Summary
Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.
Abstract
Sitokinler, otoimmün hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sitokin düzeyleri ölçümü bir girişim self-tolerance ve sonraki otoimmünite dökümü yol açan kesin mekanizmalar anlamak için birden fazla çalışmaların odak noktası olmuştur. Yaklaşımlar şu ana kadar belirli bir yönü (tek veya birkaç hücre tipleri veya sitokinler) bağışıklık sisteminin çalışmaya dayanarak ve karmaşık otoimmün hastalık genel bir değerlendirmesini sağlamaz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz. Sitokin üretim faktörleri, dolaşan "içsel" hasta özel plazma bağlamında birden çok alt bağışıklık hücre kümeleri içinde değerlendirmek için kapsamlı bir tek hücreli yaklaşım burada açıklanmıştır. Bu yaklaşım sağlar hastaya özgü bağışıklık fenotip (yüzey işaretleri) izleme ve fonksiyonu (sitokinler), ya da onun yerli "içsel patojenik" hastalık devlet, veya terapötik ajanlar (içinde VIVO veya ex vivo) huzurunda.
Introduction
Otoimmün hastalıklar morbidite ve mortalite nüfusun % 3-8 etkileyen önemli bir nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde önde gelen genç ve orta yaşlı kadınlarda ölüm nedenleri otoimmün hastalıklar arasındadır (Yaş < 65 yaş)1,2. Otoimmün hastalıklar türdeş olmayan klinik sunum ve çeşitli temel immünolojik süreçleri ile karakterizedir. Heterojenite yelpazesi de romatoid artrit (RA) eklem tutulumu ve nörolojik hastalığı multipl skleroz (MS) gibi farklı bozuklukları arasında temsil edilir. Ancak, bu düzeyde heterojen da sistemik lupus eritematozus (SLE) gibi tek bir bozukluğu içinde örneklenir: Diğer hematolojik veya eklem tutulumu3acı çekerken bazı hastalar böbrek patolojisi ile takdim edebilir miyim.
Otoimmün hastalıklar temel immunopathogenesis auto - ve hiper-harekete geçirmek-in birden fazla doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri ve eşlik eden dysregulated sitokin üretim ile ilgili klinik heterojenite yansıtır. Sitokinler otoimmün hastalık patogenezinde önemli rol oynarken, hastalığın mekanizması içindeki belirli rolü anlamak zor olduğu ispatlanmıştır. Sitokinler tarafından Pleiotropi ile karakterize (bir sitokin farklı hücre tipleri üzerinde birden fazla etkileri olabilir), (birden çok sitokinler aynı etkisi olabilir) artıklık, ikilik (bir sitokin pro veya anti inflammatory etkileri farklı koşullar altında olabilir), ve plastisite (sitokinler kalıp içine bir rol farklı ortama bağlı "orijinal" onun bir)4,5,6. Sonuç olarak, nüfus düzeyinde yöntemleri aynı "sitokin ortamın" türdeş olmayan hücresel yanıt ayırt edemez. Benzer şekilde, çalışma (bir tek hücre türü veya sitokin) bağışıklık sisteminin bir belirli konu üzerinde odaklanmak tasarımları, karmaşık otoimmün hastalığı dahil tüm öğeleri genel bir değerlendirmesini sunuyor musunuz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz.
Son zamanlarda, aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak için bir tek hücreli proteomik yaklaşım geliştirdik. Burada açıklanan iş akışı bozulmamış çevre tam kan örnekleri, izole periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) karşı kullanımı ile karakterizedir. Bütün kan periferik sistemik immün aracılı hastalığı otoimmün hastalığı (yani, nötrofiller, trombosit) ve 2) plazma kez dahil 1) Sigara-mononükleer kan hücreleri de dahil olmak üzere, eğitim için en fizyolojik ilgili araç temsil eder. Nükleik asitler, immün kompleksler ve sitokinler, gibi faktörler dolaşan olan bağışıklık aktive rollere sahip. Yakalamak için "içsel patojenik" dysregulated sitokin üretim, periferik kan örnekleri hemen sonra kan alımı (T0, sıfır) ve 6 h, 37 ° c (fizyolojik vücut ısısı) bir protein taşıma ile kuluçka sonra işlenir inhibitörü "içsel" hastalık durumu (Şekil 1) yansıtacak sitokin üretim (birikimi, T6-T0) tespit etmek için herhangi bir eksojen uyarıcı durumu (T6, saat 6 h), yokluğunda. (6 h kuluçka protein taşıma inhibitörü ile 37 ° C'de) üzerinden yansıtmak dysregulated işlemler veya periferik kan örnekleri olan yolları bağışıklık yanıtı hastalığa, ilgili yer işaret altında aktif çalışmaya bir eksojen ile tedavi Nükleik asitler yanıt yansıtacak sitokin üretim algılamak için geçiş ücreti-gibi-reseptör (TLR) agonistler SLE (T6 + R848, zaman 6 1 µg/mL ile R848 s), söz konusu olduğunda gibi hastalık patogenezinde yansıtır koşulu uyarıcı (T0 vs T6 vs T6 karşılaştırma + R848, Şekil 1). Onlar kesin bağışıklık dysregulated işlemler için belirli hasta ilgilendirmeyen olarak kullanılabilir therapeutics ex vivo, etkileri immunomodulatory eğitim için periferik kan örnekleri bir JAK inhibitörü ile ilgili, terapötik değerlendirilir konsantrasyonu (burada, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, süre 5 ile 6 h uM ruxolitinib), "iç" hastalık durumunda ilaç (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Şekil 1) karşılık olarak değişiklikleri algılamak için. JAK inhibitörleri gibi ra otoimmün hastalıkların tedavisinde başarılı olduğu gösterilmiştir çünkü bir JAK önleyici bu çalışma için seçildi
Aynı anda birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri, SLE periferik kan örnekleri yukarıda açıklanan dysregulated işlemleri değerlendirmek için hasta ve sağlıklı kontrol yukarıda açıklandığı gibi işlenen ve kitle sitometresi tarafından analiz. 7,8,9spektral konularda örtüşme olmadan kitle sitometresi, olarak da bilinen sitometresi-zaman--uçuş, 40'tan fazla parametreleri tek hücre analizi sunmaktadır. Bu tekniği nadir toprak metal izotoplar çözünür metal iyonları şeklinde Etiketler antikorlar, fluorophores10yerine bağlı olarak kullanır. Kitle sitometresi teknolojik platform (Yani, ayar ve kalibrasyon, örnek alma) ile ilgili ek ayrıntılar bulunabilir Leipold vd ve McCarthy vd. 11 , 12 yüksek-boyutluluk kitle sitometresi, tek hücreli taneciklik (Malzemeler tablo) ile aynı anda birden fazla sitokinler doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri boyunca ölçümü sağlar.
Geçerli geleneksel klinik ve laboratuvar parametreleri hassas veya devam eden hastalık aktivitesi veya belirli immunomodulators13daha iyi temel bağışıklık betimlemek gerek yansıtan, cevaben algılamak için belirli genellikle değildir flare-up sürücü değişiklikleri. Sitokin bozukluk kapitalistleri otoimmün hastalığı göz önüne alındığında, antikorlar veya sitokinler hedefleme veya sinyal proteinleri sitokin üretiminin yönetmelikte yer alan küçük moleküler inhibitörleri kullanın tedavi yaklaşımları bir bolluk var Son zamanlarda ortaya çıkan. Temel biçimiyle, burada açıklanan periferik kan analitik yaklaşım hastaya özgü dysregulated hücre alt kümeleri ve anormal sitokin üretim sistemik bulgular ile otoimmün hastalık tanımlamak için bir platform sağlar. Bu metodoloji tedavi seçenekleri kişiselleştirme için belirli dysregulated sitokinler belirlenebilir ve spesifik tedavi seçenekleri olabilir onların yetenek-e doğru immunomodulate değerlendirmek için ex vivo hasta belirli hastalık test sağlar işlem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada Colorado birden çok kurumsal İnceleme Kurulu (COMIRB tarafından), Colorado Üniversitesi onaylanmış olması. Aşağıdaki tüm açıklanan yordamlar steril doku kültürü mahallede, filtre uygulanmış pipet ipuçları ile belirtilmedikten gerçekleştirilmesi gereken ve tüm reaktifler filtre.
1. hazırlanması reaktifler periferik tam kan işleme için
- Ruxolitinib hisse senedi aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 10 mM üretici yönergelerine (mağaza-80 ° c) göre DMSO içinde reaktif lyophilized sulandrarak hazırlayın. DMSO konsantrasyonu % 0,2 (vol/vol) aşağıda unstimulated denetimleri de dahil olmak üzere tüm deneyleri unutmayın.
- R848 hazırlamak (resiquimod) stok aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 1 μg/μL steril su lyophilized reaktif sulandrarak tarafından üretici yönergelerine başına. Mağaza-80 ° C'de
- Lipopolysaccharide (LPS) hisse senedi aliquots (sadece bir süre için şişe başına 5 μL) 1 μg/μL, steril su üretici talimatları uyarınca lyophilized reaktif sulandrarak hazırlayın. Mağaza-80 ° C'de
- PBS, % 0.5 BSA ve %0.02 NaN3kullanarak hücre boyama medya (CSM) hazırlayın.
- Alacak ve protein taşıma inhibitörü (PTI) kokteyl (Tablo reçetesi) hazır tutun.
- Çözülme ve ruxolitinib hisse senedi flakon (10 mM) 1: 10'steril PBS (1 mM) oranında seyreltin. Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.
- Çözülme ve R848 hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1:10 steril PBS seyreltik (0,1 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.
- Çözülme ve LPS hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1: 100 steril PBS içinde seyreltik (0.01 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.
- Steril RPMI (yok L-glutamin) bir standart 37 ° C su banyosu (için en az 10 dk) önceden ısıtmak.
- 1:5 filtre uygulanmış GKD2O (çalışma konsantrasyonu) (steril olması gerekmez) benchtop tarafından lyse/düzeltme arabellek sulandırmak.
Not: tam kan 1 mL 20 mL çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek gerektirir.- Parçalayıcı/düzeltme arabellek tam kan her (en az 100 mL), 1 ml 5 koşulları için yapmak. Lyse/düzeltme arabellek çalışma konsantrasyonu tam kan (keep lyse/düzeltme çözüm gerekinceye kadar 37 ° C'de) mililitre başına 50 mL konik tüpler içine aliquot 20 mL. Aşağıdaki gibi koşullar/düzeltme arabellek içeren konik tüpler koşullara etiket: T0 (zaman sıfır), T6 + 5R (zaman 5 ile 6 h uM ruxolitinib), T6 + R848 (zaman 6 h ile 1 μg/mL R848), T6 + LPS (zamanla 6 h 0,1 μg/mL LPS), T6 (6 h zaman).
- Etiket yuvarlak kapaklar ile alt steril polistren tüpler ve 1 mL microcentrifuge tüpleri ile adım 1,10 olduğu gibi aynı adlandırma.
2. stimülasyon ve periferik tam kan (Şekil 1) işlenmesi
- Etiketli alt polistren tüpler adım 1,11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) bir raf üzerinde yuvarlak yerleştirin.
Not: Aşağıdaki adımların tümünü Aksi belirtilmediği sürece bu tür tüp içinde gerçekleştirilir. Tüpler doku kültürü hood ve kısırlık korumak için inkübatör transfer ederken kap. - 37 ° C RPMI (yok L-glutamin) 1 mL tüpler (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) için ekleyin. Kan toplama tüp birkaç kez ters çevir, her tüpün tam kan 1 mL ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kez RPMI ile iyice karıştırın (RPMI ile seyreltme engeller kanı 6 h kuluçka döneminde topaklanma).
- 1:10 10 μL eklemek ruxolitinib T6 + 5R. P1000 pipet ile iyice karıştırın. 37 ° C'de kuluçka tüpler rafa yerleştirin ve kuluçka zamanlama başlar (T = 0).
- T0 örnek aşağıdaki gibi işlem.
- T0 tüp tüm içeriğini 37 ° C çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabelleği 20 mL içeren etiketli bir konik tüp pipette. Hücre kurtarma en iyi duruma getirmek için çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek ile tüp durulayın. Konik tüp ters çevirme karıştırın.
- Lizis ve fiksasyon için izin vermek 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Fiksasyon, benchtop, tüm sonraki adımları uygulayın. 500 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak. Buz soğuk PBS Pelet kadar kırmak için 1 mL hücrelerde resuspend sonra konik bir 15 mL birime PBS ile doldurun.
- 500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant dikkatle boşaltmak. Granül kırmızı PBS yıkama (adımları 2.4.3–2.4.4) işlemini yineleyin. CSM Pelet kadar kırmak, sonra antikor boyama için etiketli microcentrifuge tüp (adım 1.11) aktarmak için 1 mL hücrelerde resuspend. Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 µL örnek almak.
Not: tüm hücreleri bu noktada sabitlenir beri bu canlılığı leke eklemek gerekli değildir. - 500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Pelet rezidüel hacim ~ 60 µL içinde bırakarak süpernatant, Aspire edin. Diğer koşullar örnekleri işlem tamamlanıncaya kadar bu pelet buz üzerinde tutun.
- 30 dk, T = tüp raf (adım 2.3) doku kültürü hood taşımak ve aşağıdakileri gerçekleştirmek.
- 0,1 μg/μL 10 μL eklemek R848 T6 + R848. P1000 pipet ile iyice karıştırın.
- 0,01 μg/μL LPS 10 μL T6 + LPS ekleyin. P1000 pipet ile iyice karıştırın.
- Protein taşıma inhibitörü (500 X hisse senedi) 4 μL eklemek T6, T6 + 5R ve T6 + LPS (ama değil T6 + R848) ve örnekleri için kuluçka T kadar dönmek 6 h. Mix P1000 pipet her 2 h ile iyice =.
Not: R848 bir endoplasmic TLR agonist ve bu nedenle onun hedef reseptör erişimi için izin vermek için protein taşıma inhibitörü eklenmesi geçici gecikmeden gerektirir.
- 2 h, T = 4 μL protein taşıma inhibitörü kokteyl (500 X hisse senedi) eklemek T6 + R848 tüp. Tüm örneklerini P1000 pipet ile karıştırın ve raf için kuluçka T kadar dönmek 6 h =.
- Örnekleri ile bir P1000 t bir kez daha karıştırın 4 h =.
- T = 6 h, proses T6, T6 + LPS, T6 + R848 ve T6 + 5R kan örnek tüpler açıklandığı gibi adım 2.4 T0 örnek için.
- Hücre topakları kalan CSM birim gelecekteki bir tarihte işlemeye-80 ° C'de depolayın. Alternatif olarak, barkod ve antikor depolamadan boyama devam edin.
3. kan hücrelerinin Lysed/Sabit barkod
- Buz üzerinde yavaş yavaş-80 ° C depodan lysed/sabit hücre örnekleri çözme; en fazla 20 örnekleri ile benzersiz barkod etiketli ve bu sistemi kullanarak havuza alınmış. 1:10 PBS ile 10 X barcoding perma arabellek seyreltik; ~ 3 mL örnek başına için yeterli arabellek olun.
- Bir non-steril yalak CSM ve 1 X barcoding perma arabellek ile doldurun. Buz 1 mL ekleyin taze çözülmüş örnekleri, soğuk CSM bir pipet ile iyice karıştırın ve transfer için ilgili önceden etiketli Polipropilen küme tüpler.
- Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 μL örnek almak. 1,5-2 katı örnek her küme tüp başına 106 hücre hücre sayısı normale: kaldırmak ve 2 x 106 hücre yukarıda aşırı hücre hacmi atın.
- 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. 1 X barcoding perma arabelleği bir çok kanallı pipet ve oda sıcaklığında 5 min için 600 x g, santrifüj ile 1 mL hücrelerde resuspend. Süpernatant Aspire edin.
- Küme tüpler aynı sırada bir raf üzerinde barkod anahtar örnek onun barkod ile eşleşecek şekilde gösterildiği gibi hizalayın. Barkodlama perma arabellek X 800 μL 1, hücre kaybı azaltmak pipet uçları-(asla karıştırma) ile hücre Pelet dokunmadan küme tüpler tüm örnekleri tarafından çok kanallı pipet ekleyin. Raf kümesi tüp ile bir kenara.
- -20 ° C ve çözülme oda sıcaklığında 20-plex Pd barkodlama Kit tüp şeritler kaldırın. 1 X barcoding perma arabelleği 100 μL eklemek, iyice karıştırın ve karşılık gelen hücre örnekleri küme tüpler içine resuspended barkod karışımı 120 μL transfer.
- Böylece hiçbir çapraz bulaşma ayrı ayrı barkodlu örnekleri arasında çok kanallı pipet tarafından iyice karıştırın. Küme tüpler hücreleri etiketlemek barkodlar izin vermek için oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin, sonra 1 mL CSM resuspend.
- Santrifüj kapasitesi ve CSM içinde tekrar adım 3.8 olduğu gibi resuspend.
Not: Her örnek şimdi benzersiz bir barkod ile etiketlenir ve örnekleri havuza alınmış hazır. - 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Tek bir pipet ve aynı ucu kullanarak, tüm hücre topakları ~ 70 – 80 aktarım μL kalan birime bir polistren tüp. Değil pipet ucu dışarı atmak; Bu uç ile tek pipet kenara.
- Bir çok kanallı pipet ve yeni ipuçları, ~ 100 μL CSM hücre kurtarma en üst düzeye çıkarmak için her özgün küme tüp ekleyin. Bir kenara koyun ucu tek pipet ile aynı polistren tüp ~ 100 μL artık birimdeki tüm hücre topakları aktarın.
- CSM polistren tüp (~ 3 mL) kapalı dön ekleyin. Sayısı ve kayıt havuza alınan barkod hücre sayısını ayarlayın. 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Aynı gün barkodlu örnekleri boyama için devam edin.
Not: ~ 20-%30 hücre iletişim kesilecek barkodlama sürecinde normaldir.
4. boyama barkodlu Lysed/kan hücreleri ve analiz için hazırlık kitle sitometresi araç üzerinde sabit
Not: antikor boyama her 1 X titresi (antikor 100 başına 1 μL tepki boyama μL), genellikle 3-4 x 106 hücre leke olabilir. Ne zaman tüm barkodlu örnekleri bir tüpün içine birikmiş, bu nedenle, antikor miktarı ölçekli olmalıdır. 20 barkodlu örnekleri tutarı 30 x 106 hücreler ve her 1 X titresi için 3-4 x 106 hücre leke olabilir, barkodlu örnek, ancak bir antikor (başına 1 X 20 X miktarda gerektiren tek tek, her örnek boyama aksine bir 10 X titresi, gereksinimi bireysel tüp). Cep numarası için antikor konsantrasyonu (burada tartışılan değil) her bireysel antikor için kokteyl dikkatle titre.
- Antikorlar (Tablo reçetesi) kullanarak hücre yüzey boyama ve sitokin indüksiyon için leke.
- Yüzey boyama kokteyl tutarın eklendi ve muhasebe için pipetting hata olmasını hesaplayarak yapmak (yani, 2 x 106 hücre her örneğinde, 20 barkodlu örnekleri boyama 10 X titresi leke ise gerekli son hacim hesaplamaları için; Pipetting hata için bir 10,5 X son çözüm boyama yaparak telafi etmek).
- 10 X barkodlu hücre Pelet birime boyama yüzey ekleyin. Aynı ucu hücre kaybı azaltmak için mix ve yüzey lekeleri ve hücre Pelet sesini ölçmek.
- Hücrelerin ve kokteyl boyama birimde dayanarak, CSM sayısına göre hücre örnekleri (el 20 örnekleri, X 20 = 1 mL 50 μL çalışsayani) 50 μL son boyama hacmi ekleyin. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama tanıtmak için tahrik.
- Yüzey leke kuluçka sırasında O. Prepare birimleri için permeabilization 2 mL ve 5 mL yıkama sulandrarak 1:10 süzülmüş GKD2perma/yıkama arabellek (Tablo reçetesi) hazır olun. 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.
- CSM ile tüp boyama yüzey kapalı üst ve vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj süpernatant Aspire edin. Barkodlu örnek 4 ° C, 1:10 2 mL resuspend seyreltme perma/yıkama arabellek. 20-30 dk tam hücreleri permeabilize 4 ° C'de kuluçkaya.
- 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
- Hücre içi boyama için (gelince yüzey boyama) benzer boyama adımları izleyin. Ancak, 4 ° C, 1:10 kullanın seyreltme perma/yıkama arabellek CSM cilt hücreleri, hücre içi boyama boyunca permeabilizing bir ortamda kadın boyama toplam yapmak yerine.
- Hücre içi antikor yüzeye kokteyl lekeli ve hücre Pelet (adımları 4.1.2–4.1.17) permeabilized ekleyin. Hücre örnekleri sayısı başına 50 μL birime boyama toplam getir. 4 ° C'de 60 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama emin olmak için tahrik.
- Hücre içi boyama sırasında hazırlamak enterkalatörün çözüm: filtre uygulanmış PBS + filtre uygulanmış %16 100 μL 900 μL PFA (son konsantrasyonu % 1.6 PFA) + 0.2 μL 500 enterkalatörün boya (Tablo malzemeler), uM.
- Kapalı hücre Pelet + hücre içi antikor soğuk 1:10 ile kokteyl perma/yıkama arabellek üst.
- 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. CSM ile boyama tüp kapalı üst. Saymak ve telefon numarası kaydedebilirsiniz. 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. 1 mL enterkalatörün çözeltisi adım 4,9 hücrelerde resuspend. Tam enterkalasyon için oda sıcaklığında en az 20 dk için kuluçkaya, veya bir gece 4 ° c (enterkalatörün çözüm örnekleri 4 ° C'de onları kitle sitometresi araç üzerinde çalıştırmadan önce 1 hafta kalabilir).
- Hücreleri toplu sitometresi enstrüman için hazırlayın.
- «Ana sayfa» kapalı süzülmüş GKD2O 3 mL ve 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj tüpü Filtre uygulanmış GKD2O. geçmek 3 mL hücrelerde bu süspansiyon herhangi bir enkaz veya potansiyel olarak kitle sitometresi enstrüman yapışmasına neden toplamları kaldırmak için 100 mikron filtre resuspend.
- Say ve hücre sayı sonrası filtrasyon kaydetmek. 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj
- 1:10 süzülmüş GKD2O. sulandrarak kalibrasyon boncuk çözüm (Tablo reçetesi) hazırlamak
- Lekeli resuspend 1:10 gerekli cilt hücrelerinde hücre konsantrasyonu 106 hücre/mL x 1 ~ ulaşmak için kalibrasyon boncuk çözüm seyreltilmiş.
Not: 45 µL/min bir CyTOF1 için önerilen optimum 5 x 105 hücre/mL olduğunu; 30 µL/dk, 7.5 x 105 hücre/mL Helios için. - Kitle sitometresi enstrüman9tarihinde örneği çalıştırmak için devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İş akışı uyarılması için Şekil 1 gösterir ve kan örnek aliquots, tahsisi de dahil olmak üzere periferik kan örnekleri işleme zamanlama stimülasyon ajanlar, protein ek taşıma inhibitörü kokteyl ve kuluçka kez kırmızı kan hücresi (RBC) lizis ve fiksasyon kadar. Seçtiğiniz uyarıcı ajanlar bir değerlendirmesi için hedeflenir sinyal ve sitokin yollar bağlı olacaktır. Örneğin, burada açıklanan protokolünde TLR agonistler doğuştan gelen bağışıklık algılama mekanizmaları birden çok hücre tipleri arasında değerlendirmek için kullanılır. Temsilcisi ekstraselüler (LPS, TLR4 agonist) ve endoplasmic (R848, TLR7/8 agonist) agonistler seçildi. Diğer uyarıcı ajanlar Phorbol 12-Myristate 13-asetat (PMA) ve Ionomycin (PMAIONO), T hücre aktivatörler hareket edebilir içerir. Belirli sitokinler olarak da kullanılabilir aracıları, belirli diğer B ve T hücre antijenleri ile birlikte uyarıcı.
Bu protokol için açıklanan deneysel yaklaşım göstermek için LPS, R848 ve PMAIONO olarak kullanarak elde temsilcisi sonuçları Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4 göstermek koşulları uyarıcı. PMAIONO kullanımı iletişim kuralında açıklanmayan iken, Şekil 3 ve Şekil 4 farklı (ve seçici) hücre tipleri ve sitokinler aktif/indüklenen TLR agonistler (LPS ve R848) bir T karşı yanıt olarak göstermek için veri gösterilir hücre harekete geçirmek (PMAIONO). Verilen bu 26 yüzey işaretleyicileri (Tablo reçetesi) birden çok doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri ayırma için kullanılan çeşitli T, B, NK, monosit ve dendritik hücre alt kümeleri aynı anda tek bir örnek içinde okudu. Ayrıca, bağışıklık Hücre aktivasyonu işaretleri de CD86 veya ICOS için B hücreleri ve T hücreleri için PD1 gibi yer almaktadır. Bir temsilci CD14hi monosit değerlendirilmesi gösteren strateji çoğunluğuna sınırlı Şekil 2' de gösterilmiştir. Ancak, daha ayrıntılı ve genişletilmiş T, B, NK, monosit, dendritik ve Granülositik hücre alt kümeleri çoğunluğuna O'Gorman ve Hsieh vd ve O'Gorman ve Kong vd. önceden yayınlanmış çalışmalarda bulunabilir 14 , 15 Ayrıca, denetimsiz analiz yöntemleri de dahil olmak üzere (ve bunlarla sınırlı olmamak üzere) SPADE16, visNE17, narenciye18, Phenograph19ve Xshift20 kitle sitometresi verileri (değil değerlendirmek için kullanılabilir burada tartışılan). CD14hi monosit ve CD4 T hücreleri temsilcisi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri olarak kullanarak, veri sitokin indüksiyon bu hücre türleri içinde gösteren Şekil 3' te gösterilmektedir. Sitokinler belirli bir sayıda R848 seçmeli olarak indükler IL-12 (p40 alt birimi) ve MCP1 CD14hi monosit LPS süre içinde does değil göstermek için seçildi (Şekil 3). PMAIONO, güçlü T hücre harekete geçirmek CD14hi monosit (Şekil 3) sitokinler teşvik değil ama interferon Gama (IFNγ) ve tümör nekrozis faktör alfa (TNFα) CD4 T hücreleri (Şekil 4) neden. Periferik kan örnek stimülasyon ve işlem başarılı teknik desen sitokin indüksiyon uyarıcı koşulları ve bağışıklık alt kümeleri, özel Şekil 3 ve Şekil 4olarak gösterecektir. 26 yüzey işaretleri içinde yakalanan hücre tipleri burada açıklanan 14 sitokinler tam analiz için lütfen bkz: O'Gorman ve Hsieh vd.ve O'Gorman ve Kong vd. 14 , 15
Nasıl bu iletişim kuralında tanımlanan deneysel yaklaşım sistemik otoimmün hastalık "içsel" patojenik durumunu yakalar gibi sağlıklı bir donör karşılaştırıldığında SLE içinde Şekil 5 sitokin indüksiyon göstermektedir göstermek için (Mip1β ve MCP1) içinde CD14hi monosit bölümünde hastalıklı periferik kan örnek tek (B), yokluğunda (T6 karşılaştırıldığında T0 için) herhangi bir eksojen stimülasyon bulundu. Bu sitokinler "modülasyonlu/JAK inhibisyon terapi ruxolitinib (T6 + 5R T6 için karşılaştırıldığında) tarafından hastalıklı periferik kan örnek tek (bölümünde B) azalma".
Şekil 1. Deneysel iş akışı stimülasyon ve kan periferik kitle Sitometresi Analizi için işlenmesi için. R848 protokol RBC lizis ve fiksasyon hastalığı periferik kan örnek hemen aşağıdaki toplama (T0) veya 6 h kuluçka 37 ° C'de eksojen herhangi bir ajan (T6) yokluğunda bir protein taşıma inhibitörü (PTI) veya LPS (T6 + LPS), sonra (T6 + R848; protein taşıma inhibitörü kuluçka için 4 h sadece), ya da ruxolitinib (T6 + 5R). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Temsilcisi CD14hi monosit tanımlaması için strateji geçişi. Fiksasyon ve RBC lizis, bireysel lysed/hücre örnekleri sağlıklı donörün barkodlu, yüzey işaretleyicileri karşı 26 antikor taşır, permeabilized ve sitokinler (Tablo reçetesi) karşı 14 antikorlar ile lekeli edildi sabit. CD14hi monosit kimliği temsil eden sınırlı gating strateji gösterilir. Soldan sağa, temsil her 2D bir nüfus alt üst nüfus üzerinden (mavi kutu) 2D çizim hemen sola geçişli komplodur. Genişletilmiş bir perdeleme strateji bulunabilir, O'Gorman ve Hsieh vdve O'Gorman ve Kong vd. 14 , 15 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Örnek stimülasyon LPS, R848 ve PMAIONO takip CD14hi monosit sitokin indüksiyon. Periferik kan temsilcisi kitle Sitometresi Analizi örnekleri donörden sağlıklı zaman sıfır (T0), unstimulated (T6) ve ardından stimülasyon ile LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848) ve PMAIONO (T6 + PMAIONO) gösterilir. Bir örnek sitokin indüksiyon CD14hi monosit olarak gösterilir; Seçili sitokinler kullanılan uyarıcı Aracı (TLR agonist T hücre harekete geçirmek vs) özgüllük ile tasvir edilir. Bu kitle sitometresi antikor paneliyle tespit birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri arasında tüm sitokin indüksiyon için genişletilmiş veri bulunabilir, O'Gorman ve Hsieh vd.ve O'Gorman ve Kong vd. 14 , 15 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Örnek sitokin indüksiyon CD4 t hücreleri stimülasyon LPS, R848 ve PMAIONO ardından. Periferik kan temsilcisi kitle Sitometresi Analizi örnekleri donörden sağlıklı zaman sıfır (T0), unstimulated (T6) ve ardından stimülasyon ile LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848) ve PMAIONO (T6 + PMAIONO) gösterilir. Sitokin indüksiyon CD4 T hücrelerinde örneği gösterilmiştir; Seçili sitokinler kullanılan uyarıcı Aracı (TLR agonist T hücre harekete geçirmek vs) özgüllük ile tasvir edilir. Bu kitle sitometresi antikor paneliyle tespit birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri arasında tüm sitokin indüksiyon için genişletilmiş veri bulunabilir, O'Gorman ve Hsieh vd.ve O'Gorman ve Kong vd. 14 , 15 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. SLE hastalığı hasta örnek sitokin indüksiyon CD14hi monosit içinde. Bir temsilcisi kitle Sitometresi Analizi sağlıklı donör(a)ve SLE hastalığı hasta (B) periferik kan örnekleri gösterilir. CD14hi monosit sitokin indüksiyon örnekleri; Seçili sitokinler SLE hastalığı "içsel" patojenik işlemi (T6) özgüllük ile (yani, MIP1β ve MCP1 indüksiyon SLE hastada sadece), ve tasvir Immünomodülatör ruxolitinib (T6 + 5R) etkisi. Bu kitle sitometresi antikor paneliyle tespit birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri arasında tüm sitokin indüksiyon için genişletilmiş veri-ebilmek bulunmak O'Gorman ve Kong vd. 15 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada biz bir roman, tek hücreli, proteomik yaklaşım aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak açıklar. Bu yöntemi periferik tam kan analitik araç ve toplu sitometresi bağışıklık hücresel fenotipik ve fonksiyonel anormallikler değerlendirilmesi için araç olarak kullanır. Yöntem insan ve fare çalışmaları21' e kolayca uygulanabilir ve sinyal anormallikler14algılama gibi diğer bağışıklık fonksiyonel analiz ile uyumludur.
Kullanıcı bu yordamı başarısını etkileyen değişkenleri bir dizi haberdar olmalıdır. Bizim deneyime dayalı, kan örnekleri içinde 2 h hücre içi sitokinler (veri gösterilmez) temel indüksiyon önlemek koleksiyonunun işlenmesi gerektiğini. Kan örnekleri (25 ° C) Oda sıcaklığında beklerken işleme kalmalıdır. Kan örnekleri toplanan her iki sodyum heparin veya EDTA, açıklanan tahlil ile müdahale olmadan tüpler. Canlı ve ölü hücre ayrımcılık sisplatin22kullanarak toplu sitometresi tarafından değerlendirilir. Ancak, bu tür değerlendirme kan hemen (veya 2 h içinde) işlenir toplandıktan sonra varsayarak yukarıda açıklanan protokolündeki atlandı. Ayrıca, örnekleri işleme geciktiğini bile, dondurma eksikliği canlı/ölü ayrımcılık ihmal için sağlar. Sisplatin kullanıma canlılığı ayrımcılık hücre ölümü, aşağı akım analiz sonucunu etkileyebilecek herhangi bir çalışma için öneriyoruz.
Buna ek olarak, dikkatli seçimi ve titrasyon uyarıcı Aracısı hedeflenen bağışıklık yolları/sitokin indüksiyon değerlendirmek için gerekli olduğunu bulduk. İlk olarak, teşvik edici ajan seçiminde 1) bağışıklık dayanması gerektiğini yolları meşgul/değerlendirmek amacıyla ve 2) hedef fonksiyonel dökümanları (sinyal proteinleri veya sitokin üretim olsun). Amaç T Hücre aktivasyonu ve farklı T yardımcı hücresi (Th) alt kümelerini ve onların anılan sıraya göre sitokin indüksiyon değerlendirmek için örneğin, PMAIONO veya anti-CD3/anti-CD28 kombinasyonu uygun bir uyarıcı durumu olurdu. Eğer amaç monosit alt etkinleştirme değerlendirmek için ancak, TLR agonist (veya bunların bir kombinasyon) en iyisi olabilir. İkinci olarak, her bu teşvik edici ajanların konsantrasyon Hücre aktivasyonu ve sitokin indüksiyon, ciddi bir şekilde hücre yüzey işaretleyicileri değiştirmeden temin için optimize edilmiş olması gerekir. Çok az teşvik edici ajan kullanımı istenilen hücre tipleri harekete geçirmek yol değil ve hiçbir sitokin indüksiyon, süre çok fazla kullanımı aşırı hücre ölümüne yol açacak ve nüfus tespit öyle ki bağışıklık değişiklikler yüzey işaretleyicileri hücre tespit edilecektir unstimulated durumda uyarılmış durumda mevcut olmayacaktır. Üçüncü olarak, stimülasyon kinetik da önemli bir değişkendir. 6 h TLR stimülasyon14,23yanıt olarak pro-inflamatuar sitokinlerin maksimal indüksiyon yakalamak için en iyi stimülasyon süre olarak daha önce yayımlanmış olan iken, farklı stimülasyon timepoint için gerekli olabilir diğer ajanlar. Benzer şekilde, vitro periferik kan örnekleri ile herhangi bir tedavi edici ilaç kullanımı da aynı şekilde tahrik edici ajan olarak konsantrasyon ve timepoint yakın ilgi ödeme yaparken titre.
Bu protokol için hücre içi sitokin İndüksiyon (ve tespiti) daha güçlü ve etkili cryopreserved örnekleri için karşılaştırıldığında olan taze periferik tam kan örnekleri, biz kullanın. Gibi faktörler dolaşan plazma varlığını hastalık süreciyle ilgili bağışıklık bozuklukları "içsel" doğası katkıda bulunur burada iletişim kuralında tam kan PBMCs, aksine nasıl kullanılacağını açıklar. Bu plazma dolaşan faktörler ile girişime neden olabilir anti-IgM eklenmesi gibi periferik tam kan eklenen koşullar uyarıcı ve anti-B hücre reseptörü girişme dolaşan antikorları ve kırmızı kan hücrelerinin plazma tarafından bağlılar olarak IgG. Bu nedenle, bütün kan periferik kullanarak başarılı deneme okumak için çok önemli olduğunda uyarıcı dikkatli seçimi koşulları çıkışları. Periferik tam kan (in vivo platformu) avantajları kullanıp (sokan plazma dolaşımdaki faktörler) dezavantajları. Ancak, PBMCs "Profesyoneller" ve "cons." farklı bir dizi teklif Ne zaman aynı işlemi/iletişim kuralı (aksine tam kan) taze PBMCs geçmesi ve farklı TLR ajanlar kullanarak stimülasyon ile biz bir biraz daha az büyüklüğü14,23de olsa sitokin indüksiyon, aynı "desen" gözlenen. Bu iletişim kuralı, ardından dondurulmuş PBMCs kullanımı daha az sağlam bir sitokin indüksiyon yol açar ve bu nedenle doğrudan taze dondurma bu ile işlenen sonra işleme örnekleri sonuçlarını karşılaştırarak karşı tavsiye ederim.
Bilmeniz gereken, taze donmuş numuneler ve taze örnekler kullanımı için en uygun veri kalitesi için tercih karşı göz önüne alındığında, burada açıklanan yıl ay için bir süre üzerinden hasta numuneleri nerede toplanan potansiyel insan deneyleri için uygun iletişim kuralıdır. Periferik kan örnekleri açıklandığı gibi işlenebilir ve bir kez onlar uzanmak RBC lizis ve fiksasyon sahne, örnekleri-80 ° C'de saklanabilir ve toplu olarak daha sonra lekeli. Bu teknik yaklaşım, en insan çalışmaları için avantajlı iken de hedef epitope fiksasyon sonra bağlayabilirsiniz antikorları kullanarak bir meydan okuma teşkil etmektedir. Malzemeler tablo klonlar için test edilmiş ve belirli boyama sonrası fiksasyon göstermek ilgili antikorlar listeler. Barkodlama birden çok örnekleri (n = 20) 1 avantajları sunar) birden fazla örnekleri bu nedenle karşılaştırma örneklerinin koşulları oldukça tutarlı ve güvenilir; yapma birlikte bir tüp içinde lekeli gibi teknik değişkenliği, azalma 2) azaltma antikor toplam kullanım (protokol bölümüne 4.1 bakın); ve 3) 6 farklı Paladyum izotoplar/se├ºin"3" barkodlama düzeninin birini (hücreleri için 4'ten fazla Paladyum izotoplar pozitif) dışlanması yol açar. Bu avantajları Zunder ve Fick vd ayrıntılarıyla ele alınmıştır 24 hafif barkodlama reaktif (Paladyum izotopları)24enterkalasyon için permeabilized gerekir gibi Ayrıca, barkodlama süreci hücreleri sabit olabilir gerektirir. Bu nedenle, Canlı Boyama bu protokol sonrası gerçekleştirilemez. Bu canlı hücre barkodlama (aksine Sabit hücre barkodlama burada açıklanan) bir olasılık25,26yaşında, ama burada protokolünde, öylesine onlar-ebilmek var olmak stok ve toplu işi birlikte işlenen hücreleri sabit olması gerekmektedir.
Örnek, avantajlı bir emek işleme toplu iş ve verimlilik açısından zaman, aynı zamanda kendi sorunları vardır. Toplu işleme ile bir dikkatle küratörlüğünde normalleştirme işlemi için bir ihtiyaç vardır. Bu normalleştirme işlemi kitle sitometresi iş akışının farklı adımları ele alınması. İlk olarak, cep numarası için antikor konsantrasyonu toplu işlemleri arasında tutarlı tutulmalıdır. Biz bu tutarlı toplama ulaşmak için etkili bir yol 1) dikkatli titrasyon cep numarası için antikor konsantrasyon ve 2) cep numarası barkodlu birbirine olan örneklerin her normalleştirme tarafından (yani, 1 milyon olduğunu bulduk Tüm 20 barkodlu örnekleri için örnek başına hücre). İkinci olarak, enstrüman sinyal şiddeti değişkenlik ayarlama, kalibrasyon ve sinyal çürüme (farklı gün) çalışma süresi içinde hesaba katan örnekleri olmalı resuspended ve uygun normalleştirme boncuk çözümünü (tablo ile kitle sitometresi üzerinde analiz malzemelerin), ardından dosya normalleştirme veri edinme27 sonra (ama önce debarcoding). Tüm barkodlu dosya Zunder ve Finck vd içinde açıklanan araçları kullanarak normalleştirilmiş sonra bireysel debarcoded olduğu 24 üçüncü olarak, teknik değişkenlik boyama el ile antikor için hesap için tek bir çalışma, yani, bir donör (insan çalışmaları) tek bir örnek için analiz edilir her barkod kümesi ile bir "çapa" örnek eklenmesi önerilir ve diğer çalışma örnekleri aynı şekilde işlenmiştir. Bu örnek çalışma için analiz her barkod kümesi içine dağıtılmak üzere kadar büyük miktarda bir kez oluşturulmalıdır. Bu çapa örnekleri her barkod Bu barkod için çalışma örnekleri arasında sinyal değişkenliği için düzeltmek için farkı katsayısı oluşturmak için kullanılan (yani, barkod 8 örnekten çapa kullanılacak barkod 8 değişkenlik için düzeltmek için).
Diğer önemli optimizasyon adım ilgili bağışıklık hücre alt kümeleri ve sitokinler değerlendirecek kitle sitometresi antikor panel montaj olduğunu. Bazı anahtar değişkenler antikor panel montaj dahil (yukarıda ele) klon, antikor titresi en az arka plan sinyal için seçimi, antikor hedefleri ve izotop kanalları antijen bereket ve kanal duyarlılık, dayalı seçim" tazminat"sinyal yayılma izotop kirlilik ve oksidasyon ve bireysel antikor çok değişkenlik dayalı. En iyi duruma getirme adımları başka bir yerde ele alınmaktadır28 ve burada açıklanan protokol kapsamında değil.
Nüfus sıklığı farklılıkları veya değişiklikleri ifadesi olup periferik kan örneklerinde bağışıklık anormallikler eğitimi için bu tek hücreli proteomik yaklaşımı kullanarak, bu bağışıklık hücre alt kümeleri, anormal fenotipleri tanımlamak mümkündür belirli hücre yüzey işaretleri (örneğin Hücre aktivasyonu işaretleri). Ayrıca, bağışıklık hücre alt kümeleri, tür olarak altında veya aşırı sitokinler içinde işlevsel anormallikleri tanımlamak mümkündür. Son olarak, örnek karşılaştırılması işlemi hemen sabit (T0) sabit karşı 6 h sonra kuluçka eksojen ajanı (T6) olmadan bağışıklık hücre türü ve sitokin anormallikler için (T6-T0) kurşun "içsel" patojenik işlemleri gösterir. Bu yaklaşım sistemik immün aracılı işlemler çeşitli çalışma ve birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri ve yollar stimülasyon Ajan bağlı olarak angajman için uygun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Aimee Pugh-Bernard onun fikri girdi ve yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Boettcher Vakfı Webb Waring Biyomedikal Araştırma Ödülü ve Ödülü K23-1K23AR070897 arasında sayı NIH Elena W.Y. Hsieh tarafından desteklenmiştir. O da ödül sayısı çocuk sağlığı ve insan gelişimi ve Lucile Packard Vakfı tarafından K12-HD000850 Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı, Stanford CTSA UL1 TR001085 ve çocuk sağlığı araştırma için destekli yapıldı. Enstitüsü Stanford Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
