Summary
Her presenterer vi en protokoll som detaljer de tekniske aspektene og viktige krav for å sikre robust IG genet sekvens analyse hos pasienter med kronisk lymfatisk leukemi (CLL), basert på erfaring av europeisk forskning initiativ på CLL (ERIC).
Abstract
Under B celle modning, den komplekse prosessen med immunglobulin (IG) gen V (D) J rekombinasjon kombinert med somatisk hypermutation (SHM) gir opphav til en unik DNA sekvens innenfor hver B celle. Siden B-cell malignancies skyldes klonal ekspansjon av en enkelt celle, representerer IG gener en unik molekylær signatur felles til alle ondartede celler i en individuell pasient; Dermed kan IG genet rearrangements brukes som klonal markører. I tillegg et viktig identifikator for klonal, kan IG genet sekvensen fungere som en molekylær tidslinje siden det er knyttet til bestemte utviklingsstadier, og derfor gjenspeiler historien til B-cellen i neoplastic transformasjonen. Videre for visse malignitet, spesielt kronisk lymfatisk leukemi (CLL), IG genet sekvensen holder prognostiske og potensielt prediktiv evner. Når det er sagt, ekstrapolere meningsfull konklusjoner fra IG genet sekvens analyse ville være umulig hvis robust metoder og verktøy ikke var tilgjengelig for hjelp i sine analyser. Denne artikkelen, tegning på store opplevelsen av den europeiske TFI på CLL (ERIC), detaljer de tekniske aspektene og vesentlige krav nødvendig for å sikre pålitelig og reproduserbar IG genet sekvens analyse i CLL, en test som er nå anbefalt for alle CLL pasienter før behandling. Mer spesifikt, beskrives de ulike analytiske stadiene spenner fra identifisering av clonotypic IG genet omorganisering og fastsettelse av nukleotid sekvensen til nøyaktig klinisk tolkningen av IG genet sekvens data.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL), den mest vanlige formen av leukemi hos voksne i vestlige land, er preget av klonal moden neoplastic B celler-1. Fra en klinisk perspektiv er sykdom kurset svært variabelt med noen pasienter opplever en aggressiv sykdom, som krever behandling tidlig etter diagnose, og ofte relapsing eller være gjenstridig å terapi. Dette er i sterk kontrast til en betydelig andel av pasienter (~ 30%) som presenterer med en lat sykdom, aldri krever behandling, og har en forventet levealder ligner på friske age samsvar individer2. Denne klinisk heterogenitet gjenspeiles i mangfoldet av molekylære forandringene i CLL pasienter som til slutt kjøre patogenesen og progresjon av denne sykdommen3.
Etablere en nøyaktig diagnose av CLL er vanligvis enkel, men de nevnte klinisk heterogeniteten kan hindre effektiv styring av CLL pasienter og understreker behovet for prognostiske og prediktiv indikatorer som kan hjelpe behandling beslutningstaking2. Tallrike studier har forsøkt å avgrense prognostication av CLL, kulminerte i en overflod av romanen kliniske og biologiske markører blir foreslått4. Mutational status clonotypic immunglobulin tunge variabel (IGHV) genet er en av de mest robuste prognostiske markørene i CLL, hovedsakelig på grunn av at (i) det er fortsatt stabil over tid og som sykdommen utvikler seg, og (ii) det er uavhengig av andre klinisk og biologiske5. At tross, svært få, om noen markører, inkludert IGHV mutational status, er brukt i klinisk rutine på diagnosetidspunktet.
Første rapporter på klinisk nytten av IG genet sekvenser i CLL dato så langt tilbake som 1999, da 2 uavhengige studier rapportert at pasienter med ingen eller en minimal somatisk hypermutation (SHM) belastning (unmutated CLL, U-CLL) har en dårligere prognose enn pasienter bærer et høyere SHM byrden (muterte CLL, M-CLL)6,7. Mer spesifikt, gruppen U-CLL besto av tilfeller skjuler clonotypic IGHV gener med få eller ingen SHM og dermed en høy prosent identitet til nærmeste germline IGHV genet (≥98%), mens M-CLL besto av tilfeller med høyere mutational Last (prosent identitet til den nærmeste germline IGHV gene < 98%). Siden disse tidlige studiene, har det blitt stadig demonstrert at U-CLL tilfeller viser en kortere tid-å-første behandling (TTFT) og total overlevelse (OS) sammenlignet med M-CLL.
I ettertid markert disse banebrytende studiene pivotal rollen som B-celle reseptor (BcR) IG i CLL pathobiology, dermed banet vei for omfattende forskning i CLL-microenvironmental vekselsvirkningene som, i sin tur førte til en mer omfattende forståelse av det biologiske mangfold i denne sykdommen8,9. Nyere studier har gitt ekstra støtte for betydningen av immunogenetic analyser i CLL ved å avsløre at enkeltsaker kan klyngen i undergrupper på grunn av deling (kvasi) identisk BcR IG gensekvenser, et fenomen som betegnes BcR IG stereotypy10 ,11,12,13. Samler bevis støtter ideen om at pasienter som er tilordnet samme stereotype delsett harbor lignende clinicobiological egenskapene som skiller dem klart fra andre CLL pasienter innenfor samme SHM kategori, men med forskjellige IG gensekvenser; Det har faktisk blitt rapportert at kategorisering av CLL pasienter basert på BcR IG stereotypy videre foredler bulk segregering av CLL pasienter i U-CLL eller M-CLL grupper14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Fra en klinisk perspektiv er det bemerkelsesverdig at SHM statusen clonotypic IGHV genet synes å korrelere med en bestemt respons til chemoimmunotherapy. I spesielt M-CLL pasienter behandlet med en kombinasjon av fludarabine/cyklofosfamid/rituximab (FCR), gullstandarden behandling for medisinsk passer CLL pasienter mangler TP53 gene feil, vist betydelig lenger progresjon overlevelse (PFS) og OS sammenlignet med U-CLL pasienter som fikk samme behandling21,22,23. Derfor identifikasjon av SHM status har blitt viktig spesielt for å bistå i terapeutisk behandling av CLL pasienter dvs. en prediktiv markør, i stedet for å vurdere kliniske løpet av den sykdom dvs. en prognostiske markør. Faktisk, etter den siste oppdateringen av NCI sponset retningslinjene fra International verkstedet på CLL, bør SHM status omlegge IGHV gener være bestemt i alle CLL tilfeller før behandling innvielsen i både generelle praksis og klinisk forsøk24. Videre, på grunn av den siste godkjenningen av ny behandling agenter og det økende antallet narkotika i prøvelser, SHM status IG molekylet kan spille en enda større rolle i terapeutisk behandling av pasienter med CLL i nær fremtid5.
Denne rapporten viser alle aspekter av IG genet sekvens analyse, begynner med å velge det aktuelle materialet og kulminerte med klinisk tolkningen av sekvensering resultatene. Grundig vurdering av disse trinnene er viktig i diagnostiske rutine for produksjon av pålitelige resultater og å sikre nøyaktige pasienten lagdeling i kliniske forsøk. Protokoller er beregnet til hjelp i harmonisering av IG genet sekvens analyse, slik at resultatene er sammenlignbare blant annet laboratorier.
Protocol
Forskning protokollen ble godkjent av den etiske komiteen ved San Raffaele vitenskapelige Institutt, Milano, Italia.
1. materialvalg
-
Valget av starter materiale
Merk: I de fleste tilfeller av CLL svulst celle greven er høy på diagnose (> 80-90%). Dermed er celle sortering eller berikelse av leukemic celler vanligvis ikke nødvendig.- Hvis bruker perifert blod (PB), bruker de vanligste materiale til valg for IG genet sekvens analyse, en blodvolum mellom 10-20 mL.
- Også i tilfeller med en lav CLL celle byrde, bruke celle sortering av PB prøver eller materiale fra andre vev, som benmargen (BM) eller lymfeknuter (LN).
-
Prøvetidspunkt
- Prøvetidspunktet er ikke avgjørende at statusen IG SHM er stabil overtid; som sagt, unngå prøvetaking i visse perioder, som umiddelbart etter eller i løpet av terapi, siden det lave antallet CLL celler kan komplisere analyse og føre til upålitelige resultater.
-
Materielle innsamling og oppbevaring
Merk: Innsamling og lagring av starter materiale avhenger sterkt på materialvalg.- For PB eller BM, bruk EDTA eller CPT (citrate-tris-pyridossalphosphate) samling rør for å hindre hemming av PCR forsterkning prosessen; alternativt bruke heparin rør.
- For LN prøver er samlingen enten celle suspensjoner, biopsier fra frisk frossent eller, i sjeldne tilfeller formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev.
2. tetthet gradert separasjon
Merk: Hvis PB eller BM utgangsmaterialet valgfrihet, som er det vanligste scenariet, anbefales mononukleære cellen aisolering bruker tetthet gradert separasjon.
- Legge til 200 µL av EDTA (0,5 M EDTA / pH 8.0) til en 50 mL steril samling rør. Legge til 20 mL av PB og 15 mL RPMI. Blandingen av pipettering (2 - 3 ganger er tilstrekkelig).
- Legge 15 mL av tetthet gradert medium til en ny 50 mL samling rør.
Merk: I tilfelle PB volumet er mindre enn 20 mL, volum av RPMI (forrige trinn) og tetthet gradert bør endres tilsvarende. - Sakte laget i løsningen fra trinn 2.1 slik at det ikke avbryter graderingen. Sentrifuge 800 x g i 20 minutter med sentrifuge bremsen av.
- Samle mononukleære celle ringen som har dannet mellom øvre plasma/Platederivert laget og tetthet gradert middels laget med en bakteriefri Pasteur pipette, deretter overføre til et sterilt 15 mL samling rør.
- Legg RPMI til et siste volum på 12 mL og bland. Sentrifuge 750 x g i 8 minutter. Kast nedbryting.
- Gjenta trinn 2.5 resuspend celle pellet bruker 10 mL av RPMI.
- Oppløse celle pellet i 1 mL av PBS (DPBS, ingen kalsium, magnesium ingen). Utføre en celletall bruker en Neubauer plate ved å blande 20 µL av prøve og 80 µL av 1:10 Türks løsning.
- Hvis nedstrøms behandling av prøven ikke er planlagt for den samme dagen, sentrifuge prøven på 750 x g i 8 minutter. Forkaste nedbryting og lagre celle pellet på-80o C.
3. nukleinsyre utvinning
- Bestemme et substrat for analyse av SHM status av IG gener. Genomic DNA (gDNA) er det mest populære valget som det er ikke behov for et omvendt transkripsjon trinn; Alternativt, bruk av RNA/komplementære DNA (cDNA) sikrer at, minst på transcriptional nivå, produktivt og funksjonelt clonotypic IG omorganisering "begunstiget" målet.
- Bruk en av mange kommersielt tilgjengelig kits egnet for gDNA eller totalt RNA utvinning og syntese av cDNA (se Tabell for materiale).
- Vurdere integritet av DNA eller RNA bruker følsom nukleinsyre kvantifisering systemer. Hvis bruker FFPE materiale for analyse, vurdere kvaliteten og kvantiteten av utdraget gDNA/cDNA av PCR forsterkning med et kjent housekeeping, f.eks retinoic acid reseptor alfa (RARa), beta-utgangen, osv.
4. forsterkning og sekvensering av IGHV-IGHD-IGHJ Gene Rearrangements
-
IGH PCR primer utvalg
- Helst utføre multiplex PCR med IGHV undergruppe bestemt 5' primere og IGHJ gene bestemt 3' primere25,26. Hvis resultatene er sub-optimale, Forbered separat PCR blander bruker enkelt IGHV undergruppe-spesifikke primere.
- Bruke 5' primere som anneal enten den leder regionen umiddelbart oppstrøms av IG omorganisering eller koding regionen (f.eks rammeverk 1, FR1) av IGHV genet.
- Bruk leder primere som tillater forsterkningen på hele omorganisert IGHV-IGHD-IGHJ gen-rekkefølge, som igjen lar SHM nivåer nøyaktig estimering. Dermed anbefales IGHV leder primere av ERIC i deres oppdaterte retningslinjer for IG genet sekvens analyse27.
- I tilfeller der leder primere mislykkes å forsterke clonotypic IG omorganisering, bruk IGHV FR1 primere. Imidlertid forsterke framework primere ikke hele clonotypic IG genet omorganisering, som kan føre til unøyaktige fastsettelse av hvilket SHM. For denne filmmanuskriptet, klart i klinisk rapporten at bruk av IGHV FR1 primere kan overvurdere den sanne prosent identiteten til nærmeste germline genet.
- 3 til slutt bruke konsensus primere målretting IGHJ gener, multiplex sett av IGHJ genet-spesifikke primere eller isotype-spesifikke primere, avhengig av underlaget. Primer sekvenser er gitt i tabell 1, mens figur 1 viser de ulike stedene for primer avspenning.
-
PCR forsterkning av IGHV-IGHD-IGHJ gene rearrangements
- Klargjør primer blandingen ved hjelp ekvimolare mengder hver undergruppe primer(s) for å sikre objektive forsterkning.
- For eksempel når du bruker leder primere, brukes to forskjellige primere til å forsterke rearrangements tilhører undergruppen IGHV1. Dermed bruke disse 2 primere (IGHV1L og IGHV1bL) som er halvparten sammenlignet med IGHV4L, som er den eneste primeren for IGHV4 undergruppe rearrangements.
- Bruke det motsatte tilnærmingen i IGHJ1-2 og IGHJ4-5 primerne. Som disse veiledningene målet to forskjellige IGHJ gene undergruppene, doble antallet i forhold til IGHJ3 og IGHJ6 primere.
- Bruk tabell 1 for å fastslå nøyaktig primer antallene når forbereder relevante primer mikser.
- Mix PCR reagensene som er oppført i tabell 2. Når du kombinerer alle PCR reagenser i et PCR-rør, legge til 0,5 µL av Taq utvalg og 100 ng gDNA eller 2 µL av cDNA (cDNA bør være forberedt med 1 µg av).
Merk: En Taq enzym med korrekturlesing aktiviteten er ikke viktig som forsterkning feil er ekstremt lav og påvirker derfor ikke nivået av SHM. - Kjøre termiske PCR protokollen i tabell 3.
- Klargjør primer blandingen ved hjelp ekvimolare mengder hver undergruppe primer(s) for å sikre objektive forsterkning.
-
Clonality vurdering
Merk: En kritisk neste trinn omfatter evaluering clonality mønster av PCR produktet. Når du vurderer clonality i CLL pasienter, er de vanligste funn et enkelt, monoklonale topp/band.- Bruke metoder med høy følsomhet, som fragment eller heteroduplex analyse, clonality vurdering28,29.
- Fragment analyse
- Utføre multiplex PCRene 5'-merket IGHV leder eller FR1 undergruppe bestemt PCR primere; Dette vil gi PCR produkter som kan skilles av kapillær geleelektroforese, og dermed tillater clonality vurdering av IGH PCR produkter basert på deres IGHV komplementaritet bestemme regionen 3 (CDR3) lengder.
- Bruke primere, reagenser og varmeforhold identisk med de tidligere nevnte (se tabellene 1-3). Egendefinerte 5´-merket primere merket fluorescently oligos med et utvalg av fargestoffer på 5' end. Eksempler på reporter fargestoffer er 6-FAM, HEX, NED eller TET. Dermed er 2 separate reaksjoner nødvendige basert på bruk av 3 forskjellige fargestoffer per reaksjon.
- Vurdere størrelsen på PCR produktene på en seks prosent (6%) polyakrylamid gel (denne prosentandelen resulterer i optimal oppløsning), bruker 1 x TBE som kjører buffer. Kjører på 80 V for 45 min.
Merk: Det anbefales at PCR produkter er tillatt å overføre på gel for tilstrekkelig tid slik at monoklonale prøver kan skilles fra polyklonale bakgrunnen og DNA størrelse markøren kan skille tilstrekkelig. Faktorer som størrelse og tykkelse av gel kan påvirke overføringen så ingen enkelt innstilling (spenning og tid) kan garantere en optimal resultat som angir spenningen på 80 V i 45 minutter er et godt utgangspunkt som minimerer risikoen for eksempel migrerer også raskt og 'kjører' av gel. - Sjekk for PCR produkter av ca 500 base parene ved IGHV leder primere og 350 base parene ved IGHV FR1 primer mikser.
Merk: I sjeldne tilfeller-CLL tilfeller har blitt funnet bære double, monoklonale produkter og i enda sjeldnere tilfeller tilfeller kan ha et oligoclonal mønster. En intercalating agent som Ethidium bromide (EtBr) eller mindre farlig og mer følsom kommersielt tilgjengelig DNA flekker kan brukes for visualisering av DNA på akrylamid gels med UV eksitasjon eller blått lys.
-
PCR produktet rensing
Merk: PCR produkter er renset for å fjerne enhver polyklonale bakgrunn som stammer fra normale B celler innenfor CLL eksempel samt primer dimers som kan føre til suboptimal sekvensering. Noen måte som fjerner kommunefritt dNTPs og primere for PCR rydde opp, som en enzymatisk behandling, f.eks Sap (reker alkalisk fosfatase) / Exo (Exonuclease jeg), eller kolonnen-baserte rensing.- Laste det totale volumet av PCR-produktet på en 3% lav-smeltende agarose gel.
- Tillate PCR produktene å kjøre på gel til de skille fra bakgrunnen.
- Avgiftsdirektoratet de skarpe, fremtredende PCR bandene, rense og elute. Hvis to rearrangements oppdages, begge bandene bør kreditert og sekvensielt separat.
- For å utføre Sap/Exo opprydding, følg produsentens instruksjoner om bestemte volumene å bruk; men en vanlig reaksjon kan inneholde 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo og 2 µL 5 x inkubasjon buffer per 5-10 µL PCR reaksjon. Blande av forsiktig vortexing hvert utvalg og ruge på PCR blokk på 37 ° C i 30 minutter. Deaktiver enzymene av oppvarming til 85 ° C i 15 minutter.
- Legg en liten mengde PCR produktene på en 3% agarose gel å vurdere renheten av produktet.
5. Sanger sekvensering
Merk: Flere sekvensering strategier finnes, men uansett nøyaktig tilnærming, direkte sekvensering av både tråder er obligatorisk å sikre et pålitelig resultat.
-
De generelle sekvensering protokoller
- Hvis forsterkning er utført med enkelt primere, fortsette med sekvensering bruker riktig IGHV - og IGHJ- eller konstant region-spesifikke primere. Denne tilnærmingen kan også vedtas hvis multiplekset fluorescently merket primere brukt og PCR produktet ble vurdert fragment analyse (sekvensering primere ikke skal være merket).
- Hvis multiplex primere brukt og clonality ble vurdert en gel, deretter bruke en nedstrøms primer på første trinn i sekvensering f.eks konsensus IGHJ primer med sekvensen blir 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 ". En CH primer kan også brukes hvis cDNA ble brukt som underlag. Deretter Bruk undergruppe-spesifikke IGHV leder eller FR1 primere for andre sekvensering trinn.
-
Eksempel sekvensering protokollen
Merk: Flere sekvensering protokoller finnes og en eksempel-protokoll er beskrevet nedenfor.- Fortynne 33 ng PCR produktet i et totalt volum på 11,5 µL bruker, f.eks sterilt vann. Denature PCR produktet ved å varme til 95 ° C i 5 minutter. Umiddelbart plassere på isen i 10 minutter å hindre dannelse av sekundær strukturer.
- Legge til 8 µL av master mix hver rør sammen med 0,5 µL (tilsvarende 5 pmol) av primer.
- Som en kontroll, forberede et rør som inneholder 8 µL av master mix, 0,5 µL pUC18 kontrollmal, 2 µL (-) 47 sekvensering primer og 9,5 µL sterilt vann. Siste totalvolumet i hver retning skal 20 µL.
- Bruke termisk sykling betingelser for sekvensering reaksjonen som beskrevet i Tabell 4.
- Forberede stoppløsningen ved å blande 2 µL av natrium acetate 3M (pH 5.2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8.0) og 1 µL av glykogen (konsentrasjon 20 mg/mL), deretter legge 5 µL til hvert utvalg. Overføre produktet til en ny microcentrifuge tube.
- Legg til 60 µL av 100% etanol (20 ° C) og bland forsiktig. Sentrifuge på 14 000 rpm i 15 minutter (4 ° C). Kast nedbryting.
- Legg 100 µL av 70% etanol (20 ° C) og bland forsiktig. Sentrifuge på 14 000 rpm i 10 minutter (4 ° C). Kast nedbryting. Gjentas én gang.
- Tørr pellet for 90 minutter ved romtemperatur. Legge til 40 µL av natrium dodecyl sulfate (SDS) løsning for hvert utvalg.
- Overføre prøven til en sekvensering plate, dekk med stripe caps eller tape sel, laste til maskinen og utføre Sanger sekvensering. Sekvensering platen er vanligvis en 96-brønnen, v-bunn, full-skjørt PCR platen kompatible med sequenceren. Platene kan være barcoded avhengig av om sekvensering er utføres internt, på kommersielle selskap eller en akademisk sekvensering center/plattform.
- Etter sekvensering, 'Sy sammen' den 2 lest generert fra punktene personlige sekvensering å danne et komplett IGHV gene omorganisering dvs konsensus sekvensen.
6. sequence Analysis
Merk: Følgende deler fokus på utgang hentes fra IMGT/V-QUEST verktøyet30 når du analyserer omorganisert IG sekvenser og IMGT/JunctionAnalysis31, begge er spesielt relevant for klinisk rapportering og forskning studier. IMGT/V-QUEST er en justering verktøy som sammenligner bruker innsendt IG sekvenser med IMGT referanse katalogen angir30. Verktøyutdataene inneholder flere avsnitt som brukeren kan definere visse parametre.
- Angi arter, f.eks Homo sapiens (human), og reseptor type eller locus (f.eks IGH, IGK eller IGL).
- Lim inn sekvenser å bli analysert, i FASTA format og med overskrifter, i tekstområdet (i grupper på opptil 50 sekvenser per kjørt). Alternativt, et alternativ for å angi banen til en lokal fil som inneholder FASTA sekvensene er gitt.
- Velg ett av følgende 3 visningsalternativene for resultatene:
- Detaljert visning: Velg dette alternativet for å få resultatene for hver individuelt.
- Syntese view: Velg dette alternativet for å kompilere en sammendragstabellen bestilt av IGHV genet og allel eller av sekvens inndata. Dette alternativet gir også en justering av sekvenser som, i alle innsendte bakst, tilordnes til samme IGHV genet og allel.
- Excel-fil: Velg dette alternativet for å gi alle utdatafiler som regneark innlemmet i en enkelt fil. Alle visningsalternativer har et stort utvalg av grunnleggende og avanserte parametere å velge mellom, men bare faktorene som er mest relevant for CLL IG sekvens analyse er beskrevet nedenfor under 'Representant resultater'.
7. arrestasjonen/AssignSubsets verktøyet
- Undersøke BcR IG stereotypy innenfor CLL (flere detaljer nedenfor i avsnittet 'Representant resultater'), kan du sende IGHV-IGHD-IGHJ FASTA sekvenser arrestasjonen/AssignSubsets verktøyet32. Verktøyet rapporterer oppdraget til store CLL stereotype delsett. Verktøyet delsett-tildeling med nøyaktige instruksjoner er tilgjengelige på arrestasjonen/AssignSubset nettsted32 og også på ERIC nettsiden under kategorien tjenester.
Representative Results
Eksemplene nedenfor illustrerer resultatene fra IG genet sekvensering analyse følgende fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Selv om DNA og/eller RNA utvinning rutinemessige prosedyrer for de fleste kliniske/forskning laboratorier, innebærer et kritisk første å sjekke kvalitet/kvantitet av gDNA og/eller RNA med et spektrofotometer eller andre passende teknologi med høy følsomhet. Neste viktige trinn innebærer PCR forsterkning av clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering. Som nevnt ovenfor, gjør bare bruk av IGHV leder primere forsterkning av hele lengden av omlegge IGHV gene sekvensen, og tillater sant SHM lasten til fastslås. IGHV leder primere er derfor anbefalt primer valg (figur 2). I sjeldne tilfeller der IGHV leder primere ikke forsterke clonotypic IG omorganisering kan IGHV FR1 primere brukes. Som vises i Figur 3, kan flere PCR produktene/band observeres, spesielt når gDNA er utgangsmaterialet; disse bandene bør kreditert og sekvensielt separat. Hvis både IGHV leder og IGHV FR1 primere ikke gir resultater, bør analysen gjentas ved å bruke en ny pasient utvalg (når mulig). Siste sjekkpunkt før sekvensering bestemmer clonality av prøven fragment analyse (Figur 4).
Sekvenser innhentet skal analyseres ved hjelp av IMGT/V-QUEST verktøyet30. Brukervalgt parametere inkluderer arter, reseptor type eller locus, Søk etter innsetting og overstrekingen valgmuligheten, etc. og er oppført og antall sekvenser analysert. Hver FASTA sekvensen vises og V-DOMENET analysert av IMGT/V-QUEST er uthevet i grønt. I tillegg, hvis inndata sekvens var i motsatt retning (antisense), gir utfyllende reversere rekkefølgen og automatisk sier dette over FASTA sekvensen.
Resultatet Sammendrag gis rett under FASTA sekvensen, på toppen av en detaljert visning fører siden og inneholder informasjon som er viktig for klinisk rapportering av IG genet sekvens analyse i CLL. Hver rad i tabellen er forklart nedenfor.
Sammendraget. Den første raden i resultatene tabellen sier funksjonaliteten til inndatasekvensen: en IG omorganisert sekvens kan være produktive eller uproduktive (figur 5A og 5B). En IG genet omorganisering er uproduktive hvis stopp kodon finnes i V-D-J-området (for VH) eller i V-J-regionen (VL) og/eller hvis omorganisering er ut-av-bilde på grunn av innsettinger/slettinger. En tredje utgang ved funksjonaliteten ikke kan fastslås, dvs. hvis IGHV-IGHD-IGHJ krysset ikke kan identifiseres; i dette tilfellet ville sammendraget lese som 'Ingen omorganisering funnet' eller 'Nei krysset funnet'. Det er viktig å merke seg at bare produktiv og dermed funksjonelle rearrangements bør analyseres videre. Hvis eneste forsterket IG omorganisering fungerer ikke (uproduktive eller 'ingen omorganisering funnet'), PCR forsterkning prosessen skal gjentas. Hvis resultatet forblir negativ bør en ny pasient prøve oppnås.
V-GENET og allel. Raden "V-GENET og allel" angir nærmeste germline IGHV genet og allel med sin justering score og prosent identiteten. Hvis flere gene(s) og alleler gir samme høy score, er alle oppført. Prosent identiteten mellom sendte sekvensen og nærmeste IGHV genet og allel er spesielt viktig siden det avgjør SHM status. Denne verdien beregnes fra den første nucleotide i V-regionen til 3 slutten av V-regionen unntatt CDR3. Hvis IGHV FR1 primere, bør alltid sekvensen tilsvarende som i primer fjernes for å sikre så nøyaktig resultat som mulig. Det bør bemerkes at lav identitet prosent (< 85%) kan skyldes en innsetting eller sletting (drøftet nærmere nedenfor) og skulle dette være tilfelle en 'Advarsel' Merk vises i raden 'Sammendraget' å varsle brukeren.
J-GENET og allel. Som beskrevet for V-genet og allel ovenfor, angir raden 'J-GENET og allel' nærmest germline IGHJ genet og allel med sin justering score og prosent identiteten. IGHJ genet er ganske kort og 5' slutten kan har blitt beskåret grunnet exonuclease aktivitet, gjennomsøkes imidlertid også alternative valg av verktøyet, basert på det høyeste antallet påfølgende identiske nukleotider.
D-GENET og allel av IMGT/JunctionAnalysis. Den hadde-GENET og allel av IMGT/JunctionAnalysis' angir nærmeste germline IGHD genet og allel med D-regionen lesing rammen identifisert av verktøyet i brukeren sekvensen. IMGT/JunctionAnalysis31 gir en detaljert og nøyaktig analyse av krysset, og har blitt integrert i IMGT/V-QUEST verktøyet grensesnittet. Dette verktøyet administrerer alle aspekter av problemer knyttet til IGHD gene og allel identifikasjon dvs (i) den korte lengden av D-regionen; (ii) bruk av 2 eller selv 3 lese rammer; (iii) exonuclease trimmer i begge ender av genet; og (iv) tilstedeværelsen av mutasjoner.
FR-IMGT lengder, CDR-IMGT lengder og AA JUNCTION. Denne raden inneholder IGHV FRs og CDRs vises i hakeparenteser og adskilt med punktum og aminosyre (AA) krysset. AA sekvensen av krysset illustrerer (i) en i - eller ut-av-ramme omorganisering (ut på ramme posisjoner er angitt med '#' tegn), (ii) tilstedeværelse eller fravær av stopp kodon (en stopp codon vises med en stjerne "*"), og (iii) tilstedeværelse eller fravær av den ankere av VH CDR3-IMGT: C (2-CYS 104) og W (J-TRP 118).
Somatiske hypermutations består hovedsakelig av single nukleotid endringer, men liten innsettinger og slettinger i V-regionen kan observeres, om enn på en mye lavere frekvens33. Når bruker standard IMGT/V-QUEST parametere, innsettinger og slettinger automatisk gjenkjennes ikke; men sterke indikasjoner på at en sekvens kan bære slike endringer, dvs. en lav prosent identitet eller IGHV CDR1-IMGT og CDR2-IMGT lengder mellom presentert brukeren sekvensen og nærmeste germline genet og allelet, oppdages av den verktøyet og en advarsel vises under resultater sammendragstabellen (figur 5C).
IMGT inneholder en valgmulighet kalt "Søk for innsettinger og slettinger" i delen "Avanserte parametere" under avsnittet 'visningsresultater'. I tilfeller hvor relevante advarsler vises, er det anbefales å bruke denne funksjonaliteten. Når innsettinger og slettinger oppdages, er omfattende detaljer om funn angitt i delen 'Resultatsammendrag' inkludert (i) der innsetting eller sletting er plassert dvs VH FR-IMGT eller CDR-IMGT; (ii) antall inn/slettet nukleotider; (iii) sekvens (bare for innsettinger); (iv) om en frameshift har oppstått; (v) V-regionen codon som starter innsetting eller sletting; og (vi) berørte nukleotid plasseringen i de innsendte sekvens (figur 5 d). For innsettinger, verktøyet fjerner insertion(s) fra innsendte bruker sekvensen og deretter nytt analyserer sekvensen ved hjelp av parameterne for standard IMGT/V-QUEST. Hvis slettinger blir funnet, legger verktøyet hull, representert av prikker, erstatte de slettede nukleotider før gjenta analysen.
Som for hver diagnostiske eller prognostiske test utført i kliniske laboratorier, er strenge standarder og høy reproduserbarhet av største betydning. IMGT/V-QUEST-utgangen gir mye av informasjonen som er nødvendig for rapportering resultatene av IG genet sekvens analyse i CLL, dvs. (i) til IGHV, IGHD og IGHJ gener og alleler utnyttet; (ii) funksjonaliteten til clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering dvs. om omorganisering er produktiv eller unproductive; og (iii) prosent identiteten til de snudde IGHV genet og allel i forhold til sin nærmeste germline IGHV gene og allel. Omfattende informasjon om kliniske rapportering av IG gener i CLL, tolkningen av problematisk eller teknisk utfordrende tilfeller og anbefalinger for nøyaktig og robust fastsettelse av IGHV genet SHM status i CLL, er leseren rettet til sist oppdatert ERIC retningslinjer og rapporter27,34.
Til slutt, på grunn av vår voksende kunnskap om BcR IG stereotypy i CLL, et ekstra Anbefalte krav for klinisk rapportering av IG genet rearrangements i CLL gjelder tildelingen skal store stereotype delsett. Det anbefales nå til tilstanden i klinisk rapporten om den analyserte produktive IGHV gene omorganisering kan tilordnes til en av de store stereotype delsettene, nemlig delsett #1, #2, #4 eller #812,27. Tildeling til store CLL stereotype delsett bør utføres med bruk av arrestasjonen/AssignSubsets verktøyet (figur 6)32.
| 5' IGHV FR1 primere | Primer sekvens | Antallet for 60 μL av primer | |
| IGHV1 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG | 10 | |
| IGHV2 | CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV3 | GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV4 | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG | 10 | |
| IGHV5 | GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC | 10 | |
| IGHV6 | CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG | 10 | |
| 5' IGHV leder primere | |||
| IGHV1L | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG | 5 | |
| IGHV1bL | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) | 5 | |
| IGHV2aL | AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (EN/C) AC | 5 | |
| IGHV2bL | AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC | 5 | |
| IGHV3aL | AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC | 5 | |
| IGHV3bL | AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (EN/C/T) GC | 5 | |
| IGHV4L | AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT | 10 | |
| IGHV5L | AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC | 10 | |
| IGHV6L | AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC | 10 | |
| 3 IGHJ primere | |||
| IGHJ1-2 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 20 | |
| IGHJ3 | TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC | 10 | |
| IGHJ4-5 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC | 20 | |
| IGHJ6 | TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC | 10 | |
Tabell 1. Primer sekvenser og antall for PCR forsterkningen på clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering.
| Reagens | Volum (μL) |
| RB x 10 buffer | 5 |
| MgCl2 (50 mM) | 3 |
| dNTPs (10 mΜ) | 2 |
| Primer IGHV leder/FR1 blanding (10 μM) | 3 |
| Primer IGHJ blanding (10 μM) | 3 |
| H2O | 31,5 |
| Totalt volum | 47.5 |
Tabell 2. Reagensene PCR forsterkningen på clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering.
| Temperatur | Varighet | Syklus nummer | Beskrivelse |
| 94 ° C | 5 minutter | 1 | polymerase aktivisering |
| 94 ° C | 1 minutt | 39 | rødsprit |
| 59 ° C | 1 minutt | avspenning | |
| 72 ° C | 1,5 minutter | utvidelse | |
| 72 ° C | 10 minutter | 1 | endelig utvidelse |
| 18 ° C | ∞ | 1 | bevaring |
Tabell 3. Termisk sykling betingelser for PCR forsterkningen på clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering.
| Temperatur | Varighet | Syklus nummer | Beskrivelse |
| 94 ° C | 5 minutter | 1 | polymerase aktivisering |
| 96 ° C | 20 sekunder | 30 | rødsprit |
| 50 ° C | 20 sekunder | avspenning | |
| 60 ° C | 4 minutter | utvidelse | |
| 4 ° C | ∞ | 1 | bevaring |
Tabell 4. Sykling varmeforhold for IG genet sekvensering reaksjonen.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av en IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering med ulike primer annealing steder angitt. 5 IGHV primere anneal leder sekvensen som finnes oppstrøms av IGHV koding sekvensen. 5 IGHV rammeverk (FR) primere anneal til starten av regionen FR1, som ligger innenfor omlegge IGHV genet, mens 3 IGHJ primerne anneal til slutten av omlegge IGHJ genet. UTR: uoversatt regionen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. PCR forsterkning av IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering i 7 pasientprøvene bruker 5' IGHV leder primere. Åttende kjørefelt representerer en positiv kontroll mens kontrollen negative for PCR ble lastet inn i niende kjørefelt. Forventet PCR produktet er ca 500 base parene i størrelse når du bruker IGHV leder primere. Stjernen i den siste kolonnen gel angir 100 bp DNA stigen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. PCR forsterkning av IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering i 13 pasientprøvene bruker IGHV FR1 primere. Fjortende kjørefelt inneholder positivt kontrollen mens negative kontrollen ble lastet inn femtende kjørefelt. Som dokumentert i kjørefelt 2, som DNA var utgangsmaterialet, er flere PCR band observert, som bør være forbrukeravgift og sekvensert separat. Eksemplene i baner 5, 7 og 13 gitt polyklonale resultater (dokumentert av smear i gel), og dermed PCR trinnet skal gjentas. Hvis en andre PCR ikke forsterke omlegge IG gene(s) analysen bør utføres på et nytt utvalg (hvis mulig) eller bruke en annen primer sett. Forventet PCR produktet er ca 350 base parene i størrelse når du bruker IGHV FR1 primer mikser. Stjernen i den siste kolonnen gel angir 100 bp DNA stigen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Vurdering av clonality genescan analyse. I genescan analyse gir monoklonale PCR produkter opphav til en dominerende topp fluorescerende produkter av samme størrelse (øvre panel), mens polyklonale PCR produkter føre mer vanlig fordeling av produktet størrelser (nedre panel). Rød spor er topper fra en fluorescently merket DNA stige som lastes inn i samme kapillært injeksjon som prøven blir analysert. Størrelse standard fragmenter er utsatt for samme electrophoretic kraft som prøven og er dermed utsatt for samme injeksjon vilkår. Uniform avstanden av størrelse standard fragmenter bekrefter nøyaktig størrelse ringer. Blå spor representerer monoklonale (toppanelet) eller polyklonale (nedre panelet) innholdet i prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Eksempler på resultatet Sammendrag tabellene fra IMGT/V-QUEST. (A) resultatet sammendragstabellen for en produktiv IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering (ingen stopp codon(s) og en i-ramme sekvens krysset). V-GENET og allel og J-GENET og allel identifisert i brukeren sekvens av IMGT/V-QUEST i dette tilfellet er IGHV4 - 34 * 01 og IGHJ6 * 02 (basert på høyeste justering score evalueringen). Prosent identiteten er 99.65% på grunn av en enkelt somatiske mutasjon. D-GENET og allel identifisert av IMGT/JunctionAnalysis er det IGHD3 - 3 * 01 lese ramme 1. Lengden på regionene 4 framework (FRs) samt 3 komplementaritet avgjørende regionene (CDRs) angis i parentes. Aminosyre (AA) rekkefølgen på IGHV-D-J krysset tilbys også. I dette eksemplet krysset består 22 AAs. (B) resultatet sammendragstabellen for en IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering sekvens som er uproduktive på grunn av en ut-av-ramme junction. En X i hele CDR3-IMGT angir at for denne sekvensen lengden ikke kunne fastslås. '#' Tegn i AA krysset sekvensen angir en frameshift. (C) resultatet sammendragstabellen varsling av lave V-regionen identitet (60,94%) og indikerer at alternativet "innsettinger og slettinger" i delen 'Avanserte parametere' skal brukes. (D) resultatet sammendragstabellen for saken med germline lav prosent identitet illustrert c etter gjentatte sekvens analyse ved hjelp av alternativet "Søk etter innsettinger og slettinger". Riktig identitet prosent vises i parentes og beregnet vurderer innsetting som en mutational enkelthendelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Delsett tildelingstabell rapporten genereres av verktøyet arrestasjonen/AssignSubsets. FASTA IG sekvenser fra 10 CLL pasienter (A1-A10) ble sendt til arrestasjonen/AssignSubsets verktøyet. Små A4 ble tildelt CLL stereotype delsett #2 (pasienter i denne gruppen er kjent for å ha en dårlig prognose uavhengig av SHM Last) med høy visshet. Syv av andre tilfeller/sekvenser ble ikke tilordnet en stor stereotype del og derfor klassifisert som ikke-tilordnede. To av de innsendte sekvensene (A7 og A8) kan ikke brukes for delsett tildeling og ble i stedet klassifisert som hoppet/ugyldig på grunn av problemer med sekvensen, dvs., på grunn av en ut-av-ramme veikryss eller tilstedeværelse av stopp kodon. En omfattende forklaring av tabelloverskriftene og verktøyet er tilgjengelig på arrestasjonen/AssignSubsets nettsted32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Studiet av IG gener i CLL har vært avgjørende ikke bare for å gi en bedre forståelse til sykdom pathobiology, men også for å forbedre pasientens risiko lagdeling. Det er derfor viktig at flere trinn prosedyren av IG genet sekvens analyse og påfølgende tolkningen av sekvens dataene er utført på en standardisert måte. Tilgjengeligheten av egnet og tilstrekkelig pasienten materialet og tidspunkt for prøvetaking bør ikke påvirke muligheten til å utføre IG genet mutational analyse siden testen kan utføres på PB og enhver prøven med en høy CLL svulst celle teller. Separasjon av blod mononukleære celler med gradient separasjon metoder utføres rutinemessig i laboratorier, og som alltid, bør man være forsiktig når du legger til blod/RPMI løsningen til røret som inneholder til gradienten; denne oppgaven bør utføres på en langsom, mild måte å unngå å forstyrre graderingen og hindre tap av celler.
Etter celle separasjon pakkes nukleinsyrer. Både gDNA og cDNA er egnet for SHM analyse av clonotypic IGH omorganisering, men det er fordeler og ulemper for bruk av enten materiale. Laboratoriet arbeidsflyten går raskere når du bruker gDNA siden ikke motsatt transkripsjon må utføres før PCR forsterkning. Det sagt, bruker gDNA som substrater for PCR kan resultere i forsterkningen på både produktiv og unproductive rearrangements som igjen kan føre til ytterligere hands-on laboratoriearbeid, dvs. rensing eller gel excision av flere PCR-produkter og personlige sekvensering av alle rearrangements. Når du sammenligner gDNA og cDNA tilnærminger, sistnevnte må en omvendt transkripsjon trinn utføres før du fortsetter med PCR forsterkning. Men i dette tilfellet, for de fleste tilfeller bare produktiv IG rearrangements forsterket og deretter sekvensielt. Dermed er bare ett PCR produkt renset og sekvensert, resultater tolkningen er mer ukomplisert.
Effektiviteten av forsterkning avhenger i stor grad på kvaliteten på gDNA/cDNA, som bør vurderes en følsom kvantifisering metode og primerne utnyttet. Primere brukt er kritisk i hele analytiske prosedyren fordi nøyaktig bestemmelse av SHM nivået kan bare oppnås ved å forsterke hele sekvensen av omlegge IGHV genet. En full lengde omorganisering kan bare vurderes hvis du 5' IGHV leder primere, dermed rettferdiggjøre siste anbefalingene av ERIC for bruk leder primere27. Bruk av alternative primere, fører til forsterkning av ufullstendig IGHV-IGHD-IGHJ gene rearrangements, passer ikke for IGHV gene mutational analyse, og derfor frarådet sterkt. Unntaket gjelder saker som gjentatte ganger gi negative resultater når IGHV leder primere brukes og analyse av nye pasienten materialet er enten ikke mulig eller også gjør ikke gir resultater. Hvis bruk av en annen pasient prøve og/eller materiale (gDNA/cDNA) og forskjellige primere setter fortsatt ikke produsere et PCR-produkt, mulige årsaker kan være at svulst celle byrden for lavt ikke eller at lymphocytosis på grunn av en CLL klone (da det immunophenotype bør vurderes på nytt). Primere brukt for analyse bør alltid være angitt i klinisk rapporten.
Som CLL resultater fra akkumulering av monoklonale B celler som bærer den samme IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering, for de aller fleste tilfeller clonality vil vurdering avdekke en unik monoklonale topp, dvs. en enkel klone. I sjeldne tilfeller kan dobbel rearrangements eller selv oligoclonal mønstre observeres35. I slike tilfeller gel geleelektroforese er ikke den foretrukne metoden for clonality vurdering og mer følsomme metoder som fragment analyse bør brukes. Når clonality har blitt bekreftet, gjelder det siste trinnet før sekvensering rensing av PCR produktet slik at sekvenser av høy kvalitet er oppnådd. Endelig er verktøyet IMGT/V-QUEST ressursen anbefalt IG sekvens analyse av ERIC. IMGT databasene er kontinuerlig oppdatert og rapportere resultater i en konsistent og godt kommentert måte, dette verktøyet sikrer standardisert analyse og forenkler komparativ analyse blant forskjellige kliniske eller akademiske fasiliteter.
Immunogenetic analyse i CLL har Prognostisk og, spesielt, prediktiv implikasjoner, robust analyse av IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering inkludert oppdraget til store CLL stereotype delsett, er bare ikke lenger ønskelig, men viktig. Dette er spesielt tydelig i denne tid med romanen legemiddelselskap og potensialet som IG genet analyse guide behandling beslutninger5,21,22,23,36,37 ,38, som offisielt angitt med den siste oppdateringen av NCI sponset retningslinjene fra International verkstedet på CLL24. At sa, strenge standarder er berettiget, særlig ettersom fastsettelse av SHM statusen til clonotypic omorganisert IGHV gene i CLL pasienter er ikke en triviell sak og innebærer en flertrinnsprosess. Viktigere, enkelte eksperimentelle trinn, særlig valg av primere, gi bedre resultater når spesifikke alternativer og/eller tilnærminger følges, andre tekniske aspekter er mottakelig for noen grad av fleksibilitet, som materiale eller metode for å vurdere clonality, skyldes det faktum at de fører til små forskjeller, hvis noen, med hensyn til det endelige resultatet.
Det siste tiåret, har ERIC forsøkt å fremme standardisering og harmonisering av ulike relevant for CLL diagnostikk og prognostication. Dette gjenspeiles i publiserte anbefalinger og retningslinjer for immunogenetic analyse27,34, mange organisert pedagogiske verksteder og hendelser, etablering av en IG nettverk, samt en ekspert online forum til Diskuter og gi veiledning om IG genet sekvens tolkning i CLL. Det overordnede målet med ERIC gjennom disse handlingene er å fremme optimal klinisk forvaltning og pasient. Til tross for intens innsats, oppgaven er langt fra fullstendig, og faktisk blitt mer komplisert på grunn av utviklingen av romanen høy gjennomstrømming sekvensering rettet immun profilering. Likevel, selv om utfordringene vedvarer, intens innsats for robust standardisering av IG genet analyse i CLL fortsette og er fokus for pågående aktiviteter innen ERIC.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante interessekonflikt avsløre.
Acknowledgments
Vi takker nåværende og tidligere medlemmer av våre forskningsgrupper, IgCLL gruppe og ERIC, for deres engasjement og entusiasme i å studere immunogenetics i CLL. Vi ønsker også å erkjenne tillitsfullt samarbeid med alle medlemmene av IMGT/CLL-DB initiativ og, spesielt, Professor Marie-Paule Lefranc og Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Université Montpellier II, Montpellier, Frankrike, og IMGT, det internasjonale ImMunoGeneTics informasjonssystemet, for deres enorme støtte og hjelp med IG genet sekvens analyse. Dette arbeidet var støttes delvis av tilskudd fra TRANSCAN-179 ROMANEN JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (etterforsker Grant #20246 og spesielle Program molekylær Clinical onkologi-5 promille #9965), Milano, Italia; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Roma; Svenske Cancer Society, svenske Forskningsrådet, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Uppsala universitet, Uppsala universitetssykehus og løven Cancer Research Fundation, Uppsala; ODYSSEVS program, gjennomført under "Handling for den strategiske utviklingen på the forskning og teknologiske sektoren", finansiert av operative programmet "Konkurranseevne, entreprenørskap og innovasjon" (NSRF 2014-2020) og co-finansiert av Hellas og Den europeiske unionen (EU regionaldepartementet Fund).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
| BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
| BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
| Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
| Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
| RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
| Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
| Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
| Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
| Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
| Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
| Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
| QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
| 5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
| Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
| DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
| PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
| Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | - | PCR/Clonality assessment |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
| UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
| 10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
| DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
| Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
| Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
| GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
| Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
| Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
| Centrifuge | equipment | ||
| PCR machine | equipment | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, IARC publications. (2017).
- Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed? Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).
- Sutton, L. A., Rosenquist, R. The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Cancer Biology. , (2015).
- Mina, A., et al. Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet? Blood Reviews. , (2017).
- Sutton, L. A., et al. Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification. Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).
- Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).
- Burger, J. A., Chiorazzi, N. B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).
- Packham, G., et al. The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy. Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).
- Messmer, B. T., et al. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).
- Stamatopoulos, K., et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 109 (1), 259-270 (2007).
- Agathangelidis, A., et al. Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies. Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).
- Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).
- Baliakas, P., et al. Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study. The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).
- Gounari, M., et al. Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8. Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).
- Ntoufa, S., et al. B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4. Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).
- Mansouri, L., et al. Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).
- Navrkalova, V., et al. ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres. Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).
- Rossi, D., et al. Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).
- Sutton, L. A., et al. Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors. Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).
- Fischer, K., et al. Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial. Blood. 127 (2), 208-215 (2016).
- Rossi, D., et al. Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).
- Thompson, P. A., et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 127 (3), 303-309 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia. Blood. , (2018).
- van Dongen, J. J., et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).
- Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire. Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).
- Rosenquist, R., et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).
- Linke, B., et al. Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes. Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).
- Gonzalez, M., et al. Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies. Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).
- Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).
- Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 20, Suppl 1. i379-i385 (2004).
- Bystry, V., et al. ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy. Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).
- Belessi, C. J., et al. IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: "CLL-biased" deletions in a subset of cases with stereotyped receptors. European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).
- Langerak, A. W., et al. Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).
- Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL. Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).
- Farooqui, M. Z., et al. Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial. The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).
- Furman, R. R., et al. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).
- Burger, J. A., et al. Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).
