Summary
여기 우리 면역 phenotypic와 기능 (세포내 cytokine 유도)를 평가 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 설명 주변 전체 혈액 샘플, 대량 cytometry 통해 분석으로 변경.
Abstract
Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을 한다. 따라서, cytokine 레벨의 측정 self-tolerance 및 후속 면역의 붕괴에 지도 하는 정확한 메커니즘을 이해 하기 위해에서 여러 연구의 초점 되었습니다. 접근은 지금까지 단일 또는 몇 종류 (cytokines), 면역 체계의 특정 한 측면의 연구에 기초를 둔 하 고 복잡 한 자기 면역 질병의 세계적인 평가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다. Cytokine 생산 요인, 순환 하는 "본질적인" 환자 전용 플라즈마의 컨텍스트 내에서 여러 면역 세포 하위 집합에서 평가 하는 포괄적인 단일 셀 접근 방식은 여기에 설명 되어 있습니다. 이 방법은 환자 특정 면역 표현 형 (표면 마커)의 모니터링 가능 및 기능 (cytokines), 그것의 기본에서 "본질적인 병원 성" 질병 상태, 또는 치료제에비보 ( ex vivo)의 존재에.
Introduction
자가 면역 질환의 병 적 상태와 사망률 3-8%의 인구에 영향을 미치는 주요 원인입니다. 미국에서는, 자가 면역 질환에서는 젊은이 중 년 여성 사이에서 죽음의 주요 원인 중 (세 < 65 세)1,2. 자가 면역 질환 임상 유형이 다른 프레 젠 테이 션 및 다양 한 기본 면역 프로세스 특징입니다. 이 성분의 스펙트럼은 류 마티스 관절염 (RA) 공동 참여 및 다 발성 경화 증 (MS)에 신경 질환 등 다른 질환에서 잘 표현 된다. 그러나,이의이 수준은 또한 반성 루 푸 스 (SLE) 등 단일 장애 내 궁 행: 다른 혈액 또는 공동 참여3에서 고통을 하는 동안 일부 환자 신장 병 리, 현재 수 있습니다.
자가 면역 질환에 기본 immunopathogenesis 자동 및 하이퍼-활성화의 여러 하위 집합 타고 난 및 적응형 면역 세포, 및 부수적인 dysregulated cytokine 생산을 포함 하는 임상이 거울. Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을, 하는 동안 질병의 기계 장치에 그들의 특정 역할을 이해 했다 입증 도전. Cytokines는 pleiotropy 특징 이다 (한 cytokine 다른 세포 유형에 여러 효과 가질 수 있습니다), 중복 (여러 cytokines 동일한 효과 가질 수 있습니다), 이중성 (한 cytokine 다른 조건 하에서 프로 또는 안티 inflammatory 효과 가질 수 있습니다), 고 소성 (cytokines에서 그것의 "원래", 환경에 따라 서로 다른 역할에 주조 될 수 있다)4,,56. 따라서, 인구 수준 방법 다른 유형의 세포 응답 같은 "사이토카인 환경"을 구분할 수 없습니다. 마찬가지로, 연구 설계는 단일 셀 형식 (cytokine), 면역 체계의 특정 한 측면에 집중 하는 복잡 한 면역 질환에 관련 된 모든 요소에 대 한 글로벌 평가가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다.
최근에, 우리는 동시에 여러 개의 면역 세포 유형, 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 개발. 여기에 설명 된 워크플로 고립 된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 반대로 그대로 주변 전체 혈액 샘플의 사용에 의해 특징입니다. 주변 기기 전체 혈액 나타냅니다 조직의 면역 중재 질환, 자가 면역 질환 (즉, 중 성구, 혈소판), 및 2) 플라즈마 1) 비-단 혈 자주 참여를 포함 하 여 공부를 가장 순수 관련 차량을 면역 활성화 역할 있다 핵 산, 면역성이 있는 복합물, 및 cytokines, 등의 요소를 순환. 캡처하는 "본질적인 병원 성" dysregulated cytokine 생산, 주변 혈액 샘플 그리고 37의 ° C (생리 적 체온) 단백질 수송에서 외피의 6 h 혈액 무승부 (T0, 시간 제로), 후 즉시 처리 됩니다 cytokine 생산 (축적, T6 T0) "내장" 질병 상태 (그림 1)을 나타내는 것을 검출 하기 위하여 어떤 exogenous 자극 조건 (T6, 시간 6 h), 없을 경우에 억제 물. Dysregulated 프로세스에 반영 하는 신호 경로, 질병에 관련 된 면역 반응에 관련 된 주변 혈액 샘플은 아래의 활성화를 공부 하는 외 인으로 (단백질 수송 억제제와 37 ℃에서 6 h 외피) 치료 cytokine 생산 핵 산에 대 한 응답을 나타내는 것을 감지 하 질병 병 인, SLE (T6 + R848, 1 µ g/mL R848와 h 시간 6)의 경우 수신자 같은 수용 체 (TLR) 촉진제 등을 반영 하는 조건 자극 (T6 대 T6 T0 대 비교 + R848, 그림 1)입니다. 공부 하 고 사용할 수 있는 치료제 비보 전,의 immunomodulatory 효과 특정 환자에 대 한 정확한 면역 dysregulated 프로세스에 관련 된으로, 말 초 혈액 샘플은 JAK 억제제에는 관련 치료와 함께 처리 됩니다. 농도 (여기, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, 시간 6 h 5 uM ruxolitinib), 약물 (T6 대 T6 T0 대 + 5R, 그림 1)에 대 한 응답에서 "내장" 질병 상태에서 변화를 감지 하. JAK 억제제 JAK 저 해제 라스 같은 자가 면역 질환의 치료에 성공 하려면 표시 되었습니다 때문에이 연구에 대 한 선정
동시에 여러 면역 세포의 하위 집합, SLE에서 주변 혈액 샘플에서에서 설명한 dysregulated 프로세스를 평가 하기 위해 환자와 건강 한 컨트롤 위에서 설명한 대로 되었고 대량 cytometry 분석. 대량 cytometry, 일컬어 Cytometry 시간-의-비행, 스펙트럼의 문제7,,89오버랩 없이 단일 세포 분석의 40 개 이상의 매개 변수를 제공 합니다. 이 기술은 항 체, 대신 fluorophores10에 바인딩된 태그로 녹는 금속 이온의 형태에서 희토류 금속 동위 원소를 활용 합니다. 전화 외 에 맥 카시 외. (즉, 튜닝 및 교정, 샘플 수집) 대량 cytometry 기술 플랫폼에 관한 추가 정보를 찾을 수 있습니다. 11 , 12 대량 cytometry의 높은 차원 단일 셀 세분성 (자료 테이블) 타고 난 및 적응형 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 여러 cytokines의 동시 측정을 수 있습니다.
현재 기존의 임상 및 실험실 매개 변수는 종종 나 지속적인 질병 활동 또는 특정 immunomodulators13, 더 나은 기본 면역 윤곽을 그리 다 하는 필요를 반영에 대 한 응답을 탐지 하기 위한 구체적 플레어 드라이브를 변경 합니다. 항 체 또는 작은 분자 억제제 cytokines를 대상으로 또는 단백질 cytokine 생산의 규칙에 관련 된 신호를 사용 하는 치료 접근의 과다는 면역 질환에서 cytokine dysregulation의 보급을 감안할 때, 최근 나왔다. 기본 형식, 여기에 설명 된 주변 혈액 분석 접근 환자 전용 dysregulated 셀 하위 집합 및 그들의 비정상적인 cytokine 생산 조직 발현과 자가 면역 질환에 식별 하기 위해 플랫폼을 제공 합니다. 이 방법을 특정 dysregulated cytokines를 확인할 수 있습니다, 그리고 구체적인 치료 옵션 수 테스트 ex vivo immunomodulate에 그들의 능력을 평가 하기 위해 환자 특정 질병 치료 선택의 개인 설정에 대 한 허용 프로세스입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 여는 콜로라도 여러 기관 검토 위원회 (COMIRB)의 콜로라도의 대학 승인 되었습니다. 필터링 된 피 펫 팁, 명시 되지 않는 한 아래의 모든 설명된 절차 무 균 조직 문화 후드에서 수행 해야 하 고 모든 시 약 필터링.
1. 주변 전체 혈액 처리용 시 약의 준비
- 준비 ruxolitinib 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병) 10 m m (-80 ° C에 게) 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여. 0.2% (vol/vol) unstimulated 컨트롤을 포함 하 여 분석 하는 모든 실험에서 DMSO 농도 유지.
- R848 준비 (resiquimod) 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병)로 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 희석 하 여 1 μ g/μ에는 제조업체의 지시 당. -80 ° c.에 게
- 제조업체 지침에 따라 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여 lipopolysaccharide 1 μ g/μ에서 (LPS) 재고 aliquots (한 시간 전용 유리병 당 5 μ)을 준비 합니다. -80 ° c.에 게
- 셀 얼룩 미디어 (CSM) PBS, 0.5% BSA 0.02% 할머니3를 사용 하 여 준비 합니다.
- 취득 하 고 유지 준비 단백질 수송 억제제 (PTI) 칵테일 (자료 테이블).
- 해 동 하 고 메 마른 PBS (1mm)에 ruxolitinib 재고 유리병 (10mm) 1시 10분 희석. 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.
- 해 동 하 고 희석 R848 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 살 균 PBS에서 1시 10분 (0.1 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.
- 해 동 고는 LPS 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 1: 100 살 균 PBS에 희석 (0.01 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.
- 미리 살 균 RPMI (없음 L-글루타민) (적어도 10 분)에 대 한 표준 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
- 1:5 필터링된 ddH2O (작업 농도)는 벤치탑 (살 균 될 필요 하지 않습니다)에 lyse/수정 버퍼를 희석.
참고: 전체 혈액의 1 mL 20 mL lyse/수정 버퍼의 작업의 필요합니다.- 전 혈 각 (적어도 100 mL)의 1 mL의 5 조건 lyse/수정 버퍼를 확인 합니다. Aliquot 20 mL 전 혈 (계속 필요할 때까지 37 ° C에서 lyse/수정 솔루션)의 밀리 리터 당 50 mL 원뿔 튜브에 lyse/수정 버퍼의 작업 농도의. 라벨을 lyse/수정 버퍼를 포함 하는 것은 다음과 같이 원뿔 관에 조건: T0 (시간 제로), T6 + 5R (시간 6 h 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (1 μ g/mL R848 가진 6 h 시간), T6 + LPS (0.1 μ g/mL LPS와 시간 6 h)에 게, T6 (6 h 시간).
- 레이블은 아래쪽 모자 살 균 폴리스 티 렌 튜브 1 mL microcentrifuge 튜브 단계 1.10에서 동일한 명명법 라운드.
2. 자극과 주변 전 혈 (그림 1)의 처리
- 하단 폴리스 티 렌 튜브 단계의 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 선반에 라운드는 레이블이 배치 합니다.
참고: 다음 단계를 모두 수행 됩니다 튜브의이 종류에서 달리 지정 하지 않는 한. 조직 문화 후드와 불 임을 유지 하기 위해 인큐베이터 간에 전송할 때 튜브를 모자. - 각 튜브 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 37 ° C RPMI (없음 L-글루타민)의 1 mL를 추가 합니다. 반전 혈액 컬렉션 튜브 여러 번, 전체 혈액의 1 mL 각 튜브를 더하고 RPMI 철저 하 게 혼합을 여러 번 위아래 플라스틱 (RPMI와 희석 6 h 잠복기 동안 혈액의 응집 방지).
- 추가 1시 10분의 10 μ T6 + 5R ruxolitinib. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스. 37 ° c 배양 기에서 튜브의 랙을 놓고 시작 시기는 부 화 (T = 0).
- T0 샘플을 다음과 같이 처리 합니다.
- T0 튜브의 전체 내용을 포함 하는 37 ° C 작업 농도 lyse/수정 버퍼의 20 mL 레이블이 원뿔 관으로 플라스틱. 최적화 하려면 세포 복구, 작업 농도 lyse/수정 버퍼 튜브를 헹 구 십시오. 원뿔 튜브를 거꾸로 하 여 혼합.
- 세포의 용 해 및 고정 수 있도록 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 고정, 다음 벤치탑에서 모든 후속 단계를 수행 합니다. 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심
- 상쾌한을 가만히 따르다. Resuspend 셀 헤어 펠 릿, 얼음 차가운 PBS의 1 mL에 다음 PBS에 채워 볼륨 15 mL 원뿔.
- 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 상쾌한을 가만히 따르다. 펠 릿은 빨간색 경우 PBS 세척 (단계 2.4.3–2.4.4)를 반복 합니다. CSM는 펠 릿 헤어 다음 항 체 얼룩이 지기에 대 한 레이블된 microcentrifuge 튜브 (1.11 단계)에 전송의 1 mL에 셀 resuspend 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 10 µ L의 샘플을 가져가 라.
참고: 모든 셀이 시점에서 고정 되어, 이후 아니에요 생존 얼룩을 포함 하는 데 필요한. - 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 잔여 볼륨의 ~ 60 µ L에 펠 릿을 떠나 상쾌한 발음 다른 조건에서 샘플 처리 완료 때까지 얼음에이 펠 릿을 유지.
- T = 30 분, 조직 문화 후드에 튜브 랙 (2.3 단계)를 이동 하 고 다음을 수행.
- 0.1 μ g/μ의 10 μ 추가 T6 + R848 R848. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.
- T6 + LPS를 0.01 μ g/μ LPS의 10 μ를 추가 합니다. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.
- T6, T6 + 5R, 그리고 T6 + LPS (하지만 하지 T6 + R848)의 단백질 수송 억제제 (500 X 주식) 4 μ를 추가 하 고 T까지 인큐베이터에 샘플 반환 = 6 h. P1000 피 펫 마다 2 h와 철저 하 게 혼합.
참고: R848 endoplasmic TLR 길 항 제 이며, 따라서 그 대상 수용 체에 대 한 액세스 수 있도록 단백질 수송 억제제 이외에 일시적인 지연 필요.
- T = 2 h, T6 + R848 단백질 수송 억제 물 칵테일 (500 X 주식)의 4 μ 추가 튜브. 모든 샘플 P1000 피 펫 혼합 및 T까지 인큐베이터에 선반을 반환 = 6 h.
- T에서 한 번 더 한 P1000 샘플 혼합 4 h =.
- T = 6 h 처리 T6, T6 + LPS, T6 + R848, 그리고 T6 + 5R 혈액 샘플 튜브에 설명 된 대로 단계 T0 샘플에 대 한 2.4.
- 미래의 날짜에 처리-80 ° C에서 잔여 CSM 볼륨에 셀 펠 릿을 저장 합니다. 또는, 바코드 및 저장 하지 않고 얼룩이 지는 항 체를 진행 합니다.
3. 바코드 Lysed/고정 혈액 세포의
- 얼음;에 천천히-80 ° C 저장에서 lysed/고정 셀 샘플을 녹여 20 샘플의 최대 고유 바코드와 함께 표시 될 수 있습니다 그리고이 시스템을 사용 하 여 풀링된. 10 X barcoding 페름 버퍼 PBS; 1시 10분으로 희석 샘플 당 ~ 3 mL에 대 한 충분 한 버퍼를 확인 합니다.
- 업체인 CSM와 1 X barcoding 페름 버퍼 하나 한 비 살 균 여 물통을 채우십시오. 얼음의 1 mL을 추가 갓 해 동 샘플, 차가운 CSM 피 펫, 철저 하 게 혼합 하 고 각각 미리 레이블이 지정 된 폴 리 프로필 렌 클러스터 관에 전송.
- 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수는 10 μ 샘플을 가져가 라. 각 클러스터 튜브에서 샘플 당 106 셀 x 1.5-2 셀 카운트 정상화: 제거 하 고 2 x 106 셀 이상 초과 셀의 볼륨을 삭제.
- 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 셀 원심 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기와 멀티 채널 피 펫 1 X barcoding 페름 버퍼의 1 mL에 셀 resuspend 상쾌한에서 발음.
- 정렬 순서에 있는 선반에 클러스터 튜브 샘플의 바코드와 일치 하도록 바코드 키에 표시 된 대로. 피 펫 팁 (아무 혼합) 셀 손실을 줄이기 위해 셀 펠 릿을 건드리지 않고 멀티 채널 피 펫에 의해 클러스터 튜브에서 모든 샘플 바코드 페름 버퍼 X 800 μ 1을 추가 합니다. 랙 클러스터 튜브와 함께 따로 설정 합니다.
- -20 ° C와 실 온에서 해 동에서 20-플렉스 Pd Barcoding 키트 튜브 스트립을 제거 합니다. 1 X barcoding 페름 버퍼의 100 μ를 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 클러스터 튜브에 해당 셀 샘플으로 resuspended 바코드 믹스의 120 μ를 전송.
- 개별적으로 바코드 샘플 사이의 교차 오염 없이 되도록 멀티 채널 피 펫에 의해 철저 하 게 혼합. 셀 라벨 바코드 수 있도록 실 온에서 30 분 동안 클러스터 튜브를 품 어.
- 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 다음 CSM의 1 mL에 resuspend.
- 원심 및 단계 3.8에서 다시 업체인 CSM에 resuspend.
참고: 각 샘플은 이제 고유 바코드 표시 및 샘플 풀링 될 준비가. - 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단일 피 펫과 같은 팁을 사용 하 여, 전송 ~ 70-80에서 모든 셀 펠 릿 한 폴리스 티 렌 튜브에 μ 잔여 볼륨. 피 펫 팁;을 추출 하지 마십시오 단일 피 펫이 팁을 따로 설정 합니다.
- 멀티 채널 피 펫과 새로운 팁, 셀 복구를 최대화 하기 위해 각 원래 클러스터 튜브를 ~ 100 μ CSM을 추가 합니다. 팁을 따로 설정 된 단일 피펫으로 ~ 100 μ 잔여 볼륨에서 모든 셀 쥐 똥 같은 폴리스 티 렌 튜브에 전송할.
- 폴리스 티 렌 튜브 (~ 3 mL)을 가기에 CSM를 추가 합니다. 수와 기록 풀링된 바코드의 셀 번호 설정합니다. 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 같은 날에 바코드 샘플을 얼룩이 지기를 진행 합니다.
참고: ~ 20-30% 셀 손실 barcoding 프로세스에서 기대 하는 정상입니다.
4. 바코드의 얼룩 Lysed/혈액 세포와 분석에 대 한 준비에 고정 대량 Cytometry 악기
참고: 각 1 X titer의 항 체 얼룩이 지기 (100 당 항 체의 1 μ μ 반응 얼룩), 일반적으로 3-4 x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다. 따라서, 모든 바코드 샘플 1 개의 관으로 풀링되지 때 항 체의 양은 조절 해야 합니다. 30 x 106 셀, 고 각 1 X titer 20 바코드 샘플 금액 3-4x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다, 바코드 샘플만 필요 합니다는 10 X titer를, 각 샘플을 개별적으로 얼룩이 반대로 요구 하는 것의 항 체 (1 X 20 X 금액 개별 튜브)입니다. 휴대폰 번호에 항 체의 농도 각 개별 항 체 칵테일 (여기 설명)에 대 한 신중 하 게 적정 수 한다.
- 표면 얼룩 및 cytokine 유도 대 한 항 체 (테이블의 재료)를 사용 하 여 셀을 얼룩.
- 확인 표면 얼룩 칵테일 추가 및 회계 pipetting 오류 수 금액을 계산 하 여 (즉, 각 샘플에 2 x 106 셀의 20 바코드 샘플 얼룩 titer 얼룩 X 10이 필요, 최종 볼륨 계산 보완할 pipetting 오류에 대 한 최종 솔루션 얼룩 10.5 X를 만들기).
- 추가 표면 얼룩 볼륨 바코드 셀 펠 릿을의 가치가 10 배. 같은 팁과 세포 손실을 줄이기 위해 혼합 하 고 표면 얼룩과 셀 펠 릿의 볼륨을 측정 합니다.
- 셀과 칵테일 얼룩의 볼륨에 따라 달라 집니다, 셀 샘플 (즉, 20 샘플, 20 = 1 mL X 50 μ의 집합을 실행 하는 경우) 수 당 50 μ의 최종 착 볼륨에 CSM를 추가 합니다. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 얼룩도 홍보 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.
- 표면 얼룩 인큐베이션 기간 동안 파 마/워시 버퍼 (자료 테이블)에 의해 준비 diluting 1:10 필터링된 ddH2수술 준비 및 볼륨을 permeabilization, 2 mL에 5 mL. 4 ° C에 또는 얼음에 계속.
- 얼룩이 CSM, 튜브 표면에서 탑 그리고 5 분에 4 ° C에서 600 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 발음. 4 ° C, 1시 10분의 2 mL에 바코드 샘플 resuspend 희석 파 마/워시 버퍼. 20-30 분 완전 세포를 permeabilize 4 ° C에서 품 어.
- 5 분 동안 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
- 세포내 얼룩 비슷한 얼룩 단계 (표면 얼룩) 따릅니다. 그러나, 4 ° C, 1시 10분을 사용 하 여 셀에 얼룩이 지는 세포내에 걸쳐 permeabilizing 환경에서 계속 볼륨 얼룩 총 수 있도록 CSM 대신 희석 파 마/워시 버퍼.
- 세포내 항 체 칵테일 표면에 얼룩이 지 고 셀 펠 릿 (단계 4.1.2–4.1.17) permeabilized를 추가 합니다. 볼륨 셀 샘플 수 당 50 μ를 얼룩이 지는 총을 가져와. 4 ° c.에 60 분 동안 품 어 얼룩도 되도록 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.
- 세포내 얼룩 동안 준비 intercalator 솔루션: 필터링 된 PBS + 필터링 된 16%의 100 μ의 900 μ PFA (1.6%의 최종 농도 PFA) + 0.2 μ uM intercalator 염료 (자료 테이블)의 500의.
- 파 마/워시 버퍼 셀 펠 릿 + 세포내 항 체 칵테일 찬 1:10에서 최고.
- 5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. CSM와 얼룩 튜브 떨어져 가기. 계산 하 고 휴대폰 번호를 기록 합니다. 5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단계 4.9에서에서 intercalator 솔루션의 1 mL에 셀 resuspend 완전 윤에 대 한 실 온에서 20 분 이상 incubate 또는 (샘플 intercalator 솔루션에 머물 수 있습니다 4 ° C에서 질량 cytometry 악기에 그들을 실행 하기 전에 최대 1 주) 4 ° C에서 하룻밤.
- 대량 cytometry 악기에 대 한 셀을 준비 합니다.
- 필터링 된 ddH2O 3 mL와 4 ° c.에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기 튜브 끝 잠재적으로 대량 cytometry 악기를 방해할 수 있는 집계 또는 어떤 파편 든 지 제거를 100 μ m 필터를 통해 필터링 된 ddH2O. 전달의 3 mL에 셀이이 정지를 resuspend.
- 계산 하 고 셀 번호 후 여과 기록 합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기
- 1:10 필터링된 ddH2o.에에서 그것을 diluting 하 여 교정 비드 솔루션 (테이블의 자료) 준비
- Resuspend는 스테인드 셀 1시 10분의 필요한 볼륨에 희석 교정 비드 솔루션 1 ~6 셀/10ml x의 세포 농도 달성 하기 위해.
참고: 45 µ L/분에 CyTOF1에 대 한 권장된 최적은 5 x 105 셀/mL; 헬 리오스에서 30 µ L/분, 7.5 105 셀/mL x에 대 한. - 대량 cytometry 악기9에 샘플을 실행 하려면 이동 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1 자극에 대 한 워크플로 보여 줍니다 및 혈액 샘플 aliquots의 할당을 포함 한 주변 혈액 샘플의 처리 자극 에이전트, 단백질의 추가의 타이밍 수송 억제 물 칵테일, 그리고 보육 적혈구 (RBC) 세포 및 고정까지 시간. 자극 제의 선택은 평가 대상 신호 및 cytokine 경로에 따라 달라 집니다. 예를 들어 여기에 설명 된 프로토콜 TLR 촉진제 여러 셀 종류에서 타고 난 면역 감지 메커니즘을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 대표 extracellular (LPS, TLR4 길 항 제) 및 (R848, TLR7/8 주 작동 근) endoplasmic agonists 선정 됐다. 다른 자극 에이전트 Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 등 Ionomycin (PMAIONO), T 세포 활성 제 역할을 할 수 있는. 특정 cytokines 또한으로 사용 될 수 있습니다 자극 하는 대리인, 다른 특정 B와 T 세포 항 원 함께.
이 프로토콜에서 설명 하는 실험적인 접근을 보여 그림 2, 그림 3및 그림 4 LPS, R848, 및 PMAIONO로를 사용 하 여 얻은 대표적인 결과 표시 자극 하는 조건. PMAIONO의 사용은 프로토콜에 설명 되지 않은, 하는 동안 데이터 다른 (및 선택적인) 세포 유형 및 cytokines 활성화/T 대 TLR 촉진제 (LPS 및 R848)에 대 한 응답 유도 설명 하기 위해 그림 3 과 그림 4 에 표시 됩니다. 세포 활성 (PMAIONO). 26 표면 마커 (자료 테이블) 타고 난 및 적응형 면역 세포에 대 한 하위 집합을 여러 구분 사용 되었습니다, 그 다양 한 T, B, NK, monocyte, 및 수지상 세포 부분 집합 수 있습니다 동시에 공부 될 단일 샘플 내에서. 또한, 면역 세포 활성화의 표식 등 CD86 ICOS B 세포 및 T 세포에 대 한 PD1 포함 됩니다. 게이팅 전략 CD14hi monocytes의 평가 보여 주는 제한 된 대표는 그림 2에 표시 됩니다. 그러나, 더 상세 하 고 T, B, NK, monocyte, 수지상, granulocytic 셀 하위 집합의 확장 게이팅 O'Gorman와 셰 외 에 O'Gorman, 홍콩 외. 우리의 이전 간행된 한 일에서 찾을 수 있습니다. 14 , 15 는 또한 분석 방법을 포함 하 여 이른 것 (및에 국한 되지 않음) 삽16, visNE17, 감귤 류18,19, Phenograph 및 Xshift20 대량 cytometry 데이터 (안을 평가 하는데 사용 될 수 있다 토론 여기). 대표 타고 난 및 적응형 면역 세포 하위 집합으로 CD14hi monocytes와 CD4 T 세포를 사용 하 여, 이러한 세포 유형 내의 cytokine 유도 설명 하는 데이터는 그림 3에 표시 됩니다. Cytokines의 선택 번호 R848 IL-12 (p40 소 단위)를 선택적으로 유도 하 고 MCP1 LPS 동안 CD14hi monocytes에 하지 않는 보여 선택 되었다 (그림 3). PMAIONO, 강력한 T 세포 활성 제 CD14hi monocytes (그림 3)에서 cytokines를 유도 하지 않습니다 하지만 인터페론 감마 (IFNγ)와 CD4 T 세포 (그림 4)에 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα) 유도지 않습니다. 그림 3 과 그림 4에서 exemplified 주변 혈액 샘플 자극 및 처리에 성공적인 기술 cytokine 유도 자극 조건 및 면역 하위 집합을 특정의 패턴을 시연할 예정 이다. 26 표면 마커 내에서 캡처한 셀 형식에서 여기 설명 된 14 cytokines의 완전 한 분석을 위해 보십시오 O'Gorman 및 셰 외., 그리고 O'Gorman, 홍콩 외. 14 , 15
이 프로토콜에서 설명 하는 실험적인 접근 SLE 건강 한 기증자에 비교 될 때, 그림 5 에서는 cytokine 유도 같은 조직의 자가 면역 질환의 "내장" 병원 성 상태를 포착 하는 어떻게 설명 하기 (Mip1β 및 MCP1) CD14hi monocytes는 병 주변 혈액 샘플 (B), 없을 경우에의 일부만 (T6에 비해 T0) 어떤 외 인 자극 든 지에에. 이러한 cytokines는 "변조/감소" JAK 억제 치료 ruxolitinib (T6 + 5R T6에 비해)에 병 주변 혈액 샘플만 (B).
그림 1입니다. 자극과 대량 cytometry 분석에 대 한 말 초 혈액의 처리에 대 한 실험 워크플로. RBC 세포 및 질병 주변 혈액 샘플 바로 다음 컬렉션 (T0), 또는 고정 단백질 수송 억제제 (PTI) 모든 세 에이전트 (T6)의 휴무에서 또는 LPS (T6 + LPS), 37 ° C에서 6 h 부 화 후 R848 프로토콜 (T6 + R848; 단백질 수송 억제제 보육 4 h만을 위한), 또는 ruxolitinib (T6 + 5R). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 대표 전략 CD14hi monocytes의 식별을 위한 게이팅. 다음 고정와 RBC 세포, 개별 lysed/고정 셀 샘플 건강 한 기증자 로부터 바코드, 표면 표식에 대 한 26 항 체와 함께 표시, permeabilized 및 cytokines (자료 테이블)에 대 한 14 항 체 물 했다. 제한 된 제어 전략 CD14hi monocytes의 id를 나타내는 표시 됩니다. 왼쪽에서 오른쪽, 대표 각 2 차원 플롯은 부모 인구에서 인구 하위 집합 문이 (파란색 상자) 2D 플롯에서 바로 왼쪽입니다. 확장 된 제어 전략 O'Gorman와 셰 외., 그리고 O'Gorman, 홍콩 외 에서 찾을 수 있습니다. 14 , 15 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. CD14hi monocytes LPS, R848, 및 PMAIONO 자극 다음에 cytokine 유도의 예. 건강 한 기증자 로부터 시간 0 (T0), unstimulated (T6), 및 LPS (T6 + LPS), R848와 자극에 따라 말 초 혈액의 대표적인 대량 cytometry 분석 샘플 (T6 + R848), PMAIONO (T6 + PMAIONO) 표시 됩니다. CD14hi monocytes에 cytokine 유도의 예로 표시 됩니다; 선택한 cytokines 자극 에이전트 사용 (TLR 길 항 제 T 세포 활성 제 대)으로 묘사 된다. 이 대량 cytometry 항 체 패널 확인 하는 여러 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 모든 cytokine 유도 대 한 확장된 데이터 O'Gorman와 셰 외., 그리고 O'Gorman, 홍콩 외 에서 찾을 수 있습니다. 14 , 15 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. LPS, R848, 및 PMAIONO 자극에 따라 세포가 CD4 T에 cytokine 유도의 예. 건강 한 기증자 로부터 시간 0 (T0), unstimulated (T6), 및 LPS (T6 + LPS), R848와 자극에 따라 말 초 혈액의 대표적인 대량 cytometry 분석 샘플 (T6 + R848), PMAIONO (T6 + PMAIONO) 표시 됩니다. CD4 T 세포에서 사이토카인 유도의 예 표시 됩니다; 선택한 cytokines 자극 에이전트 사용 (TLR 길 항 제 T 세포 활성 제 대)으로 묘사 된다. 이 대량 cytometry 항 체 패널 확인 하는 여러 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 모든 cytokine 유도 대 한 확장된 데이터 O'Gorman와 셰 외., 그리고 O'Gorman, 홍콩 외 에서 찾을 수 있습니다. 14 , 15 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. SLE 질병 환자에서 CD14hi monocytes에 cytokine 유도의 예입니다. 건강 한 기증자 (A)와 SLE 질병 환자 (B)에서 주변 혈액 샘플의 대표적인 대량 cytometry 분석 표시 됩니다. CD14hi monocytes;에 cytokine 유도의 예 SLE 질병 "본질적인" 병원 성 과정 (T6)으로 cytokines를 선택 (즉, SLE 환자에서 서만 MIP1β 고 MCP1의 유도), 및 immunomodulator ruxolitinib (T6 + 5R)의 효과가 표시 됩니다. 이 대량 cytometry 항 체 패널 확인 하는 여러 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 모든 cytokine 유도 대 한 확장된 데이터 O'Gorman 및 홍콩 외 에서 찾을 수 있습니다. 15 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기 소설, 단일 셀, proteomic 접근 방식은 동시에 여러 면역 세포 유형을 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하 여 설명 합니다. 이 방법은 분석 차량과 면역 세포 phenotypic와 기능 이상의 평가 위한 도구로 대량 cytometry로 주변 전 혈을 사용합니다. 메서드는 인간과 쥐 연구21, 쉽게 적용 하 고 다른 면역 기능 분석, 감지 신호 이상14등와 호환 되.
사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수 있는 변수의 수의 인식 해야 합니다. 우리의 경험을 바탕으로, 혈액 샘플을 피하기 위해 초기 유도 세포 cytokines (데이터 표시 되지 않음)의 컬렉션의 2 시간 이내 처리 한다. 혈액 샘플 있어야 실내 온도 (25 ° C)에서 대기 하는 동안 처리 합니다. 혈액 샘플을 수집 수 중 나트륨에서 덤플링을 또는 EDTA 튜브, 설명된 분석 결과와 방해 없이. 라이브와 죽은 세포 차별 대량 cytometry cisplatin22를 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 그러나, 이러한 평가 컬렉션 후 혈액은 처리 즉시 (또는 2 h 이내) 가정 위에서 설명한 프로토콜에서 생략 됩니다. 또한, 경우에 샘플 처리에 지연, cryopreservation 부족 라이브/죽은 차별의 누락에 대 한 수 있습니다. 그러나 모든 연구는 세포 죽음 영향을 미칠 수 다운스트림 분석의 결과 대 한 생존 능력 차별 위한 cisplatin 사용 하 여를, 것, 것이 좋습니다.
또한, 우리는 주의 선택과 자극 제의 적정 평가 대상된 면역 경로/cytokine 유도 필수적입니다 나타났습니다. 첫째, 자극 제의 선택 1) 면역에 기반 해야 경로 참여/평가, 고 2) 대상 기능 정보 (여부 신호 단백질 또는 cytokine 생산). 예를 들어 목표 T 세포 활성화와 다른 T 도우미 셀 (Th) 하위 집합 및 그들의 각각 cytokine 유도 평가 한다면, PMAIONO 또는 안티-CD3/안티-CD28의 조합 것입니다 적절 한 자극 상태. 그러나, 만약 목표 monocyte 하위 집합 활성화를 평가 했다, TLR 길 항 제 (또는 그들의 조합) 수 있습니다 최고의. 둘째, 이러한 자극 제의 각 농도 심각 세포 표면 마커를 변경 하지 않고 세포 활성화와 cytokine 유도, 유도를 최적화 해야 합니다. 너무 작은 자극 제의 사용 원하는 셀 형식의 활성화 이어질 하지 것입니다 및 없음 cytokine 유도 관찰 됩니다, 너무 많은의 사용 과도 한 세포 죽음으로 이어질 것입니다 하는 동안 변화는 면역에서 세포 표면 마커 인구 식별 되도록 unstimulated 상태에서 되지 않습니다 자극된 조건에. 셋째, 자극의 속도 중요 한 변수 이기도합니다. 6 h 이전 게시 된 TLR 자극14,23응답에서 프로 염증 성 cytokines의 최대한 유도 캡처하는 데 최적의 자극 기간으로 하는 동안 다른 자극 timepoint 필요할 수 있습니다. 다른 요원입니다. 마찬가지로, 어떤 치료 약물에 생체 외에서 주변 혈액 샘플의 사용 한다 또한 수 적정 자극 에이전트와 동일한 방식으로 집중력과 timepoint에 세심 한 관심을 지불 하는 동안.
이 프로토콜을 사용 하 여 신선한 주변 전체 혈액 샘플, 세포내 cytokine 유도 (및 검출)는 보다 강력 하 고 효과적인 cryopreserved 샘플에 비해. 우리가 설명 프로토콜 여기에 PBMCs, 반대로 전 혈 사용 면역 이상 프로세스와 관련 된 질병의 "내장" 자연에 기여 하는 요소를 순환 하는 플라즈마의 존재 합니다. 이러한 플라즈마 순환 요소를 방해할 수 있습니다 안티-IgM의 추가 등 주변 전체 혈액에 추가 조건 자극 및 안티-IgG B 세포 수용 체 참여로 그들은 플라즈마 항 체와 적혈구 세포 순환에 의해 바인딩됩니다. 따라서,는 자극의 주의 깊은 선택 조건 때 주변 전 혈을 사용 하 여 읽기 성공적인 실험에 대 한 중요 한 사. 주변 전 혈을 사용 하 여 그것의 이점이 (vivo에서 플랫폼) 그리고 단점 (간섭 플라즈마 순환 요인). 그러나 PBMCs "프로"와 "죄수"의 다른 세트를 제공 하는, 때 (전 혈) 반대로 신선한 PBMCs 받을 동일한 과정/프로토콜 및 자극 다른 TLR 에이전트를 사용 하 여, 우리는 약간 낮은 크기14,23에 쓰 신 cytokine 유도의 동일한 "패턴"를 관찰. 이 프로토콜에 따라 냉동된 PBMCs 사용 하 여 덜 강력한 cytokine 감 응 작용, 리드 하 고 따라서 것이 좋습니다 직접 샘플 cryopreservation 그 신선한 처리 후 처리 결과 비교 하는 것에 대 한.
신선한 냉동된 샘플 및 최적의 데이터 품질에 대 한 신선한 샘플의 사용에 대 한 기본 설정의 경고를 감안할 때, 여기에 설명 된 프로토콜은 미래의 인간 연구에 대 한 적합 한 환자 샘플 달에 년의 기간 동안 수집 됩니다. 설명, 말 초 혈액 샘플을 처리할 수 있습니다 고 샘플 수 있습니다-80 ° C에 저장 하 고 나중에 일괄 스테인드 그들은 RBC 세포와 정착 단계에 도달. 이 기술적인 접근 동안 가장 인간 연구에 대 한 유리한 또한 고정 후 대상 epitope에 바인딩할 수 있는 항 체를 사용 하 여의 도전 포즈. 테이블의 재료 테스트 및 특정 얼룩 게시물 고정을 설명 하는 각각 항 체에 대 한 클론을 나열 합니다. 여러 샘플의 바코드 (n = 20) 1의 장점을 제공)로 여러 샘플은 상당히 일관 되 고 안정적인; 따라서 조건에 걸쳐 샘플의 비교를 만드는 1 개의 관에 함께 스테인드 기술 변화를 감소 2) 총 항 체 사용의 감소 (프로토콜 섹션 4.1 참조); 그리고 3) "6 다른 팔라듐 동위 원소/선택 3"의 바코드 체계 남자 (이상 4 팔라듐 동위 원소에 대 한 긍정적인 세포)의 배타에 지도. 이러한 장점은 Zunder 및 Fick 외 에 자세하게 설명 24 또한 barcoding 프로세스 필요 합니다 셀 고정 될 그들은 barcoding 시 (팔라듐 동위) 약24의 윤에 대 한 permeabilized 약간 될 필요가. 따라서, 라이브 얼룩 수행할 수 없습니다이 프로토콜을 다음과 같은. 라이브 셀 (반대로 여기에 설명 된 고정된 셀 바코드) 바코드 가능성25,26, 하지만 여기 프로토콜, 세포 고정 그래서 그들은 저장 될 수 있다 하 고 일괄 처리 함께 주목 한다.
샘플 처리, 노동에서 유리한 반면 배치 및 효율성 관점, 또한 그것의 자신의 도전을. 일괄 처리와 함께 신중 하 게 큐레이터 정상화의 과정에 대 한 필요가 있다. 이 정규화 과정 대량 cytometry 워크플로의 다른 단계에서 해결할 수 있습니다. 첫째, 휴대폰 번호에 항 체의 농도 유지 되어야 한다 일관 된 일괄 처리에서. 우리는 발견이 일관 된 농도 달성 하는 효과적인 방법 1) 주의 적정 항 체 농도 세포 수의 함께 바코드는 샘플의 각각의 셀 번호 2) 정규화 (즉, 1 백만 모든 20 바코드 샘플에 대 한 샘플 당 셀). 둘째, 악기 신호 강도 변화 (다른 요일 조정, 캘리브레이션 및 신호 감퇴 실행된 시간에)에 대 한 계정, 샘플 resuspended 고 해야 적절 한 정규화 비드 솔루션 (테이블 대량 cytometer에서 분석 재료의), 뒤에 파일 정규화 데이터 수집27 후 (하지만 debarcoding 이전). 개별 샘플은 debarcoded Zunder 및 Finck 외 에 설명 된 도구를 사용 하 여 전체 바코드 파일 정규화 된 후 24 세, 수동 항 체 얼룩이 지기 기술 변화에 대 한 계정에 좋습니다 단일 연구, 즉, 하나의 기증자 (인간 연구)에서 단일 샘플에 대 한 분석은 각 바코드 설정 "앵커" 샘플의 포함 및 다른 연구 샘플으로 같은 방식으로 처리 되었습니다. 이 샘플은 충분히 대량 분석 연구에 대 한 각 바코드 세트로 배포에 한 번 생성 되어야 합니다. 각 바코드에서 이러한 앵커 샘플 그 바코드에 대 한 연구 샘플에서 신호 변화에 대 한 해결 하기 위해 분산의 계수를 생성 하는 데 사용 됩니다 (즉, 바코드 8에서에서 앵커 샘플 사용 바코드 8에에서 변화에 대 한 해결 하기 위해).
또 다른 중요 한 최적화 단계는 하위 집합 관련 면역 세포 그리고 cytokines를 평가할 것입니다 대량 cytometry 항 체 패널의 조립 이다. 항 체 패널 어셈블리에 주요 변수 중 일부 포함 (위에서 언급) 클론, 최소한의 배경 신호에 대 한 항 체 titer의 선택, 항 체 대상 및 항 원 풍부 및 채널 감도에 따라 동위 원소 채널의 선택 " 보상 "동위 원소 불순물 및 산화, 그리고 개별 항 체 많은 변화에 따라 신호 유출의 이러한 최적화 단계 다른 해결28 및 하지의 범위 내에서 여기에 설명 된 프로토콜.
주변 혈액 샘플에 면역 이상이 공부 하 고이 단일 셀 proteomic 방식을 사용 하 여, 그것은 면역 세포 하위 집합의 비정상적인 고기 식별 가능 인구 주파수 차이 또는 변경의 식에서 특정 셀 (예: 세포 활성화의 마커) 표면 마커. 또한, 그것은 또한 면역 세포 부분 집합, 밑에 같은 또는 과잉 cytokines의 기능 이상을 확인 가능입니다. 마지막으로, 샘플을 비교의 과정 즉시 고정된 (T0) 고정 대 6 h 후 exogenous 에이전트 (T6) 없이 외피의 면역 세포 유형 및 cytokine 이상 (T6-T0)을 이끌어 내는 "본질적인" 병원 성 프로세스를 보여 줍니다. 이 방법은 수 조직의 면역 중재 프로세스의 다양 한 연구와 여러 면역 세포 하위 집합 및 자극 에이전트에 따라 통로의 약혼에 맞게.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그녀의 지적 입력 및 도움이 의견에 대 한 아미 Pugh-버나드를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 Boettcher 재단 웹 Waring 생명 의학 연구 상 및 수상 수 K23 1K23AR070897는 NIH에서 엘레나 W.Y. 셰에 의해 지원 되었다. 그녀는 또한 어린이 건강, 스탠포드 CTSA UL1 TR001085, 및 아동 건강 연구를 위한 아동 건강 및 인간 개발 및 루 패 커드 재단의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소에서 보너스 번호 K12-HD000850에 의해 지원 되었다 연구소의 스탠포드 대학입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
