Summary
Ici, nous présentons un protocole de détails les aspects techniques et des exigences essentielles pour assurer l’analyse de séquence génique IG robuste chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC), basé sur l’expérience accumulée de l’initiative européenne de recherche sur CLL (ERIC).
Abstract
Durant la maturation des lymphocytes B, le complex processus de recombinaison de V (D) J immunoglobuline (IG) gène couplé avec le hypermutation somatique (SHM) donne lieu à une séquence unique d’ADN dans chaque cellule individuelle de la B. Puisque B cellules malignes résultent de l’expansion clonale d’une seule cellule, les gènes IG représentent une signature moléculaire unique commune à toutes les cellules malignes dans un patient individuel ; ainsi, les réarrangements génétiques IG peuvent être utilisés comme marqueurs clonales. En plus d’être un important identificateur clonal, la séquence du gène IG peut agir comme un « scénario moléculaire » puisqu’elle est associée à des stades de développement spécifiques et donc reflète l’histoire de la cellule B impliquée dans la transformation néoplasique. En outre, pour certaines tumeurs malignes, en particulier leucémie lymphoïde chronique (LLC), la séquence du gène IG détient des capacités pronostiques et prédictifs potentiellement. Cela dit, en extrapolant à partir des conclusions significatives de l’analyse de séquences de gènes IG serait impossible si les outils et méthodes robustes n’étaient pas disponibles pour aider à leur analyse. Cet article, s’appuyant sur la vaste expérience de l’Initiative européenne de recherche sur les CLL (ERIC), les détails les aspects techniques et les exigences essentielles nécessaires pour fiable et reproductible IG gène le séquençage en CLL, un test qui est maintenant recommandé pour tous les patients atteints de LLC avant le traitement. Plus précisément, les différentes étapes d’analyses sont décrites allant de l’identification du réarrangement génique clonotypiques IG et la détermination de la séquence nucléotidique de l’interprétation clinique précise les données de séquence de gène IG.
Introduction
Leucémie lymphoïde chronique (LLC), la forme la plus courante de la leucémie chez l’adulte dans les pays occidentaux, se caractérise par l’expansion clonale de cellules de B néoplasiques mature1. D’un point de vue clinique, l’évolution de la maladie est extrêmement variable avec certains patients touchés par une maladie agressive, nécessitant un traitement très tôt après le diagnostic et souvent récurrente ou d’être réfractaire au traitement. Ceci est en contraste frappant avec une proportion importante de patients (environ 30 %) qui présentent une maladie indolente, jamais nécessitent un traitement et ont une espérance de vie similaire aux individus de même âge en bonne santé2. Cette hétérogénéité clinique se reflète dans la diversité des anomalies moléculaires dans les patients atteints de LLC qui conduisent au bout du compte la pathogenèse et l’évolution de cette maladie3.
Établir qu'un diagnostic précis de la CLL est généralement simple, cependant, l’hétérogénéité clinique susmentionnée peut entraver la gestion efficace des patients atteints de LLC et souligne la nécessité pour les marqueurs pronostiques et prédictifs pouvant aider à traitement décisionnel2. De nombreuses études ont tenté d’affiner le pronostic de la LLC, qui a abouti à une abondance de nouveaux marqueurs cliniques et biologiques étant proposé4. Le statut mutationnel du gène clonotypiques immunoglobuline lourd variable (IGHV) est l’un des marqueurs pronostiques plus robustes en CLL, largement dû au fait que (i) elle reste stable dans le temps et que la maladie progresse, et (ii) il est indépendant des autres 5de paramètres cliniques et biologiques. Que malgré tout, des marqueurs très peu, voire aucune, y compris le statut mutationnel IGHV, sont actuellement appliquées en routine clinique au moment du diagnostic.
Des rapports initiaux sur l’utilité clinique du séquençage des gènes IG dans datent CLL dès 1999, lorsque 2 études indépendantes ont indiqué que les patients avec no ou une charge minimale hypermutation somatique (SHM) (CLL unmutated, LLC-U) ont un pronostic plus mauvais que les patients portant un charge supérieure de SHM (muté CLL, LLC-M)6,7. Plus précisément, le groupe de U-CLL comprenait des cas contenant les gènes IGHV clonotypiques avec peu ou pas de SHM et donc une forte identité pourcentage au gène IGHV de la lignée germinale plus proche (≥ 98 %), tandis que M-CLL se composait des cas avec une charge plus élevée de mutational (pourcentage identité à la gène IGHV plus proche germline < 98 %). Depuis ces premières études, on a sans cesse démontré que des cas de U-CLL affichent un court temps-à-premier traitement (TTFT) et la survie globale (OS) par rapport à M-CLL.
Avec le recul, ces études séminales a mis en évidence le rôle essentiel du récepteur des cellules B (BcR) IG en biopathologie CLL, ouvrant ainsi la voie pour des recherches approfondies sur les relations CLL-micro-environnementales qui, à son tour, conduit à une compréhension plus approfondie des l’hétérogénéité biologique de cette maladie8,9. Des études plus récentes ont fourni un appui supplémentaire de l’importance des analyses immunogénétiques en CLL en révélant que des cas individuels peuvent regrouper en sous-ensembles en raison de partage (Quasis) séquences identiques du gène BcR IG, un phénomène appelé stéréotypie BcR IG10 ,11,12,13. Accumulant la preuve appuie l’idée que les patients assignés aux même sous-ensemble stéréotypés harbor clinicobiologique des propriétés semblables qui les séparent clairement d’autres patients atteints de LLC au sein de la même catégorie SHM mais avec différentes séquences de gènes IG ; Il a en effet été signalé que la catégorisation des patients atteints de LLC basée sur la stéréotypie BcR IG plus raffine la ségrégation en vrac des patients atteints de LLC en U-CLL ou M-CLL groupes14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
D’un point de vue clinique, il convient de noter que le statut SHM du gène IGHV clonotypiques semble corréler avec une réponse spécifique à la chimio. Chez M-CLL particulier, traités avec une combinaison de fludarabine/cyclophosphamide/rituximab (FCR), le traitement de l’étalon-or pour les patients atteints de LLC médicalement apte, dépourvu de défauts de gène TP53 , exposées sans progression significativement plus survie (PFS) et OS que U-CLL chez les patients qui ont reçu le même traitement21,22,23. Par conséquent, identification de l’État SHM est devenu importante en particulier pour aider à la prise en charge thérapeutique du CLL patients c'est-à-dire un marqueur prédictif, plutôt que pour l’évaluation de l’évolution clinique de la maladie c'est-à-dire, une marqueur pronostique. En effet, selon la récente mise à jour des directives de l’International Workshop on CLL parrainé par le NCI, le statut SHM des gènes réarrangés IGHV devrait être déterminé dans tous les cas CLL avant le début du traitement dans les deux omnipraticiens et clinique essais24. En outre, en raison de la récente approbation d’agents de traitement novateur et le nombre croissant de médicaments dans les essais, le statut SHM de la molécule d’IG peut jouer un rôle encore plus dans la prise en charge thérapeutique des patients atteints de LLC dans le futur proche5.
Ce rapport détaille tous les aspects de l’analyse de séquence du gène IG, commençant par le choix du matériau approprié et culminant avec l’interprétation clinique, les résultats de séquençage. Une évaluation approfondie de ces étapes est importante dans le diagnostic de routine pour la production de résultats fiables tout en assurant précise stratification patiente dans les essais cliniques. Protocoles sont présentés afin d’aider à l’harmonisation de l’analyse de séquence du gène IG, assurant ainsi que les résultats soient comparables entre les différents laboratoires.
Protocol
Le protocole de recherche a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Institut scientifique San Raffaele, Milan, Italie.
1. matériau sélection
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Choix de la matière première
Remarque : Dans la plupart des cas du CLL le nombre de cellules de tumeur est élevé au moment du diagnostic (> 80 à 90 %). Ainsi, cellule de tri ou de l’enrichissement des cellules leucémiques n’est généralement pas nécessaire.- Si vous utilisez du sang périphérique (PB), le plus commun matériau de choix pour l’analyse de séquences de gènes IG, utiliser un volume de sang entre 10-20 mL.
- Sinon, dans les cas avec une faible charge de cellule CLL, utiliser cellule Tri des échantillons de PB ou de la matière provenant d’autres tissus, comme la moelle osseuse (BM) ou les ganglions lymphatiques (LN).
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Temps d’échantillonnage
- Échantillonnage temps n’est pas cruciale étant donné que le statut de SHM IG est stable heures supplémentaires ; Cela dit, éviter d’échantillonnage à certaines périodes, comme immédiatement après ou pendant le traitement, étant donné le faible nombre de cellules CLL peut compliquer l’analyse et aboutir à des résultats peu fiables.
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Stockage et collecte de matériel
NOTE : Collecte et stockage de matière première dépend fortement du choix du matériau.- Pour les échantillons de PB ou BM, utiliser EDTA ou CPT des tubes pour prélèvements (citrate-tris-pyridossalphosphate) pour empêcher l’inhibition du processus d’amplification PCR ; vous pouvez également utiliser des tubes héparine.
- Pour les échantillons de LN, possibilités de collecte sont soit des suspensions cellulaires, des biopsies de tissus congelés frais ou, dans rares cas fixés au formol paraffine (FFIP) les tissus.
2. séparation de Gradient de densité
Remarque : Si PB ou BM est le produit de départ de choix, qui est le scénario le plus fréquent, il est recommandé d’isolement de cellules mononucléées à l’aide de séparation gradient de densité.
- Ajouter 200 µL d’EDTA (EDTA 0,5 M / pH 8.0) dans un tube de prélèvement stérile de 50 mL. Ajouter 20 mL de PB et 15 mL de RPMI. Mix de pipetage (2 - 3 fois suffit).
- Ajouter 15 mL de milieu de gradient de densité à un nouveau tube de prélèvement de 50 mL.
Remarque : dans le cas où le volume de PB est inférieure à 20 mL, les volumes de RPMI (étape précédente) et le gradient de densité doivent être modifiées en conséquence. - Lentement la couche dans la solution de l’étape 2.1 afin qu’il ne perturbe pas le dégradé. Centrifuger à 800 x g pendant 20 minutes avec le frein centrifuge au large.
- Collecter l’anneau de cellules mononucléées qui s’est formé entre la couche de plasma/plaquettes supérieure et la couche moyenne gradient de densité à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, puis transférer dans un tube de prélèvement stérile de 15 mL.
- Ajouter RPMI pour un volume final de 12 mL et mélanger. Centrifuger à 750 g pendant 8 minutes. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot de cellules à l’aide de 10 mL de milieu RPMI et répétez l’étape 2.5.
- Dissoudre le culot dans 1 mL de PBS (SPD, sans calcium, sans magnésium). Effectuer un nombre de cellules à l’aide d’une plaque de Neubauer en mélangeant 20 µL de l’échantillon et 80 µL de 01:10 solution de Türk.
- Si le traitement en aval de l’échantillon n’est pas prévue pour le même jour, centrifuger l’échantillon à 750 x g pendant 8 minutes. Jeter le surnageant et stocker le culot cellulaire à-80o C.
3. acides nucléiques Extraction
- Décider sur un substrat pour l’analyse de la situation SHM des gènes des IG. L’ADN génomique (ADNg) est le choix le plus populaire car il n’est pas nécessaire pour une étape de transcription inverse ; par ailleurs, l’utilisation de RNA/complémentaire (ADNc) l’ADN assure que, au moins au niveau transcriptionnel, le réarrangement de IG clonotypiques productives, fonctionnelle est la cible « privilégiée ».
- Utiliser un des nombreux kits disponibles dans le commerce appropriés pour l’extraction de l’ARN génomique ou total et la synthèse de cDNA (voir Table des matières).
- Évaluer l’intégrité de l’ADN ou l’ARN à l’aide de systèmes de quantification d’acides nucléiques sensibles. Si à l’aide de matériel FFIP pour l’analyse, évaluer la qualité et la quantité du cDNA/ADNg extraite par amplification par PCR d’un gène de ménage connue, par exemple retinoic acid récepteur alpha (RARa), beta-actine, etc..
4. amplification et le séquençage des réarrangements génétiques IGHV-IGHD-IGHJ
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Sélection d’amorces PCR IGH
- De préférence, effectuer des multiplex PCR avec des amorces spécifiques de 5' sous-groupe IGHV et IGHJ gène spécifique 3' amorces25,26. Si les résultats sont moins qu’optimales, préparer distincts mélanges PCR utilisant des amorces de sous-groupes spécifiques IGHV unique.
- Utiliser 5' les amorces qui anneal soit la région leader située immédiatement en amont du réarrangement IG ou au sein de la région codante (p. ex. cadre 1, FR1) du gène IGHV.
- Utiliser les amorces de chef qui permettent l’amplification de l’ensemble réarrangés IGHV-IGHD-IGHJ séquence du gène, qui à son tour va permettre l’estimation précise des niveaux SHM. Ainsi, des amorces de chef IGHV sont recommandés par ERIC dans leurs directives actualisées pour IG gène séquence analyse27.
- Dans les cas où des amorces de chef ne parviennent pas à amplifier le réarrangement de IG clonotypiques, utiliser les amorces IGHV FR1. Toutefois, des amorces de cadre n’amplifient pas le réarrangement génique de toute clonotypiques IG, qui peut conduire à la détermination imprécise du niveau de la SHM. Dans ce scénario, clairement indiqué dans le rapport clinique que l’utilisation des amorces IGHV FR1 peut surestimer la véritable identité de pourcentage pour le gène plus proche de la lignée germinale.
- Pour l’extrémité 3', utilisation consensus amorces ciblant les gènes IGHJ, multiplex définit des amorces de gène-spécifique IGHJ ou des amorces d’isotype-spécifiques, selon le substrat. Séquences d’amorces sont fournis dans le tableau 1, alors que la Figure 1 illustre les différents endroits pour apprêt recuit.
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Amplification par PCR des réarrangements génétiques IGHV-IGHD-IGHJ
- Préparer le mélange d’apprêt à l’aide de quantités équimolaires de chaque sous-groupe primer(s) afin d’assurer l’amplification impartiale.
- Par exemple, lors de l’utilisation des amorces de chef de file, deux amorces différentes sont utilisées pour amplifier les réarrangements appartenant au sous-groupe IGHV1. Ainsi, utiliser une quantité de ces 2 amorces (IGHV1L et IGHV1bL) qui est de que moitié par rapport au IGHV4L, qui est l’amorce seule pour IGHV4 réarrangements de sous-groupe.
- Appliquer la démarche inverse dans le cas les amorces IGHJ1-2 et IGHJ4-5. Comme ces amorces ciblent deux sous-groupes différents du gène IGHJ, doubler la quantité par rapport aux amorces IGHJ3 et IGHJ6.
- Le tableau 1 permet de déterminer les quantités exactes amorce lors de la préparation d’amorce les mélanges.
- Réactifs PCR Mix telles qu’énumérées dans le tableau 2. Après avoir combiné tous les réactifs PCR dans un tube PCR, ajouter 0,5 µL de la Taq polymérase et 100 ng d’ADNg ou 2 µL de cDNA (ARNC devrait être préparée à l’aide de 1 µg d’ARN).
Remarque : Une enzyme Taq avec activité de relecture n’est pas essentielle, car le taux d’erreur de l’amplification est extrêmement faible et n’affectera donc pas le niveau de SHM. - Exécutez le protocole ACP thermique détaillé dans le tableau 3.
- Préparer le mélange d’apprêt à l’aide de quantités équimolaires de chaque sous-groupe primer(s) afin d’assurer l’amplification impartiale.
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Évaluation de clonalité
NOTE : Une étape cruciale consiste à évaluer le modèle de clonalité du produit PCR. Lorsqu’on évalue la clonalité de patients atteints de LLC, la conclusion plus commune est une crête/bande unique, anticorps monoclonale.- Utilisez les méthodes avec la sensibilité élevée, telles que l’analyse de fragment ou hétéroduplex, clonalité évaluation28,29.
- Analyse des fragments
- Effectuer des multiplex PCR à l’aide du chef IGHV 5'-étiqueté ou amorces de PCR FR1 sous-groupe spécifiques ; Cela donnera des produits PCR qui peuvent être séparés par électrophorèse capillaire, permettant ainsi d’évaluation de clonalité de la PCR IGH produits basé sur leur complémentarité IGHV déterminer la région 3 longueurs (CDR3).
- Utiliser des amorces, des réactifs et des conditions thermiques identiques à ceux mentionnés précédemment (voir tableaux 1-3). 5´ personnalisé-étiqueté amorces sont fluorescent étiquetés oligos avec un choix de colorants à l’extrémité 5'. Exemples de colorants journaliste 6-FAM, HEX, NED ou TET. 2 réactions distinctes sont donc requises basé sur l’utilisation des 3 différentes teintures par réaction.
- Évaluer la taille des produits PCR sur un gel de polyacrylamide de six pour cent (6 %) (ce pourcentage entraîne une résolution optimale), à l’aide de 1 x TBE comme un tampon en cours d’exécution. Courir à 80 V pendant 45 min.
Remarque : Il est recommandé que les produits PCR sont autorisés à migrer sur le gel pendant assez longtemps pour que les échantillons monoclonales peuvent être séparés de l’arrière-plan polyclonaux et le marqueur de taille d’ADN peut séparer adéquatement. Des facteurs comme la taille et l’épaisseur du gel peuvent affecter migration si aucun paramètre unique (tension et temps) peut garantir un résultat optimal qui disait, réglage de la tension à 80 V pendant 45 minutes est un bon point de départ car il minimise le risque de l’échantillon migration trop rapidement et « fonctionne » hors gel. - Recherchez les amplicons d’environ 500 paires de bases lors de l’utilisation des amorces de chef IGHV et 350 paires de bases lors de l’utilisation des mélanges d’apprêt IGHV FR1.
Remarque : Dans de rares cas, des cas de LLC ont été trouvés pour transporter des produits doubles, anticorps monoclonales et dans des cas encore plus rares, des cas peuvent présenter un modèle oligoclonales. Un agent intercalant comme le bromure d’éthidium (EtBr) ou moins dangereux et plus sensibles taches ADN disponibles dans le commerce peut être utilisé pour la visualisation de l’ADN sur gel d’acrylamide avec excitation UV ou lumière bleue.
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Purification du produit PCR
NOTE : Produits PCR sont purifiés pour enlever n’importe quel fond polyclonal provenant des cellules B normales au sein de l’échantillon CLL comme apprêt dimères qui peuvent conduire à séquençage sous-optimale. Utiliser toute méthode qui supprime des dNTPs non constituées en société et amorces pour la PCR nettoyage, par exemple un traitement enzymatique, par exemple, Sap (phosphatase alkaline de crevette) / Exo (exonucléase j’ai), ou basée sur les colonnes de purification.- Charger le volume total du produit PCR sur un gel d’agarose bas point de fusion de 3 %.
- Laisser les produits PCR à courir sur le gel jusqu'à ce qu’elles se séparent de l’arrière-plan.
- Les bandes PCR sharp, éminents de l’accise, purifier et éluer. Si deux réarrangements sont détectées, les deux bandes devraient être excisées et séquencé séparément.
- Pour effectuer le nettoyage Sap/Exo, suivez les instructions du fabricant concernant les volumes spécifiques à utiliser ; Cependant, une réaction typique peut contenir 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo et incubation de 5 x 2 µL de tampon par réaction PCR de 5 à 10 µL. Mélanger au vortex doucement chaque échantillon et incuber sur un bloc PCR à 37 ° C pendant 30 minutes. Inactiver les enzymes en le chauffant à 85 ° C pendant 15 minutes.
- Charger une petite quantité des produits PCR sur un gel d’agarose à 3 % pour évaluer la pureté du produit.
5. séquençage Sanger
NOTE : Le séquençage plusieurs stratégies existent, cependant, quelle que soit la stratégie exacte, direct le séquençage de deux brins est obligatoire pour garantir un résultat fiable.
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Protocoles de séquencement général
- Si l’amplification a été réalisée en utilisant des amorces unique, procéder avec classement en utilisant le IGHV approprié - et IGHJ - ou des amorces spécifiques à une région constantes. Cette approche peut aussi être prise si multiplexés fluorescent étiquetées amorces ont été utilisés et le produit de la PCR a été évalué en utilisant l’analyse de fragment (amorces de séquençage ne doivent pas être étiquetés).
- Si multiplexés amorces ont été utilisées et clonalité a été évaluée sur un gel, utilisez un apprêt en aval lors de la première étape de séquençage par exemple un consensus apprêt IGHJ avec la séquence 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 '. Alternativement, une amorce CH peut être utilisée si l’ADNc a été utilisée comme substrat. Ensuite, utilisez le sous-groupe spécifique IGHV leader ou FR1 amorces pour la deuxième étape de séquençage.
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Protocole de séquençage exemple
Remarque : Plusieurs protocoles de séquençage existent et un protocole d’exemple est détaillé ci-dessous.- Diluer 33 ng du produit PCR dans un volume total de 11,5 µL en utilisant, par exemple, de l’eau stérile. Dénaturer le produit PCR par chauffage à 95 ° C pendant 5 minutes. Placer immédiatement sur la glace pendant 10 minutes pour éviter la formation de structures secondaires.
- Ajouter 8 µL du mélange maître dans chaque tube avec 0,5 µL (correspondant à 5 pmol) de l’apprêt.
- Comme contrôle, préparer un tube contenant 8 µL du mélange maître, modèle de contrôle de 0,5 µL pUC18, 2 amorce de séquençage 47 µL (-) et 9,5 µL d’eau stérile. Le dernier volume total dans chaque tube doit être de 20 µL.
- Utiliser des conditions thermiques de cyclisme pour la réaction de séquençage comme indiqué dans le tableau 4.
- Préparer la Solution d’arrêt en mélangeant 2 µL d’acétate de sodium 3M (pH 5,2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8,0) et 1 µL de glycogène (concentration de 20 mg/mL), puis ajouter 5 µL de chaque échantillon. Transférer le produit dans un nouveau tube de microcentrifuge.
- Ajouter 60 µL d’éthanol à 100 % (-20 ° C) et mélanger doucement. Centrifuger à 14 000 tr/min pendant 15 minutes (4 ° C). Jeter le surnageant.
- Ajouter 100 µL d’éthanol à 70 % (-20 ° C) et mélanger doucement. Centrifuger à 14 000 tr/min pendant 10 minutes (4 ° C). Jeter le surnageant. Répéter une fois.
- Sécher le culot pendant 90 minutes à température ambiante. Ajouter 40 µL de sodium dodecyl sulfate solution (SDS) à chaque échantillon.
- Transférer l’échantillon dans une plaque de séquençage, couvrir avec les couvercles de barrette ou rubans de joint, de chargement dans la machine et effectuer Sanger séquençage. La plaque de séquençage est habituellement un 96 puits, fond v, plaque PCR de plein-jupe compatible avec le séquenceur. Les plaques peuvent être barcoded selon que le séquençage est à effectuer à l’interne, à une société commerciale ou à une plate-forme de séquençage académique/Centre.
- Après le séquençage, « piquer » les 2 lectures générés par les étapes de séquençage individuel pour former une complète IGHV gène réarrangement c'est-à-dire la séquence consensus.
6. analyse de la séquence
Remarque : Les suivantes sections centrées sur le résultat obtenu de l’IMGT/V-QUEST outil30 lors de l’analyse réarrangés séquences IG et IMGT/JunctionAnalysis31, qui sont particulièrement pertinentes pour les rapports cliniques et de recherche études. IMGT/V-QUEST est un outil d’alignement qui compare l’utilisateur soumis séquences IG avec l’annuaire de référence IMGT définit30. La sortie de l’outil comprend plusieurs sections au sein de laquelle l’utilisateur peut définir certains paramètres.
- Spécifier les espèces, par exemple, Homo sapiens (humain) et type de récepteur ou locus (p. ex. IGH, IGK ou IGL).
- Coller des séquences à analyser, au format FASTA et y compris les en-têtes, dans la zone de texte (par lots de 50 séquences par course). Par ailleurs, une option d’entrer le chemin vers un fichier local contenant les séquences FASTA est fournie.
- Choisissez l’une des options suivantes 3 affichage pour les résultats :
- Vue détaillée : sélectionnez cette option afin d’obtenir les résultats pour chaque séquence individuellement.
- Vue de synthèse : choisissez cette option pour compiler un tableau récapitulatif, classé par nom de gène et l’allèle IGHV, ou par ordre d’entrée des séquences. Cette option fournit également un alignement de séquences qui, dans n’importe quel lot soumis, sont assignés à la même gène IGHV et l’allèle.
- Fichier Excel : choisissez cette option pour fournir tous les fichiers de sortie comme des feuilles de calcul incorporées à un fichier unique. Toutes les options d’affichage ont un grand choix de paramètres de base et avancés au choix, cependant seulement les facteurs plus pertinents pour l’analyse des séquences CLL IG sont discutés ci-dessous dans la section « Résultats représentant ».
7. arrêt/AssignSubsets outil
- Pour étudier la stéréotypie BcR IG dans CLL (plus de détails ci-dessous dans la section « Résultats représentant »), présenter des séquences FASTA IGHV-IGHD-IGHJ à l’arrestation/AssignSubsets outil32. L’outil signale que l’attribution aux grand CLL stéréotypés des sous-ensembles. L’outil de sous-ensemble-affectation ainsi que des instructions détaillées sont disponibles sur le site Web d’arrestation/AssignSubset32 et aussi sur le site d’ERIC sous l’onglet services.
Representative Results
Exemples ci-dessous illustrent les résultats obtenus par IG gène séquençage de l’analyse qui suit les étapes détaillées ci-dessus. Bien que l’extraction de l’ADN et/ou de l’ARN sont des procédures de routine pour la plupart des laboratoires de recherche clinique /, une première étape cruciale consiste à vérifier la qualité/quantité d’ADNg et/ou de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre ou autre technologie appropriée avec la sensibilité élevée. La prochaine étape cruciale consiste à amplification par PCR de le clonotypiques réarrangement génique IGHV-IGHD-IGHJ. Comme mentionné ci-dessus, seulement l’utilisation des amorces de chef IGHV permet l’amplification de la longueur totale de la séquence du gène réarrangée IGHV, permettant ainsi la véritable charge SHM à déterminer ; par conséquent, IGHV chef amorces sont le choix de l’apprêt recommandé (Figure 2). Dans de rares cas où des amorces IGHV leader ne peuvent amplifier le réarrangement de IG clonotypiques, amorces FR1 IGHV peuvent être utilisés. Comme en témoigne la Figure 3, plusieurs produits PCR/bandes peuvent être observés, particulièrement quand ADNg est le produit de départ ; ces bandes doivent être excisées et séquencé séparément. Si le chef IGHV tant IGHV FR1 amorces ne parviennent pas à donner des résultats, l’analyse doit être répété en utilisant un nouvel échantillon de patients (lorsque cela est possible). Le dernier point de contrôle avant séquençage consiste à déterminer la clonalité de l’échantillon à l’aide de l’analyse des fragments (Figure 4).
Les séquences obtenues doivent être analysées à l’aide de l' outil IMGT/V-QUEST30. Les paramètres sélectionnés par l’utilisateur incluent des espèces, type de récepteur ou locus, recherche d’insertion et option effacement, etc. et sont répertoriés ainsi que le nombre de séquences analysées. Chaque séquence FASTA est affiché et le V-domaine analysé par IMGT/V-QUEST est surligné en vert. En outre, si la séquence d’entrée était dans le sens opposé (antisens), le programme automatiquement fournit l’ordre inverse des opérations complémentaires et l’indique au-dessus de la séquence FASTA.
Le résultat tableau récapitulatif est fourni à l’aplomb de la séquence FASTA, au sommet de la « vision détaillée » page de résultats et contient des informations importantes pour la clinique du rapport de l’analyse de séquence de gène IG en CLL. Chaque ligne de cette table est expliquée ci-dessous.
Sommaire des résultats de. La première ligne dans la table de résultats indique les fonctionnalités de la séquence d’entrée : une séquence IG réarrangé peut être productive ou improductive (Figure 5 a et 5 b). Un réarrangement du gène IG est improductif si arrêt codons sont présents au sein de la V-D-J-région (pour VH) ou au sein de la région V-J (pour VL) et/ou si la transposition est hors-de-frame en raison des insertions/délétions. Une troisième sortie est fournie lorsque la fonctionnalité ne peut pas être déterminée, c'est-à-dire si la jonction IGHV-IGHD-IGHJ n’a pas pu être identifiée ; dans ce cas, le Sommaire des résultats se lirait comme « Aucun réarrangement trouvé » ou « Aucune jonction trouvé ». Il est important de noter que seul productif et, ainsi, réarrangements fonctionnelles doivent être analysées plus loin. Si la semelle amplifié réarrangement IG n’est pas fonctionnel (improductifs ou « aucun réarrangement trouvé »), le processus d’amplification PCR doit être répété. Si le résultat reste négatif un nouvel échantillon du patient doit être obtenu.
V-gène et allèle. La ligne « V-gène et allèle » indique le plus proche germline IGHV gène et l’allèle avec son score de l’alignement et l’identité de pourcentage. Si plusieurs des gènes et des allèles donnent le même score élevé, tous sont répertoriés. L’identité de pourcentage entre la séquence soumise et la plus proche IGHV gène et l’allèle est particulièrement important car il détermine le statut de la SHM. Cette valeur est calculée à partir des premiers nucléotides de la région-V à l’extrémité 3' de la V-région sauf le CDR3. Si FR1 IGHV amorces sont utilisés, la séquence correspondant à celle de l’apprêt doit toujours être retirée pour assurer, aussi précis, un résultat possible. Il est à noter qu’un pourcentage faible identité (< 85 %) pouvant résulter d’une insertion ou suppression (discutées plus loin ci-dessous) et, si tel est le cas une note « Avertissement » s’affiche dans la ligne « Sommaire » pour alerter l’utilisateur.
J-gène et allèle. Comme pour le V-gène et l’allèle ci-dessus, la ligne « J-gène et allèle » indique le plus proche germline IGHJ gène et l’allèle avec son score de l’alignement et l’identité de pourcentage. Cependant, comme le gène IGHJ est plutôt court et son extrémité 5' peut-être avoir été rognée en raison de l’activité exonucléasique, choix alternatifs sont également recherchés par l’outil, basé sur le plus grand nombre de nucléotides identiques consécutifs.
D-gène et l’allèle par IMGT/JunctionAnalysis. L’eu-gène et l’allèle par IMGT/JunctionAnalysis' indique la plus proche de vous gène IGHD lignée germinale et allèle avec la trame de lecture D-REGION identifiée par l’outil dans la séquence de l’utilisateur. IMGT/JunctionAnalysis31 fournit une analyse détaillée et précise de la jonction et a été intégré dans l’interface de l’outil IMGT/V-QUEST. Cet outil gère tous les aspects des difficultés liées aux IGHD gène et l’allèle d’identification soit (i) la faible longueur de la région-D ; (ii) l’utilisation de 2 ou même 3 lecture des cadres ; (iii) parage exonucléase aux deux extrémités du gène ; et (iv) la présence de mutations.
FR-IMGT longueurs, de longueurs de CDR-IMGT et de jonction AA. Cette ligne assure la longueur de la IGHV FRs et les CDRs indiqué entre parenthèses et séparés par des points et la jonction de l’acide aminé (AA). La séquence d’AA de la jonction illustre (i) un réarrangement dans ou dehors-de-le cadre (hors-du-cadre postes sont signalés par le signe « # »), (ii) la présence ou l’absence de codons stop (un codon stop est indiqué par un astérisque ' *') et (iii) la présence ou l’absence de la ancres de la VH CDR3-IMGT : C (2ème-CYS 104) et W (J-TRP 118).
Hypermutations somatiques se composent principalement de modifications nucléotidiques, cependant, petites insertions et délétions au sein de la région-V peuvent être observées, mais à beaucoup plus faible fréquence33. Quand en utilisant les paramètres de défaut IMGT/V-QUEST, les insertions et les suppressions ne sont pas automatiquement détectés ; Toutefois, de fortes raisons de penser qu’une séquence peut effectuer ces modifications, c'est-à-dire une identité faible pourcentage et/ou différentes longueurs IGHV RDC1-IMGT et CDR2-IMGT entre la séquence utilisateur envoyé le plus proche génique germinale et allèle, sont détectés par le outil et une alerte d’avertissement s’affiche sous le tableau récapitulatif des résultats (Figure 5).
IMGT fournit une option appelée « Recherche pour les insertions et les suppressions » dans la section « Paramètres avancés » située sous la section « Affichage des résultats ». Dans les cas où les avertissements pertinents apparaissent, il est conseillé d’utiliser cette fonctionnalité. Quand les insertions et les suppressions sont détectées, les détails complets des conclusions sont fournies dans la section « Resultat Sommaire » y compris (i) où l’insertion ou la suppression est situé c'est-à-dire VH FR-IMGT ou CDR-IMGT ; (ii) le nombre de nucléotides, insérés ou supprimés ; (iii) la séquence (uniquement pour les insertions) ; (iv) si un changement de phase a eu lieu ; (v) le codon V-région d'où l’insertion ou la suppression commence ; et (vi) la position de nucléotides touchées dans le soumis séquence (Figure 5). Pour les insertions, l’outil supprime l’insertion de la séquence de l’utilisateur envoyé et puis re-analyse de la séquence en utilisant les paramètres standards de IMGT/V-QUEST. Si les suppressions sont détectées, l’outil ajoute des lacunes, représentés par des points, pour remplacer les nucléotides supprimés avant de répéter l’analyse.
Comme pour chaque test diagnostique ou pronostique effectuée dans les laboratoires cliniques, des normes strictes et un haut niveau de reproductibilité sont d’une importance capitale. La sortie IMGT/V-QUEST fournit une grande partie de l’information nécessaire pour communiquer les résultats de l’analyse de séquence de gène IG en CLL, c'est-à-dire (i) le IGHV, les gènes IGHD et IGHJ et allèles utilisées ; (ii) la fonctionnalité de la clonotypiques IGHV-IGHD-IGHJ gène réarrangement c'est-à-dire le réarrangement soit productive ou improductive ; et (iii) l’identité de pourcentage de la réarrangés IGHV gène et allèle par rapport à son plus proche gène IGHV lignée germinale et allèle. Pour les détails complets concernant les rapports cliniques des gènes des IG en CLL, l’interprétation des problématiques, ou techniquement difficiles les cas et recommandations pour le dosage précis et robuste du statut de SHM de gène IGHV en CLL, le lecteur est dirigé à récemment mis à jour ERIC rapports et lignes directrices27,34.
Enfin, en raison de notre connaissance croissante concernant la stéréotypie BcR IG en CLL, une condition supplémentaire recommandée pour la clinique du rapport des réarrangements génétiques IG en CLL concerne l’attribution des affaires aux sous-ensembles de major stéréotypé. Maintenant, il est recommandé d’indiquer dans le rapport clinique si le réarrangement de gène IGHV productif analysé peut être attribué à un des grands sous-ensembles stéréotypés, nommément sous-ensembles #1, #2, #4 ou #812,27. Affectation aux grands sous-ensembles CLL stéréotypé doit être effectuée avec l’utilisation de l’arrestation/AssignSubsets outil (Figure 6)32.
| 5' IGHV FR1 amorces | Séquence d’amorce | Quantité de mélange d’apprêt pour 60 μL | |
| IGHV1 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG | 10 | |
| IGHV2 | CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV3 | GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV4 | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG | 10 | |
| IGHV5 | GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC | 10 | |
| IGHV6 | CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG | 10 | |
| Amorces de chef IGHV 5' | |||
| IGHV1L | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG | 5 | |
| IGHV1bL | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) | 5 | |
| IGHV2aL | AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (A/C) AC | 5 | |
| IGHV2bL | AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC | 5 | |
| IGHV3aL | AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC | 5 | |
| IGHV3bL | AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC | 5 | |
| IGHV4L | AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT | 10 | |
| IGHV5L | AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC | 10 | |
| IGHV6L | AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC | 10 | |
| 3' amorces IGHJ | |||
| IGHJ1-2 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 20 | |
| IGHJ3 | TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC | 10 | |
| IGHJ4-5 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC | 20 | |
| IGHJ6 | TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC | 10 | |
Le tableau 1. Séquences d’amorces et quantités pour l’amplification PCR de le clonotypiques réarrangement génique IGHV-IGHD-IGHJ.
| Réactif | Volume (μL) |
| RB x 10 tampons | 5 |
| MgCl2 (50 mM) | 3 |
| dNTPs (10 mΜ) | 2 |
| Mélange de leader/FR1 IGHV Primer (10 μM) | 3 |
| Apprêt IGHJ mix (10 μM) | 3 |
| H2O | 31,5 |
| Volume total | 47,5 |
Le tableau 2. Réactifs pour l’amplification PCR de le clonotypiques réarrangement génique IGHV-IGHD-IGHJ.
| Température | Durée | Nombre de cycles | Description |
| 94 ° C | 5 minutes | 1 | activation de la polymérase |
| 94 ° C | 1 minute | 39 | dénaturation |
| 59 ° C | 1 minute | recuit | |
| 72 ° C | 1,5 minutes | extension | |
| 72 ° C | 10 minutes | 1 | extension finale |
| 18 ° C | ∞ | 1 | préservation |
Tableau 3. Conditions thermiques de cyclisme pour l’amplification PCR de le clonotypiques réarrangement génique IGHV-IGHD-IGHJ.
| Température | Durée | Nombre de cycles | Description |
| 94 ° C | 5 minutes | 1 | activation de la polymérase |
| 96 ° C | 20 secondes | 30 | dénaturation |
| 50 ° C | 20 secondes | recuit | |
| 60 ° C | 4 minutes | extension | |
| 4 ° C | ∞ | 1 | préservation |
Tableau 4. Conditions thermiques de cyclisme pour la réaction de séquençage du gène IG.
Figure 1. Représentation schématique d’un réarrangement génique de IGHV-IGHD-IGHJ avec diverses amorces recuit endroits mentionnés. 5' amorces IGHV recuisent à la séquence de tête qui se trouve en amont de la séquence codante de IGHV. Amorces de cadre (FR) IGHV 5' recuisent au départ de la région de FR1, qui se trouve dans le gène IGHV réarrangé, tandis que les amorces IGHJ 3' recuisent à la fin du gène IGHJ réarrangé. UTR : région non traduite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Amplification par PCR du réarrangement génique dans 7 échantillons de patients en utilisant des amorces de chef IGHV 5' IGHV-IGHD-IGHJ. La huitième voie représente un témoin positif alors que le contrôle négatif pour la PCR a été chargé dans la voie de la neuvième. Le produit attendu de la PCR est environ 500 paires de bases en taille lors de l’utilisation des amorces de chef IGHV. L’astérisque dans la dernière colonne du gel indique l’échelle d’ADN 100 Pb. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Amplification par PCR du réarrangement génique dans 13 échantillons de patients en utilisant des amorces FR1 IGHV IGHV-IGHD-IGHJ. La voie de la quatorzième contienne le contrôle positif, tandis que le témoin négatif a été chargé dans la voie de la quinzième. Comme en témoigne la voie 2, dont l’ADN était le produit de départ, plusieurs bandes de PCR sont observées, qui devrait être excisées et séquencé séparément. Échantillons dans les couloirs 5, 7 et 13 ont donné des résultats polyclonaux (attestées par le frottis dans le gel) et, par conséquent, l’étape de l’ACP doit être répétée. Si une deuxième PCR ne parvient pas à amplifier l’IG réarrangé gène (s) l’analyse doit être effectuée sur un nouvel échantillon (si possible) ou en utilisant une amorce différente. Le produit attendu de la PCR est environ 350 paires de bases en taille lors de l’utilisation de mélanges d’apprêt IGHV FR1. L’astérisque dans la dernière colonne du gel indique l’échelle d’ADN 100 Pb. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Évaluation de clonalité par analyse genescan. Genescan analyse, anticorps monoclonales amplicons donnent lieu à un pic dominant des produits fluorescents de taille identique (du haut), considérant que polyclonaux amplicons conduit à une distribution normale plus de tailles de produit (panneau inférieur). Les traces rouges sont les sommets d’une échelle d’ADN marqué fluorescent qui est chargé dans la même injection capillaire que l’échantillon analysé. Les fragments de taille standard sont soumis à la même force électrophorétique que l’échantillon et sont donc exposées aux mêmes conditions d’injection. L’espacement uniforme entre les fragments de taille standard confirme la vocation de taille précise. Les traces bleues représentent l’anticorps monoclonaux (panneau supérieur) ou polyclonaux nature (panneau inférieur) des échantillons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Exemples des tableaux récapitulatifs du résultat fournis par IMGT/V-QUEST. (A) tableau récapitulatif de résultat pour un réarrangement productif de gène IGHV-IGHD-IGHJ (aucun codons stop et une jonction de séquence dans le cadre). Le V-gène allèle et les J-gène et les allèles identifiés dans la séquence de l’utilisateur par IMGT/V-QUEST dans ce cas sont IGHV4 - 34 * 01 et IGHJ6 * 02 (sur la base de la meilleure évaluation de score de l’alignement). L’identité de pourcentage est 99,65 % due à une mutation somatique. Le D-gène et l’allèle identifié par IMGT/JunctionAnalysis est le IGHD3 - 3 * 01 dans le cadre 1 de lecture. Les longueurs des régions 4 cadre (FRs) ainsi que les 3 régions déterminant complémentarité (CDRs) sont indiquées entre parenthèses. La séquence d’acides aminés (AA) de la jonction IGHV-D-J est également fournie. Dans cet exemple la jonction comprend 22 AAs. (B) résultat tableau récapitulatif pour une séquence de réarrangement du gène IGHV-IGHD-IGHJ qui est improductive en raison d’une jonction de dehors-de-armature. Un X la longueur CDR3-IMGT indique que, pour cette séquence, la longueur peut être pas déterminée. Les signes de « # » observés dans la séquence de jonction AA indiquent un changement de phase. (C) tableau récapitulatif résultat avertissement de faible identité V-région (60.94 %) et en indiquant d’utiliser l’option « les insertions et les suppressions » dans la section « Paramètres avancés ». (D) tableau récapitulatif de résultat pour le cas de la lignée germinale faible pourcentage identité illustrée en (C) après avoir répété l’analyse de la séquence à l’aide de l’option « Rechercher les insertions et suppressions ». Le pourcentage d’identité correcte s’affiche entre parenthèses et est calculé compte tenu de l’insertion comme un seul événement mutationnel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6. Sous-ensemble cession rapport table générée par l’outil d’arrêt/AssignSubsets. Les séquences de FASTA IG chez 10 patients atteints de LLC (A1-A10) ont été soumis à l’outil d’arrêt/AssignSubsets. Affaire A4 fut attribué à sous-ensemble CLL stéréotypé #2 (les patients de ce groupe sont connus pour avoir un mauvais pronostic, quelle que soit la charge SHM) et degré de confiance élevé. Sept autres cas/séquences ne étaient pas assignés à un sous-ensemble majeur stéréotypé et donc classé comme non attribuées. Deux des séquences soumis (A7 et A8) ne pouvait servir que pour l’affectation de sous-ensemble et étaient plutôt classé comme sauté/malsaine en raison de problèmes avec la séquence, c'est-à-dire, en raison d’une jonction de dehors-de-cadre ou la présence de codons stop. Une explication détaillée des en-têtes de tableau et l’outil est disponible sur le site Web d’arrestation/AssignSubsets32. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
L’étude des gènes des IG en CLL a été vital non seulement pour fournir une meilleure compréhension dans la pathologie de la maladie, mais aussi pour améliorer la stratification du risque patient. Il est donc primordial que la procédure en plusieurs étape de l’analyse de séquence de gène IG et interprétation ultérieure des séquences s’effectués de manière standardisée. La disponibilité du matériel patient approprié et suffisant et le calendrier d’échantillonnage ne devraient pas influer sur la capacité d’effectuer l’analyse mutationnelle gène IG étant donné que le test peut être effectué sur le PB et sur n’importe quel échantillon avec un nombre de cellules de tumeur CLL élevé. La séparation des cellules mononucléaires du sang à l’aide de méthodes de séparation dégradé est assurée dans les laboratoires de diagnostic, et comme toujours, il faut veiller lors de l’ajout de la solution de sang/RPMI dans le tube contenant le gradient ; cette tâche doit être effectuée d’une manière lente et douce pour ne pas perturber le gradient et prévenir la perte de cellules.
Suite à la séparation des cellules, les acides nucléiques sont extraits. Les deux ADNg et ARNC conviennent à l’analyse de la transposition de l’ISFH clonotypiques SHM, cependant, il y a des avantages et des inconvénients de l’utilisation d’un matériau. Le flux de travail de laboratoire produit plus rapidement lorsque vous utilisez ADNg puisque aucune transcription inverse ne doit être effectué avant l’amplification par PCR. Cela dit, à l’aide de gDNA comme substrat pour la PCR peut entraîner l’amplification des réarrangements productives et non productives qui, à son tour, peut conduire à des travaux de laboratoire pratique supplémentaire, c'est-à-dire, de purification ou l’excision gel de multiples produits PCR et le séquençage individuel de tous les réarrangements. Si l'on compare les approches génomique et de la cDNA, pour ce dernier une étape de transcription inverse doit être effectuée avant de procéder à l’amplification par PCR. Toutefois, en l’occurrence, pour la plupart des cas, seulement les réarrangements IG productives seront amplifiés et séquencés par la suite. Ainsi, seulement un seul produit PCR sera purifié et séquencé, tandis que l’interprétation des résultats est plus simple.
L’efficacité de l’amplification dépend largement de la qualité de l’ADNg/ADNc, qui devraient être évalué à l’aide d’une méthode de quantification sensible et les amorces utilisées. Les amorces utilisées sont essentiels à l’ensemble de la procédure analytique, parce que la détermination précise du niveau SHM n’est possible que par amplifier la séquence complète du gène réarrangé IGHV. Un réarrangement pleine longueur ne peut être apprécié que si 5' IGHV chef amorces sont utilisées, ce qui justifie les recommandations récentes par ERIC pour l’utilisation du chef amorces27. L’utilisation d’autres amorces, conduisant à l’amplification des réarrangements de gènes IGHV-IGHD-IGHJ incomplets, n’est pas appropriée pour l’analyse mutationnelle du gène IGHV et donc fortement déconseillé. La seule exception concerne les cas qui à plusieurs reprises donnent des résultats négatifs lorsqu’on utilise des amorces de chef de file IGHV et analyse d’un nouveau patient est soit pas possible ou également ne pas donner des résultats. Si utilisation d’un échantillon de patients différent et/ou matériel (ADNg/cDNA) et diverses amorces définit encore ne parviennent pas à produire un produit PCR, raisons possibles pourraient être que le fardeau de la cellule tumorale est trop faible ou cette lymphocytose n’est pas due à un clone CLL (auquel cas la IMMUNOPHENOTYPE doit être réévalué). Les amorces utilisées pour l’analyse doivent toujours être indiqués dans le rapport clinique.
Comme le CLL résulte de l’accumulation de cellules de B monoclonales portant le même réarrangement génique de IGHV-IGHD-IGHJ, pour la grande majorité de clonalité cas évaluation révélera un pic monoclonal unique, c'est-à-dire un seul clone. En de rares occasions, double réarrangements ou même oligoclonales patrons peuvent être observées35. Dans ce cas, électrophorèse de gel n’est pas la technique de choix pour l’évaluation de la clonalité et appliquer des méthodes plus sensibles telles que l’analyse de fragment. Une fois la clonalité a été confirmée, la dernière étape avant le séquençage se rapporte à la purification du produit PCR pour s’assurer que les séquences de haute qualité sont obtenues. Enfin, l’outil IMGT/V-QUEST est la ressource recommandée pour l’analyse de la séquence IG par ERIC. Comme les bases de données IMGT sont constamment mis à jour et de faire rapport des résultats bien annotée de façon cohérente et, cet outil assure analyse standardisée et facilite l’analyse comparative entre les différentes installations cliniques ou académiques.
Comme immunogénétiques analyse en CLL a pronostic et, en particulier, incidences prédictives, analyse robuste du réarrangement génique IGHV-IGHD-IGHJ y compris l’attribution de grands sous-ensembles CLL stéréotypé, n’est plus seulement souhaitable, mais d’une importance capitale. Cela est particulièrement évident dans cette ère de nouvelles thérapeutiques et le potentiel que l’analyse du gène IG a pour guider le traitement décisions5,21,22,23,36,37 ,38, officiellement indiqué par la récente mise à jour des directives de l’International Workshop on CLL24parrainé par le NCI. Que lesdites normes rigoureux sont garantis, autant de détermination du statut de la clonotypiques SHM réarrangées de gène IGHV chez les patients atteints de LLC ne sont pas une mince affaire et implique un processus en plusieurs étapes. Surtout, certaines étapes expérimentales, sont respectées, notamment le choix des amorces, des résultats supérieurs de rendement quand spécifique des options ou approches, autres aspects techniques sont prêtent à un certain degré de flexibilité, comme le choix des matériaux ou la méthode d’évaluation de clonalité, dû au fait qu’elles conduisent à des différences subtiles, le cas échéant, en ce qui concerne les résultats définitifs.
Durant la dernière décennie, ERIC s’efforce de promouvoir la normalisation et l’harmonisation des différentes méthodes pertinentes à CLL diagnostic et de pronostic. Cela se reflète dans les recommandations publiées et les lignes directrices pour l’analyse immunogénétiques27,34, nombreux ateliers pédagogiques organisés et événements, la mise en place d’un réseau de IG, ainsi qu’un forum en ligne d’experts à discuter et donner des indications sur les IG gène séquence interprétation au CLL. L’objectif global d’ERIC grâce à ces mesures est de promouvoir la prise en charge clinique optimale et des soins aux patients. Malgré des efforts intenses, cette tâche est loin d’être terminée et en fait est devenue plus complexe en raison de l’élaboration du nouveau séquençage haut débit visant à présenter le profil immunitaire. Néanmoins, même si les difficultés persistent, les efforts intensifs de la normalisation robuste d’analyse génique IG dans le CLL continuent et sont actuellement au centre des activités en cours au sein de ERIC.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent de communiquer.
Acknowledgments
Nous remercions les membres présents et passés de nos groupes de recherche, le groupe IgCLL et ERIC, pour leur engagement et leur enthousiasme dans l’étude immunogénétique de CLL. Nous tenons également à souligner la collaboration confiante de tous les membres de l’initiative IMGT/CLL-DB et, en particulier, professeur Marie-Paule Lefranc et Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, France, IMGT, le système d’information international immunogénétique pour leur énorme appui et aide à l’analyse de séquences de gènes IG. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de TRANSCAN-179 roman JTC 2016 ; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 et spécial programme moléculaire clinique oncologie à 5 pour mille #9965), Milano (Italie) ; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rome, Italie ; La société du Cancer suédois, le Conseil de recherche suédois, Knut et Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Université d’Uppsala, Uppsala University Hospital et Cancer Research Foundation du Lion, Uppsala. Programme ODYSSEUS, relevant le « Action pour le développement sur the recherche et technologique secteur stratégique », financé par le Programme opérationnel « Compétitivité, entrepreneuriat et Innovation » (CRSN 2014-2020) et cofinancé par la Grèce et l’Union européenne (Fonds européen de développement régional).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
| BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
| BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
| Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
| Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
| RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
| Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
| Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
| Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
| Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
| Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
| Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
| QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
| 5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
| Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
| DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
| PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
| Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | - | PCR/Clonality assessment |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
| UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
| 10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
| DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
| Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
| Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
| GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
| Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
| Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
| Centrifuge | equipment | ||
| PCR machine | equipment | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |
References
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