو موضح هنا، يضع TLR لتقييم آليات الاستشعار عن المناعة الفطرية عبر العديد من أنواع الخلايا. الممثل خارج الخلية (لبس، مؤثر TLR4) واندوبلاسميك (R848، مؤثر TLR7/8) وقد تم اختيار يضع. وتشمل الأخرى عوامل حفز Phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) وإيونوميسين (بمايونو)، التي يمكن أن تكون بمثابة تفعيل خلية تي. السيتوكينات محددة يمكن أن تستخدم أيضا تحفيز وكلاء، جنبا إلى جنب مع غيرها المستضدات B و T الخلية المحددة.
وللتدليل على هذا النهج التجريبية المبينة في هذا البروتوكول، الشكل 2و الشكل 3 الشكل 4 إظهار الممثل النتائج المتحصل عليها باستخدام لبس، و R848، وبمايونو تحفيز الظروف. حين لا وصف استخدام بمايونو في البروتوكول، تظهر البيانات في الشكل 3 و رقم 4 إثبات أن أنواع الخلايا المختلفة (وانتقائية) والسيتوكينات المنشط/الناجمين عن استجابة ليضع TLR (لبس و R848) مقابل تي خلية المنشط (بمايونو). نظراً لأن علامات السطحية 26 (جدول المواد) استخدمت لترسيم عدة مجموعات فرعية الخلايا المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، مختلف تي وب، ناغورني كاراباخ، الوحيدات، والخلية الجذعية مجموعات فرعية يمكن في نفس الوقت دراسة داخل عينة واحدة. بالإضافة إلى ذلك، علامات لتنشيط الخلايا المناعية مدرجة أيضا، مثل CD86 أو نظام ايكوس لخلايا ب و PD1 للخلايا T. ممثل محدودة النابضة الاستراتيجية مما يدل على تقييم وحيدات CD14hi يظهر في الشكل 2. ومع ذلك، بمزيد من التفصيل والنابضة الموسعة تي وب، ناغورني كاراباخ، والوحيدات، الجذعية، وخلية جرانولوسيتيك مجموعات فرعية يمكن العثور في أعمالنا المنشورة سابقا في اوجورمان وهسيه وآخرون واوجورمان وكونغ et al. 14 , 15 دون إشراف بالإضافة إلى ذلك، بما في ذلك أساليب التحليل (وليس على سبيل الحصر) أسمائها16، فيسني17و الحمضيات18، فينوجراف19وإكسشيفت20 يمكن استخدامها لتقييم البيانات الخلوي الشامل (عدم ناقش هنا). استخدام وحيدات CD14hi وخلايا CD4 T كمجموعات فرعية الممثل خلية المناعة الفطرية وقابلة للتكيف، تظهر البيانات التي تبين التعريفي سيتوكين داخل هذه أنواع الخلايا في الشكل 3. واختير عدد مختار من السيتوكينات لإظهار أن يدفع R848 بشكل انتقائي إيل-12 (وحدة فرعية p40) ولا MCP1 في CD14hi وحيدات حين لبس (الشكل 3). بمايونو، منشط قوية تي خلية الحث على عدم السيتوكينات في CD14hi وحيدات (الشكل 3) لكن حمل انترفيرون غاما (IFNγ) وعامل نخر الورم ألفا (TNFα) في خلايا CD4 T (الشكل 4). تقنية ناجحة في تحفيز عينة الدم المحيطي وتجهيز سوف تظهر أنماط سيتوكين تعريفية محددة بشروط محفزة ومحصنة ضد مجموعات فرعية، كما يتضح في الشكل 3 و 4 الشكل. لتحليل كامل من السيتوكينات 14 الموصوفة هنا في أنواع الخلايا التقاطها داخل علامات السطحية 26، الرجاء راجع اوجورمان وهسيه et al.، واوجورمان وكونغ et al. 14 , 15
لإظهار كيف يلتقط النهج التجريبية المبينة في هذا البروتوكول "الجوهرية" الدولة المسببة للأمراض الجهازية مرض المناعة الذاتية مثل كما في الذئبة الحمراء بالمقارنة مع إحدى الجهات مانحة صحية، يوضح الشكل 5 التعريفي سيتوكين (Mip1β و MCP1) في CD14hi وحيدات وجدت في الدم المحيطي المريضة عينة فقط (الجزء ب)، في الغياب أي التحفيز خارجية (T6 مقارنة T0). هذه السيتوكينات هي "التضمين/بنسبة" جاك تثبيط العلاج روكسوليتينيب (T6 + 5R مقارنة T6) في الدم المحيطي المريضة عينة فقط (الجزء باء).
رقم 1. سير العمل التجريبي لتحفيز وتجهيز الدم المحيطي للتحليل الخلوي الشامل- البروتوكول لتحلل ربك والتثبيت من أمراض الدم المحيطي جمع العينات التالية مباشرة (T0)، أو بعد ح 6 الحضانة عند 37 درجة مئوية مع مثبط نقل بروتين (الوكالة) وفي غياب أي عوامل خارجية المنشأ (T6)، أو مع لبس (T6 + لبس)، R848 (T6 + R848؛ بروتين النقل المانع الحضانة ح 4 فقط)، أو روكسوليتينيب (T6 + 5R). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. الممثل النابضة استراتيجية لتحديد وحيدات CD14hi. بعد التثبيت وتحلل ربك، الفرد تفكيك/ثابت عينات الخلايا من متبرع سليم كان المراقب، المسمى مع 26 أضداد علامات السطحية، بيرميبيليزيد والملون مع 14 أضداد السيتوكينات (جدول المواد). ويرد الاستراتيجية النابضة محدودة تمثل تحديد وحيدات CD14hi. من اليسار إلى اليمين، هو كل الأرض 2D تمثل مجموعة فرعية من سكان من أصل السكان بوابات (المربع الأزرق) من الأرض 2D فورا إلى اليسار. ويمكن الاطلاع على استراتيجية النابضة موسعة في اوجورمان وهسيه et al.، واوجورمان وكونغ et al. 14 , 15 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. مثال الاستقراء سيتوكين في وحيدات CD14hi بعد التحفيز بلبس، و R848، وبمايونو- إجراء تحليل ممثل الخلوي شامل للدم المحيطي عينات من مانح صحية في وقت صفر (T0)، أونستيمولاتيد (T6)، وفي أعقاب التحفيز مع لبس (T6 + لبس)، R848 (T6 + R848)، ويتم عرض بمايونو (T6 + بمايونو). يتم عرض مثال الاستقراء سيتوكين في وحيدات CD14hi؛ يصور السيتوكينات المحدد مع خصوصية إلى عامل حفز المستخدمة (TLR مؤثر مقابل المنشط الخلية T). ويمكن الاطلاع على البيانات الموسعة لتحريض سيتوكين جميع أنحاء متعددة من مجموعات فرعية الخلايا المناعية تأكدت مع هذا الفريق الضد الخلوي الشامل في اوجورمان وهسيه et al.، واوجورمان وكونغ et al. 14 , 15 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. مثال الاستقراء سيتوكين في تي CD4 الخلايا بعد التحفيز بلبس، و R848، وبمايونو- إجراء تحليل ممثل الخلوي شامل للدم المحيطي عينات من مانح صحية في وقت صفر (T0)، أونستيمولاتيد (T6)، وفي أعقاب التحفيز مع لبس (T6 + لبس)، R848 (T6 + R848)، ويتم عرض بمايونو (T6 + بمايونو). ويرد مثال الاستقراء سيتوكين في خلايا CD4 تي؛ يصور السيتوكينات المحدد مع خصوصية إلى عامل حفز المستخدمة (TLR مؤثر مقابل المنشط الخلية T). ويمكن الاطلاع على البيانات الموسعة لتحريض سيتوكين جميع أنحاء متعددة من مجموعات فرعية الخلايا المناعية تأكدت مع هذا الفريق الضد الخلوي الشامل في اوجورمان وهسيه et al.، واوجورمان وكونغ et al. 14 , 15 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. مثال لتحريض سيتوكين في وحيدات CD14hi من المريض مرض الذئبة الحمامية المجموعية. يرد على تحليل الخلوي شامل ممثل لعينات الدم المحيطي من المانحين صحي (A) والمريض مرض الذئبة الحمامية المجموعية (ب). أمثلة لاستحثاث سيتوكين في وحيدات CD14hi؛ تحديد السيتوكينات مع خصوصية SLE مرض "الجوهرية" المسببة للأمراض عملية (T6) (أي، تحريض MIP1β و MCP1 في مريض الذئبة الحمامية المجموعية فقط)، ويصور أثر روكسوليتينيب إيمونومودولاتور (T6 + 5R). ويمكن الاطلاع على البيانات الموسعة لتحريض سيتوكين جميع أنحاء متعددة من مجموعات فرعية الخلايا المناعية تأكدت مع هذا الفريق الضد الخلوي الشامل في اوجورمان وكونغ et al. 15 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا الرواية، خلية واحدة، نهج البروتين لتقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض "الممرضة" بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. يستخدم هذا الأسلوب الدم كله الطرفية كأداة تحليلية، والخلوي الشامل كأداة لتقييم المناعة الخلوية شذوذ المظهرية والوظيفية. الأسلوب ينطبق بسهولة ل دراسات حقوق الإنسان والفئران21، وهو متوافق مع التحليل الوظيفي المناعة الأخرى، مثل الكشف عن تشوهات مما يشير إلى14.
يجب أن تدرك على عدد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على نجاح هذا الإجراء المستخدم. استناداً إلى تجربتنا، ينبغي تجهيز عينات الدم ضمن ح 2 من جمع لتجنب تحريض الأساس السيتوكينات داخل الخلايا (البيانات لا تظهر). عينات الدم ينبغي أن تبقى في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) بينما تنتظر المعالجة. ويمكن جمع عينات الدم أنابيب في الصوديوم أما الهيبارين أو يدتا، في دون التدخل في الإنزيم وصف. ويعيش ويمكن تقييم التمييز خلية ميتة بالخلوي الشامل باستخدام سيسبلاتين22. ومع ذلك، تم حذف مثل هذا التقييم في البروتوكول، المذكورة أعلاه بافتراض الدم تتم معالجتها فورا (أو ضمن ح 2) بعد جمع. بالإضافة إلى ذلك، حتى ولو، تأخرت في تجهيز العينات، يسمح عدم تجميد لإغفال التمييز لايف/قتيلا. ومع ذلك، نوصي استخدام سيسبلاتين لبقاء التمييز لأي دراسة فيها موت الخلية يمكن أن تؤثر على نتائج تحليل المتلقين للمعلومات.
وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن اختيار دقيق ومعايرة عامل حفز ضروري لتقييم مسارات المناعية المستهدفة/سيتوكين التعريفي. أولاً، ينبغي أن يستند اختيار عامل تحفيز المناعة 1) مسارات تهدف إلى إجراء تقييم، و 2) استهدفت قراءات وظيفية (ما إذا كان يشير إلى إنتاج البروتينات أو سيتوكين). على سبيل المثال، إذا كانت بهدف تقييم تنشيط خلية تي ومختلف المجموعات الفرعية مساعد الخلية (Th) T والتعريفي سيتوكين كل منهما على، بمايونو أو مزيج من مكافحة-CD3/مكافحة-CD28 سيكون شرط محفزة ملائمة. ومع ذلك، إذا كان الهدف لتقييم تفعيل فرعية الوحيدات، مؤثر TLR (أو مجموعة منها) قد يكون من الأفضل. ثانيا، يحتاج تركيز لكل من هذه العوامل محفزة الأمثل للحصول على خلية التنشيط وتحريض سيتوكين، دون تغيير شدة علامات سطح الخلية. استخدام عامل حفز القليل جداً لا تؤدي إلى تفعيل أنواع الخلايا المطلوب وسيتبع لا تحريض سيتوكين، بينما استخدام الكثير سوف يؤدي إلى موت الخلايا المفرط، والتغييرات في المناعة الخليوي علامات السطح أن التعرف على السكان في حالة أونستيمولاتيد لن تكون موجودة في حالة تنشيط. وثالثاً، الحركية للتحفيز أيضا متغيراً هاما. في حين تم نشرة سابقا كإطار زمني تحفيز مثلى لالتقاط القصوى تحريض السيتوكينات برو التحريضية في استجابة إلى ال14،التحفيز TLR23ح 6، تيميبوينت تحفيز مختلفة قد يلزم وكلاء آخرين. وبالمثل، ينبغي أيضا تيتراتيد استخدام أي العقاقير العلاجية في المختبر مع عينات الدم الطرفية بنفس الطريقة كعامل حفز، مع إيلاء اهتمام وثيق لتركيز وتيميبوينت.
في هذا البروتوكول، ونحن استخدام عينات الدم كله طرفية جديدة، كما التعريفي سيتوكين داخل الخلايا (الكشف) أكثر قوة وفعالية عند مقارنتها بعينات cryopreserved. يمكننا وصف في البروتوكول هنا استخدام الدم كله بدلاً من ببمكس، كما يسهم وجود البلازما تعميم العوامل طبيعة الشذوذات المناعية المتصلة بعملية المرض "الجوهرية". قد تتداخل هذه العوامل المتداولة البلازما مع تحفيز الظروف إضافة إلى الدم كله هامشية، مثل إضافة المضادة IgM ومكافحة-مفتش لإشراك مستقبلات الخلية ب، كما أنهم ملزمون بالبلازما تعميم الأجسام المضادة وخلايا الدم الحمراء. ولذلك، اختيار دقيق حفز الشروط عند استخدام الطرفية كل الدم أمر حاسم لنجاح تجربة قراءة الرافضة. استخدام الدم المحيطي كل مزاياهفي فيفو (النظام الأساسي) وعيوب (تدخل عوامل البلازما المتداولة). ومع ذلك، ببمكس تقدم مجموعة مختلفة من "إيجابيات" و "سلبيات." عندما ببمكس جديدة (في مقابل الدم كله) الخضوع للعملية/البروتوكول نفسه ومع التحفيز باستخدام مختلف الوكلاء TLR، لاحظنا نفس "نمط" سيتوكين التعريفي، ولو إلى حجم أقل قليلاً14،23. عقب هذا البروتوكول، استخدام المجمدة ببمكس يؤدي إلى تحريض سيتوكين أقل متانة، ومن ولذلك نود أن نوصي ضد مباشرة مقارنة النتائج من العينات التي تتم معالجتها بعد تجميد تلك معالجة جديدة.
نظراً للتحذير من جديد مقابل العينات المجمدة، وتفضيل استخدام عينات جديدة لنوعية البيانات الأمثل، البروتوكول الموصوفة هنا مناسبة لدراسات مستقبلية الإنسان حيث يتم جمع عينات المرضى على مدى زمني لأشهر وسنوات. يمكن معالجة عينات الدم الطرفية كما هو موضح، وفور وصولها إلى مرحلة تحلل والتثبيت ربك، عينات يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية والملون على دفعات في وقت لاحق. هذا النهج التقني، بينما المفيد للدراسات معظم البشرية، يشكل أيضا تحديا يتمثل في استخدام الأجسام المضادة التي يمكن أن تربط إلى بيفرتون الهدف بعد التثبيت. يسرد الجدول للمواد استنساخ لكل الأجسام المضادة التي تم اختبارها وإثبات تثبيت وظيفة المصبوغة محددة. المتوازية لعينات متعددة (n = 20) يوفر مزايا 1) انخفضت التغير التقني، كما ملطخة عينات متعددة معا في أنبوب واحد، ولذلك إجراء مقارنات للعينات عبر ظروف عادلة متسقة وموثوق بها؛ 2) الحد استخدام مجموع الأجسام المضادة (انظر الفرع 4-1 من البروتوكول)؛ و 3) مخطط المتوازية 6 البلاديوم مختلف النظائر/اختر 3 "يؤدي إلى استبعاد doublets (الخلايا إيجابية بالنسبة للنظائر المشعة البلاديوم أكثر من 4). وتناقش هذه المزايا بالتفصيل في زوندير وفيك et al. 24 بالإضافة إلى ذلك، المتوازية عملية تتطلب أن تكون ثابتة الخلايا، كما أنها بحاجة إلى أن بيرميبيليزيد أقل ما يقال عن الالكترود المتوازية كاشف (البلاديوم النظائر)24. ولذلك، يعيش تلطيخ يتعذر عقب هذا البروتوكول. تجدر الإشارة إلى أن الخلية الحية المتوازية (على عكس الخلية ثابت المتوازية الموصوفة هنا)25،إمكانية26، ولكن تحدد الخلايا في البروتوكول هنا، حيث يمكن تخزينها ومعالجتها دفعة معا.
دفعة تجهيز العينة، بينما المنفعة من حزب عمل والوقت من وجهة نظر الكفاءة، وأيضا تحديات خاصة بها. مع تجهيز الدفعات، هناك حاجة لعملية تطبيع المنسق بعناية. ويمكن معالجة هذا عملية التطبيع في الخطوات المختلفة لسير العمل الخلوي الشامل. أولاً، أن تركيز الأجسام المضادة لعدد الخلايا ينبغي أن تظل متسقة عبر دفعات. وقد وجدنا أن وسيلة فعالة لتحقيق هذا التركز متسقة بالمعايرة 1) حذراً من تركيز الأجسام المضادة لعدد الخلايا، 2) تطبيع عدد الخلايا في كل من العينات التي هي المراقب معا (أي، 1 مليون الخلايا في العينة، لجميع العينات المراقب 20). ثانيا، لحساب الصك إشارة شدة تقلب (أيام مختلفة لضبط ومعايرة واضمحلال الإشارة خلال وقت التشغيل)، عينات ينبغي حراكه وتحليلها على سيتوميتير الشامل مع حلاً حبة تطبيع مناسبة (الجدول المواد)، متبوعاً بملف التطبيع بعد اقتناء البيانات27 (ولكن قبل ديباركودينج). العينات الفردية ديباركوديد بعد أن تم تطبيع المراقب كامل الملف باستخدام الأدوات الموصوفة في زوندير و Finck et al. 24 ثالثا، لحساب يدوي جسم تلطيخ التغير التقني، نوصي بإدراج نموذج "الربط" مع كل مجموعة الرموز الشريطية التي يتم تحليلها لدراسة واحدة، و أي، وعينه واحدة من إحدى الجهات المانحة (الدراسات الإنسانية) و وقد تمت معالجتها بنفس الطريقة كعينات الدراسة الأخرى. يجب أن يتم إنشاء هذه العينة مرة في كمية كبيرة بما يكفي لتوزع في كل مجموعة الرمز الشريطي بتحليل لهذه الدراسة. سيتم استخدام هذه العينات مرساة من كل رمز شريطي لإنشاء معامل للفرق لتصحيح لتقلب إشارة عبر عينات الدراسة لهذا الباركود (أيالربط عينة من الرمز الشريطي 8 ستستخدم لتصحيح التفاوت في الباركود 8).
خطوة التحسين هامة أخرى هي الجمعية العامة الفريق الضد الخلوي الشامل، الذي سيتولى تقييم المجموعات الفرعية ذات الصلة الخلايا المناعية والسيتوكينات. وتشمل بعض المتغيرات الرئيسية في الجمعية العامة الفريق الضد اختيار الحيوانات المستنسخة (تناولها أعلاه)، عيار الأجسام المضادة للإشارات الخلفية الحد الأدنى واختيار الأهداف جسم وقنوات النظائر المشعة على أساس وفرة مستضد وحساسية القناة، " التعويض "إشارة امتداده استناداً إلى شوائب النظائر والأكسدة، وتقلب الكثير جسم الفرد. هذه خطوات التحسين يتم تناولها في مكان آخر28 ولا تدخل في نطاق البروتوكول هو موضح هنا.
استخدام هذا النهج البروتين وحيد الخلية لدراسة الشذوذات المناعية في عينات الدم المحيطي، فمن الممكن تحديد تعمل غير طبيعي للخلايا المناعية مجموعات فرعية، سواء كان السكان تردد اختلافات أو تغيرات في التعبير عن علامات سطح خلية محددة (مثل علامات لتنشيط الخلية). بالإضافة إلى ذلك، من الممكن أيضا لتحديد التشوهات الوظيفية داخل مجموعات فرعية الخلايا المناعية، مثل إطار أو الإفراط في إنتاج السيتوكينات. وأخيراً، عملية مقارنة العينة فورا الثابتة (T0) مقابل الثابتة بعد ح 6 الحضانة دون وكيلاً خارجية (T6) يوضح العمليات المسببة للأمراض "الجوهرية" التي تؤدي إلى تشوهات الخلايا المناعية نوع وسيتوكين (T6-T0). هذا النهج يمكن أن يكون متلائما مع دراسة مجموعة متنوعة من العمليات النظامية بوساطة جهاز المناعة، ومشاركة عدة مجموعات فرعية الخلايا المناعية ومسارات اعتماداً على عامل حفز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر إيمي بوغ برنار لها مساهمات فكرية وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل ووارنج "بوتشير مؤسسة ويب جائزة البحوث الطبية الحيوية" عدد K23-1K23AR070897 من المعاهد الوطنية للصحة لايلينا W.Y. هسيه. كما أيدها عدد جائزة K12-HD000850 من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وولوسيل باكارد لصحة الأطفال، وجامعة ستانفورد كتسا UL1 TR001085، وأبحاث صحة الطفل جامعة معهد ستانفورد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
