Summary
במסמך זה, אנו מציגים את פרוטוקול פרטים ההיבטים הטכניים ודרישות חיוני כדי להבטיח ניתוח רצף גנטי של IG חזקים אצל חולים עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), המבוסס על ניסיון מצטבר של יוזמת המחקר האירופית על CLL (אריק).
Abstract
במהלך ההבשלה תא B, תהליך מורכב של אימונוגלובולינים (IG) גנים V (D) J רקומבינציה יחד עם היפרמוטציה (SHM) מעורר רצף ה-DNA ייחודי בתוך כל תא B בודדים. מאז תא B ממאירות כתוצאה משובט הרחבה של תא בודד, גנים IG מייצגים חתימה מולקולרי ייחודי משותף תאים ממאירים בתוך חולים בודדים; לפיכך, איג ג'ין rearrangements יכול לשמש כסמני המשובטים. בנוסף להיותם מזהה המשובטים חשוב, רצף גנטי IG יכול לשמש "ציר זמן מולקולרי" מאז היא קשורה ספציפית שלבים התפתחותיים, ומכאן משקף את ההיסטוריה של תא B מעורב הטרנספורמציה אמצעים. יתר על כן, עבור ממאירות מסוימות, במיוחד לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), רצף גנטי IG מחזיקה prognostic ויכולות חזוי באופן פוטנציאלי. עם זאת, חיוץ משמעות מסקנות ניתוח רצף גנטי IG יהיה בלתי אפשרי אם הכלים והשיטות חזקים לא היו זמינים לסייע בניתוח שלהם. מאמר זה, ציור על הניסיון העצום של יוזמת המחקר האירופית על CLL (אריק), פרטים ההיבטים הטכניים הדרושים כדי להבטיח לשחזור ואמין IG רצף מפענוח ב- CLL, מבחן המומלץ עכשיו היחנה לכל החולים CLL לפני הטיפול. ליתר דיוק, אנליטי השלבים השונים מתוארים החל הזיהוי של התארגנות מחודשת ג'ין איג clonotypic קביעת הרצף נוקלאוטיד הפרשנות קליניים מדויקת של הנתונים רצף של גנים IG.
Introduction
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), הצורה הנפוצה ביותר של לוקמיה אצל מבוגרים במדינות המערב, מאופיין על ידי התפשטות המשובטים בוגרת אמצעים B תאים1. מבחינה קלינית, מהלך המחלה הוא מאוד משתנה עם חלק מהחולים חווים מחלה אגרסיבית, הדורשים טיפול מוקדם מאוד לאחר האבחנה, ו לעיתים קרובות ושבה או להיות עקשן לטיפול. זה בניגוד חלק ניכר מהחולים (~ 30%) להציג עם מחלה indolent, מעולם לא דורשים טיפול, אשר יש תוחלת חיים דומה אנשים בריאים תואם גיל2. הטרוגניות קלינית זו משתקפת המגוון ליקויים מולקולרית נמצאו בחולי CLL אשר בסופו של דבר להסיע את פתוגנזה ואת התקדמות של המחלה זה3.
הקמת ש-CLL אבחנה מדויקת היא בדרך כלל פשוטה, עם זאת, הטרוגניות קלינית הנ ל עלול לעכב את ניהול יעיל של חולי CLL, מדגישה את הצורך סמנים prognostic הניבוי והחיזוי, יכול לסייע טיפול קבלת ההחלטות2. מחקרים רבים ניסו לעדן את שעייפים CLL, שהגיעה לשיאה בשפע של סמנים קליניים וביולוגית הרומן להיות המוצע4. המצב mutational של הגן clonotypic בנוגדנים כבד משתנה (IGHV) הוא אחד הסמנים prognostic ביותר עמיד ב- CLL, במידה רבה בשל העובדה כי (i) זה נשאר יציב לאורך זמן, כאשר המחלה מתקדמת, וזה (ii) תלויים בזה פרמטרים קליניים וביולוגית5. כי, סמנים מעט מאוד, אם בכלל, כולל מצב mutational IGHV, כיום מיושמים בשגרת קליניים בזמנו של אבחון.
דיווח ראשוני על התועלת הקלינית של IG רצף גנטי CLL תאריך כבר 1999, כאשר 2 מחקרים עצמאיים דיווחו כי בחולים ללא או עומס מינימלי היפרמוטציה (SHM) (unmutated CLL, U-CLL) בעלי פרוגנוזה גרועה מאשר חולים נושאת SHM גבוה יותר נטל (CLL שעבר מוטציה, M-CLL)6,7. ליתר דיוק, הקבוצה U-CLL כללה מקרים מחסה clonotypic IGHV גנים עם SHM ספורים או בכלל לא, ומכאן זהות אחוז גבוה אל הגן IGHV germline הקרוב (≥98%), ואילו M-CLL כללה מקרים עם עומס mutational גבוהה יותר (אחוז זהות הכי קרוב germline IGHV ג'ין < 98%). מאז אלה מחקרים מוקדם, זה הרף הוכח כי המקרים U-CLL להציג קצר הזמן-כדי-הראשון (TTFT) וטיפול ההישרדות (OS) בהשוואה ל- M-CLL.
במבט לאחור, מחקרים הזרע אלה מודגש תפקיד מרכזי של הקולטן תא B (BcR) IG ב- CLL pathobiology, ובכך לסלול את הדרך עבור מחקר מקיף לתוך אינטראקציות CLL-microenvironmental אשר, בתורו, הוביל הערכה מקיפה יותר של הטרוגניות הביולוגי של8,זו מחלה9. מחקרים מאוחרים יותר מספק תמיכה נוספת לחשיבות של ניתוחים immunogenetic ב CLL חושף כי מקרים בודדים עשוי אשכולות בדרך קבוצות משנה עקב שיתוף (הקבועה) רצפי הגן BcR IG זהים, תופעה כינה BcR איג stereotypy10 ,11,12,13. לצבירת ראיות תומך הרעיון הזה חולים שהוקצו באותה משנה הסטראוטיפי הארבור דומה clinicobiological המאפיינים בבירור מפרידים בינם לבין חולי CLL אחרים בתוך הקטגוריה SHM זהה אבל עם רצפי הגן IG שונים; אכן דווח כי סיווג של חולי CLL בהתבסס על BcR איג stereotypy עוד מזקק ההפרדה בצובר של חולי CLL U-CLL או M-CLL קבוצות14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
מנקודת מבט קליני, זה לציון כי המצב SHM של הגן IGHV clonotypic נראה כדי לתאם עם תגובה ספציפית chemoimmunotherapy. בחולים M-CLL מסוים, מטופלים עם שילוב של ציקלופוספאמיד/fludarabine/rituximab (ה-FCR), הטיפול תקן הזהב לחולי CLL כשיר מבחינה רפואית חסר פגמים הגן TP53 , הציג באופן משמעותי יותר ללא התקדמות המחלה הישרדות (PFS) ו- OS בהשוואה ל- U-CLL חולים שקיבלו את אותו הטיפול21,22,23. לכן, זיהוי של המצב SHM הפך חשוב במיוחד לסיוע בניהול טיפולית של CLL חולים קרי, סמן ניבוי, ולא לשם הערכת הקורס הקליני של המחלה , כלומר, סמן prognostic. למעשה, לפי העדכון האחרון של ההנחיות NCI במימון מבית המלאכה הבינלאומי ב- CLL, המצב SHM של הגנים IGHV שסודר צריך להיות נחוש בכל המקרים CLL לפני הטיפול חניכה בפועל כללית הן וניסויים קליניים ניסויים24. יתר על כן, בשל אישור אחרונים של סוכנים טיפול חדשניים, ואת המספר הגדל והולך של תרופות בניסויים, המצב SHM של המולקולה IG עשוי לשחק תפקיד גדול עוד יותר ההנהלה טיפוליות בחולים עם CLL ליד לעתיד5.
בדוח זה מפורטים בכל ההיבטים של ניתוח רצף גנטי איג, מתחילה עם בחירת החומר המתאים, שהגיעה לשיאה עם הפרשנות קליני של רצף תוצאות. הערכה מעמיק של השלבים חשוב בשגרת אבחון עבור הייצור של תוצאות אמינות וכדי להבטיח מדויק ריבוד המטופל במסגרת ניסויים קליניים. פרוטוקולים ניתנים כדי לסייע משלים ניתוח רצף גנטי איג, ובכך להבטיח תוצאות דומות בין מעבדות שונות.
Protocol
פרוטוקול מחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה של המכון המדעי סן רפאלה, מילאנו, איטליה.
1. בבחירה
-
הבחירה של החומר מתחיל
הערה: ברוב המקרים של CLL הגידול ספירת הדם היא בגובה של אבחון (> 80-90%). לפיכך, מיון תא או העשרה של תאי לוקמיה אינה בדרך כלל הכרחי.- אם משתמש דם היקפיים (PB), החומר הנפוץ ביותר של בחירה עבור ניתוח רצף גנטי איג, השתמש נפח הדם בין 10-20 מ.
- לחלופין, במקרים עם נטל נמוך של תאים CLL, להשתמש מיון תא PB דוגמאות או חומר של רקמות אחרות, כמו מח העצם (מוניטור) או בלוטות לימפה (LN).
-
זמן הדגימה
- דגימה זמן חיוני לא נתון כי המצב IG SHM הוא יציב בשעות נוספות; עם זאת, להימנע דגימה בתקופות מסוימות, כמו למשל מיד אחרי או במהלך טיפול, מאז המספר הנמוך של תאים CLL עלול לסבך את הניתוח לתוצאות לא אמין.
-
האוסף הגשמי ואחסון
הערה: האיסוף והאחסון של הפעלת חומר תלויה בחריפות הבחירה גשמי.- לדוגמאות חמאת בוטנים או מוניטור, להשתמש צינורות (ציטראט-טריס-pyridossalphosphate) אוסף EDTA או CPT כדי למנוע עיכוב של תהליך ההגדלה PCR; לחלופין, השתמש צינורות הפארין.
- לדוגמאות LN, אוסף האפשרויות הן או השעיות תא, ביופסיות מרקמות טריים קפואים, או ברקמות מקרים נדירים פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE).
2. צפיפות ההפרדה מעבר צבע
הערה: אם חמאת בוטנים או מוניטור הוא חומר המוצא של בחירה, המהווה התרחיש השכיח, תא תאי בידוד באמצעות ההפרדה הדרגתיות צפיפות מומלץ.
- להוסיף 200 µL של EDTA (EDTA 0.5 M / pH 8.0) לרכבת התחתית אוסף סטרילי 50 מ ל. הוסף 20 מ"ל של חמאת בוטנים ו-15 מיליליטר RPMI. מיקס על ידי pipetting (2 - 3 פעמים זה מספיק).
- להוסיף 15 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור אוסף 50 מ.
הערה: למקרה שאמצעי האחסון PB פחות מ 20 מ"ל, הכרכים של RPMI (שלב קודם), צפיפות הצבע צריך להיות שונה בהתאם. - לאט לאט שכבת בפתרון מהשלב 2.1 כך זה לא לשבש את המילוי ההדרגתי. צנטריפוגה ב g 800 x במשך 20 דקות עם הבלמים צנטריפוגה חופש.
- לאסוף את הטבעת תא תאי שנוצר בין השכבה העליונה פלזמה/טסיות דם צפיפות צבע בינוני השכבה בעזרת פיפטה פסטר סטרילי ולאחר מכן להעביר צינור אוסף סטרילי 15 מ"ל.
- להוסיף RPMI נפח סופי של 12 mL ומערבבים. צנטריפוגה-750 גרם x 8 דקות. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר התא באמצעות 10 מ"ל של RPMI וחזור על שלב 2.5.
- להמיס בגדר תא ב 1 מ"ל ל- PBS (DPBS, אין סידן, מגנזיום אין). לבצע ספירת תאים באמצעות צלחת נויבאואר על ידי ערבוב 20 µL מדגם µL 80 של 1:10 הפתרון של הטורקים.
- אם עיבוד במורד הזרם של המדגם לא מתוכננת לעבור באותו היום, centrifuge המדגם-750 גרם x 8 דקות. למחוק את תגובת שיקוע ולאחסן בגדר תא ב-80o C.
3. חומצות גרעין החילוץ
- להחליט על מצע לצורך ניתוח של מצב SHM IG גנים. הדנ א (gDNA) היא הבחירה הפופולרית ביותר כפי שיש צורך צעד שעתוק במהופך; לחלופין, השימוש של RNA/משלים דנ א (cDNA) מבטיח, לפחות ברמה תעתיק, הסידור החדש איג clonotypic פרודוקטיבי, פונקציונלי המטרה "מועדפים".
- שימוש אחד של ערכות זמינים מסחרית רבים מתאים gDNA או סך החילוץ-RNA, הסינתזה של cDNA (ראה טבלה של חומרים).
- להעריך את התקינות של DNA או RNA באמצעות מערכות כימות חומצת גרעין רגיש. אם שימוש בחומר FFPE לניתוח, להעריך את האיכות ואת כמות gDNA/cDNA שחולצו על ידי ה-PCR הגברה של הגן ידוע משק בית, למשל retinoic חומצה הקולטן אלפא (נועה), ביתא-אקטין, וכו '.
4. הגברה ורצף של ג'ין IGHV-IGHD-IGHJ Rearrangements
-
הבחירה תחל IGH PCR
- רצוי, לבצע PCR מולטיפלקס עם IGHV קבוצת משנה מסוימת 5' צבעי בסיס, IGHJ גנים ספציפיים 3' תחל25,26. אם התוצאות המתקבלות אינן תת אופטימלית, להכין נפרד PCR mixes באמצעות תחל בודד של קבוצת משנה ספציפית IGHV.
- השתמש 5' תחל זה anneal גם האזור מנהיג ממוקם באופן מיידי נגד הזרם של התארגנות מחודשת IG או בתוך האזור קידוד (למשל מסגרת 1, FR1) של הגן IGHV.
- השתמש תחל מנהיג המאפשרות ההגברה של שסודר IGHV-IGHD-IGHJ ג'ין הרצף כולו, אשר בתורו יאפשר את אומדן מדויק של SHM רמות. לפיכך, IGHV מנהיג תחל מומלצים על-ידי אריק בהנחיות שלהם מעודכן עבור ניתוח רצף גנטי IG27.
- במקרים שבו תחל מובילה לכשל כדי להגביר את הסידור החדש איג clonotypic, להשתמש IGHV FR1 תחל. עם זאת, מסגרת תחל לא להגביר clonotypic כולו IG ג'ין התארגנות מחודשת, אשר עלולה להוביל להגדרה מדויקת של רמת SHM. עבור תרחיש זה, להצהיר בבירור בדו ח קליניים כי השימוש IGHV FR1 תחל עשוי מגזים על הגן germline הקרוב את הזהות אחוז האמיתית.
- לשימוש 3' הסוף, תחל קונצנזוס מיקוד IGHJ הגנים, ערכות מולטיפלקס IGHJ גנים ספציפיים תחל או תחל isotype ספציפיים בהתאם המצע. פריימר רצפים ניתנים טבלה 1, ואילו באיור 1 מתאר את המיקומים השונים עבור חישול פריימר.
-
PCR הגברה של IGHV-IGHD-IGHJ ג'ין rearrangements
- הכינו את התמהיל פריימר באמצעות כמויות equimolar של כל primer(s) קבוצת משנה כדי להבטיח הגברה לא משוחדת.
- לדוגמה, בעת שימוש תחל מנהיג, שני צבעי יסוד שונים משמשים כדי להגביר את rearrangements השייכים קבוצת המשנה IGHV1. לכן, משתמשים כמות של אלה תחל 2 (IGHV1L ו- IGHV1bL) הוא שחצי בהשוואה IGHV4L, המהווה המפתח היחיד עבור IGHV4 קבוצת rearrangements.
- החל בגישה ההפוכה במקרה של תחל IGHJ1-2 ו- IGHJ4-5. כמו אלה תחל למקד לשתי תת-קבוצות גנים שונים של IGHJ, להכפיל את הכמות לעומת IGHJ3 ואת IGHJ6 תחל.
- השתמש בטבלה 1 כדי לקבוע את הכמויות פריימר המדויק בעת הכנת תערובות פריימר הרלוונטיים.
- מיקס PCR ריאגנטים כמפורט בטבלה מס ' 2. לאחר שילוב כל ריאגנטים PCR בשפופרת PCR, להוסיף 0.5 µL של אנזימים ו- 100 ננוגרם של gDNA או µL 2 של cDNA (cDNA צריך להיות מוכן תוך שימוש µg 1 של RNA).
הערה: אנזים Taq עם הגהה פעילות אינה חיונית שיעור שגיאה הגברה הוא נמוך ביותר, לא ולכן ישפיעו על רמת SHM. - להפעיל את פרוטוקול ה-PCR תרמי מפורט בטבלה3.
- הכינו את התמהיל פריימר באמצעות כמויות equimolar של כל primer(s) קבוצת משנה כדי להבטיח הגברה לא משוחדת.
-
הערכה clonality
הערה: שלב קריטי כרוך הערכת התבנית clonality של מוצר ה-PCR. כאשר הערכת clonality בחולי CLL, הממצא הנפוץ ביותר הוא יחיד, monoclonal שיא/להקה.- השתמש בשיטות עם רגישות גבוהה, כגון ניתוח שבר או heteroduplex, עבור clonality-הערכה-28,-29.
- ניתוח שבר
- לבצע מותני מולטיפלקס באמצעות 5' התווית על-ידי מנהיג IGHV או FR1 קבוצת משנה תחל PCR ספציפיים; זה תניב מוצרים PCR יכול להיות מופרדים על ידי אלקטרופורזה נימי, ובכך מאפשרת הערכה clonality של ה-PCR IGH מוצרים בהתבסס על שלהם IGHV משלימים את החסר קביעת אזור 3 אורכי (CDR3).
- השתמש תחל, ריאגנטים ותנאי תרמי זהה האלה כאמור (ראה טבלאות 1-3). 5´ מותאם אישית-שכותרתו תחל fluorescently מסומנות oligos עם מבחר צבעי בקצה 5'. דוגמאות צבע הכתב כוללות 6-FAM, HEX, נד או ט. לפיכך, 2 תגובות נפרדות נדרשים בהתבסס על השימוש של 3 צבעים שונים לכל תגובה.
- להעריך את הגודל של המוצרים PCR לזיהוי 6% (6%) ג'ל (אחוז זה מתבטא רזולוציה מיטבית), באמצעות 1 x TBE בתור חוצץ פועל. לרוץ במהירות 80 V למשך 45 דקות.
הערה: מומלץ כי מוצרי ה-PCR מותר להעביר על הג'ל זמן מספיק כך שלא ניתן להפריד בין דגימות monoclonal מהרקע polyclonal של דה מרקר גודל ה-DNA להפריד בצורה הולמת. גורמים כגון גודל ועובי של הג'ל יכול להשפיע על הגירה ולכן אין הגדרה אחת (מתח וזמן) יכול להבטיח תוצאה מיטבית אמר, הגדרת את המתח 80 V במשך 45 דקות הוא נקודת התחלה טובה כמו זה ממזער את הסיכון של המדגם נודדות מדי מהר ופועל '' תוריד את הג'ל. - בדוק למוצרי ה-PCR של-500 בסיסי זוגות בעת שימוש IGHV מנהיג תחל ו 350 בסיסי זוגות בעת שימוש mixes תחל את IGHV FR1.
הערה: במקרים נדירים, CLL מקרים נמצאו לשאת מוצרים זוגי monoclonal, במקרים נדירים יותר, המקרים עשוי להפגין תבנית oligoclonal. סוכן intercalating כגון אתידיום ברומיד (EtBr) או פחות מסוכן ורגיש יותר כתמים DNA זמינים מסחרית יכול לשמש עבור הפריט החזותי של ה-DNA על ג'לים אקרילאמיד באמצעות עירור UV או אור כחול.
-
טיהור מוצר ה-PCR
הערה: ה-PCR מוצרים כבר טהור כדי להסיר את כל הרקע polyclonal שמקורם תאים נורמליים B בתוך הדגימה CLL, כמו גם פריימר הדימרים שעלולות להוביל שיוצרת רצף. להשתמש בכל אחת מהשיטות מסיר dNTPs לא מעובדות, צבעי יסוד PCR לנקות, כגון טיפול אנזימטי, למשל, Sap (שרימפס phosphatase אלקליין) / Exo (אקסונוקלאז אני), או מבוססי עמודה טיהור.- לטעון את הנפח הכולל של המוצר PCR על 3% התכה נמוכה ג'ל agarose.
- לאפשר את המוצרים PCR לרוץ על הג'ל עד שהם להפריד הרקע.
- בלו הלהקות PCR חד, בולט, לטהר, elute. אם rearrangements שני מזוהים, שתיהן צריך להוציא, וסודרו בנפרד.
- כדי לבצע ניקיון Sap/Exo, בצע הוראות היצרן לגבי אמצעי האחסון הספציפי לשימוש; עם זאת תגובת טיפוסי עשוי להכיל 1 µL ב- Sap, 0. 5 µL Exo ו- 2 µL 5 x הדגירה מאגר לכל 5-10 µL PCR התגובה. לערבב על ידי בעדינות vortexing כל דגימה, דגירה על בלוק ה-PCR ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בטל האנזימים על ידי חימום עד 85 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- לטעון כמות קטנה של מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose 3% כדי להעריך את הטוהר של המוצר.
5. סנגר רצף
הערה: מספר רצף אסטרטגיות קיימות, עם זאת, ללא קשר הגישה המדויק, ישיר רצף של שתי קווצות היא חובה על מנת להבטיח תוצאה אמינה.
-
כללי רצפי פרוטוקולים
- אם הגברה בוצעה באמצעות תחל בודד, להמשיך עם רצף באמצעות המתאים IGHV - ו IGHJ - או קבוע תחל ספציפיים לאזור. גם יכול להיות אימצו גישה זו אם מרובב fluorescently תחל שכותרתו שימשו המוצר PCR הוערכה באמצעות ניתוח שבר (רצף תחל צריך לא להיות מתויג).
- אם תחל מרובבת שימשו clonality נאמד בג'ל, ואז להשתמש פריימר במורד הזרם בשלב הראשון של רצף למשל קונצנזוס IGHJ תחל עם הרצף להיות 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'. לחלופין, ניתן להשתמש פריימר CH אם cDNA שימש המצע. הבא, השתמש בקבוצת משנה ספציפי IGHV מנהיג או FR1 תחל עבור השלב השני של הרצף.
-
דוגמה רצף פרוטוקול
הערה: קיימים מספר רצפי פרוטוקולים, פרוטוקול דוגמה מפורט להלן.- לדלל 33 ng של מוצר ה-PCR הנפח הכולל של 11.5 µL באמצעות, למשל, במים סטריליים. Denature את המוצר PCR על ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מיד להניח על קרח למשך 10 דקות למנוע היווצרות מבנים משניים.
- הוסף 8 µL של מיקס מאסטר כל שפופרת יחד עם µL 0.5 (תואם ל- 5 pmol) של ומהצמיגים.
- כפקד, להכין את שפופרת המכילה 8 µL של מיקס מאסטר, 0.5 µL pUC18 שליטה תבנית, פריימר רצף 47 µL (-) 2 ו- 9.5 µL במים סטריליים. עוצמת הקול הכולל הסופי של כל שפופרת צריך להיות 20 µL.
- השתמש תנאי הרכיבה תרמית עבור התגובה רצף כמפורט בטבלה4.
- להכין את הפתרון להפסיק על ידי ערבוב 2 µL של סודיום אצטט 3 מ' (pH 5.2), 2 µL EDTA 100 מ"מ (pH 8.0) ו- µL 1 של גליקוגן (ריכוז 20 מ"ג/מ"ל), לאחר מכן להוסיף 5 µL כל דגימה. להעביר את המוצר צינור microcentrifuge.
- מוסיפים 60 µL של 100% אתנול (-20 ° C) ומערבבים בעדינות. צנטריפוגה-14,000 סל ד במשך 15 דקות (4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
- להוסיף 100 µL של 70% אתנול (-20 ° C) ומערבבים בעדינות. צנטריפוגה-14,000 סל ד ל-10 דקות (4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע. חזור על פעם אחת.
- יבש בגדר למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 40 µL של dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) לפתרון כל דגימה.
- להעביר את הדגימה צלחת רצף, לכסות עם סטריפ caps או הקלטת חותמות, לטעון למכונה ולבצע סנגר רצף. הצלחת רצף בדרך כלל 96-ובכן, v-התחתון, צלחת PCR מלא-חצאית תואמת הרצפים (sequencer). הלוחות ייתכן לבר-קוד בהתאם הרצף להתבצע בתוך הארגון, על חברה מסחרית או מרכז/פלטפורמה רצף אקדמי.
- לאחר רצף, 'מחברים' את קריאות 2 שנוצר מן המדרגות רצף בודדים כדי ליצור מלאה IGHV ג'ין שחלוף קרי, רצף קונצנזוס.
6. רצף ניתוח
הערה: ההתמקדות בסעיפים הבאים הפלט המתקבל כלי IMGT/V-QUEST30 בעת ניתוח מחדש רצפי איג, IMGT/JunctionAnalysis31, אשר שניהם רלוונטיים במיוחד עבור דיווח קליני ומחקר מחקרים. IMGT/V-השאיפה היא כלי היישור המשווה משתמש נאספו IG רצפי עם הספריה הפניה IMGT מגדיר30. הפלט הכלי כולל מספר סעיפים שבו המשתמש יכול להגדיר פרמטרים מסוימים.
- ציין את מינים, למשל, הומו סאפיינס (האדם), ואת סוג קולטן או לוקוס (למשל וקשתות, IGK או IGL).
- הדבקת רצפי כדי להיות מנותח, בתבנית FASTA, כולל כותרות, לתוך אזור הטקסט (בקבוצות של עד 50 רצפי לכל הפעלה). לחלופין, באפשרות הזן את הנתיב אל קובץ מקומי המכיל את רצפי FASTA מסופק.
- בחרו אחת מאפשרויות התצוגה 3 שלהלן לקבלת התוצאות:
- מפורט תצוגה: בחר באפשרות זו כדי לקבל את התוצאות עבור כל רצף בנפרד.
- סינתזה תצוגה: בחר באפשרות זו כדי לבצע קומפילציה של טבלת סיכום ציווה על ידי ג'ין IGHV ושם אלל או בצו קלט רצף. אפשרות זו מספקת גם מערך רצפים המוקצים, בכל אצווה הועלה, אותו גן IGHV ואת אלל.
- קובץ Excel: בחר באפשרות זו כדי לספק כל פלט קבצים אלקטרוניים משולבים לתוך קובץ בודד. כל אפשרויות הצפייה יש מבחר גדול של פרמטרים בסיסיות ומתקדמות לבחירה, אולם רק ביותר הקשורה CLL IG רצף ניתוח הגורמים נדונים להלן בסעיף 'נציג תוצאות'.
7. מעצר/AssignSubsets כלי
- כדי לחקור BcR איג stereotypy בתוך CLL (פרטים נוספים להלן בסעיף 'נציג תוצאות'), להגיש IGHV-IGHD-IGHJ FASTA רצפים הכלי מעצר/AssignSubsets32. הדיווחים בכלי שהמשימה CLL הגדולות תקטלג קבוצות משנה. הכלי משנה-הקצאה יחד עם הוראות מפורטות זמינים על לאתר את המעצר/AssignSubset32 וגם באתר האינטרנט של אריק תחת הכרטיסייה שירותים.
Representative Results
דוגמאות המסופקות להלן להמחיש את התוצאות המתקבלות מ- IG ג'ין רצף ניתוח בעקבות הצעדים המפורטים לעיל. למרות מיצוי DNA או RNA פרוצדורות שגרתיות עבור רוב מעבדות מחקר קליני, שלב קריטי הראשונה כרוכה בדיקת האיכות/הכמות של gDNA ו/או RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים או אחרים טכנולוגיה מתאימה עם רגישות גבוהה. שלב מכריע כרוך PCR הגברה של clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ ג'ין שחלוף. כפי שהוזכר לעיל, רק את השימוש IGHV מנהיג תחל מאפשרת הגברה של אורך מלא של רצף גנטי IGHV שסודר, וכך מאפשר את העומס SHM נכון שיקבע; לכן, IGHV מנהיג תחל הם הבחירה המומלצת פריימר (איור 2). במקרים נדירים בו תחל מנהיג IGHV לא יכול להגביר את הסידור החדש איג clonotypic, IGHV FR1 תחל עשוי לשמש. כמו evidenced באיור3, ייבחנו מספר PCR מוצרים/להקות, במיוחד כאשר gDNA הוא חומר המוצא; הלהקות האלה צריך להוציא, וסודרו בנפרד. אם IGHV כמנהיג והן IGHV FR1 תחל לא מצליחים להניב תוצאות, הניתוח יש לחזור באמצעות דגימה החולה החדש (כאשר הדבר אפשרי). הביקורת האחרונה לפני רצף היא בודקת את clonality של המדגם באמצעות ניתוח שבר (איור 4).
צריך להיות מנותח רצפים שהושג באמצעות הכלי IMGT/V-QUEST30. המשתמש שנבחר פרמטרים כוללים מינים, קולטן סוג או לוקוס, חיפוש של ההכנסה, ואת אפשרות המחיקה, וכו ' , מפורטים יחד עם מספר רצפי מנותח. כל רצף FASTA מוצג, V-התחום נותחו על ידי IMGT/V-QUEST מסומן בירוק. בנוסף, אם לרצף הקלט היה בכיוון ההפוך (antisense), התוכנית באופן אוטומטי מספק את רצף הפוכה משלימים, קובע את זה מעל הרצף FASTA.
התוצאה טבלת סיכום מסופק ישירות מתחת רצף FASTA, בחלק העליון של התצוגה' מפורט' מדף התוצאות, ומכיל מידע חשוב עבור דיווח קליני של IG מפענוח רצף ב- CLL. כל שורה בטבלה זו כפי שמוסבר להלן.
סיכום התוצאות. השורה הראשונה בטבלה התוצאות קובע את הפונקציונליות של רצף הקלט: רצף IG לסידור מחדש יכול להיות מועיל או לא מועיל (איור 5A & 5B). שחלוף גנטי IG הוא לא מועיל. אם תפסיק codons נמצאים בתוך את V-D-J-אזור (עבור VH) או V-J-אזור (עבור VL) ו/או אם הסידור החדש הוא מחוץ לתמונה בשל הוספות/מחיקות. שלישי פלט מסופק כאשר אין אפשרות לקבוע את הפונקציונליות, קרי, אם לא היתה אפשרות לזהות את צומת IGHV-IGHD-IGHJ; במקרה זה, סיכום התוצאות יקרא 'לא נמצאו כל התמורות' או 'לא נמצאו כל צומת'. חשוב לציין כי רק פרודוקטיבי, לפיכך, rearrangements תפקודית צריך להיות מנותח עוד יותר. אם הבלעדית מוגבר IG שחלוף אינה פועלת (יצרנית או 'לא נמצאו כל התמורות'), תהליך ההגדלה PCR יש לחזור. אם התוצאה שלילית החולה מדגם חדש צריכה להתקבל.
V-גן ו אלל. השורה 'V-גן ו אלל' מציין את הקרובים germline IGHV ג'ין אלל עם הציון יישור שלה והזהות אחוז. אם מספר gene (s), אללים לתת את הציון הגבוה אותו, כל רשומים. זהות אחוז בין הרצף הועלה ואת הקרובים ג'ין IGHV אלל יש חשיבות מיוחדת מאחר והוא קובע את מצב SHM. ערך זה מחושב לפי נוקלאוטיד הראשון של האזור V 3' בסוף V-אזור לא כולל את CDR3. אם IGHV FR1 תחל משמשים, הרצף המקביל לזה של ומהצמיגים תמיד להסירה כדי להבטיח מדויקות תוצאה ככל האפשר. יצוין כי אחוז נמוך זהות (< 85%) העלולות לנבוע ההוספה או המחיקה של (שנדונו עוד להלן), זה צריך להיות המקרה פתק 'אזהרה' יופיע בשורה 'סיכום תוצאות' כדי להתריע בפני המשתמש.
J-גן ו אלל. כמתואר עבור V-גן ו אלל לעיל, השורה 'J-גן ו אלל' מציינת את הקרובים germline IGHJ ג'ין ואת אלל עם הציון יישור שלה והזהות אחוז. עם זאת, הגן IGHJ הוא קצר למדי, סופו 5' ייתכן נחתכו בשל פעילות אקסונוקלאז, אפשרויות חלופיות נסרקות גם על-ידי הכלי, בהתבסס על המספר הגבוה ביותר של נוקלאוטידים זהות רצופות.
D-גן ו אלל מאת IMGT/JunctionAnalysis. היה-גן ואת אלל על ידי IMGT/JunctionAnalysis' מציינת את germline IGHD ג'ין הקרוב ביותר ואת אלל עם המסגרת הקריאה D-אזור המזוהה על-ידי הכלי ברצף המשתמש. IMGT/JunctionAnalysis31 מספק ניתוח מפורט ומדויק של הצומת, שולב הממשק כלי IMGT/V-QUEST. כלי זה מנהל את כל ההיבטים של קושי לקשר IGHD ג'ין, אלל זיהוי קרי, (i) אורך קצר של האזור-D; (ii) השימוש 2 או אפילו 3 קריאה מסגרות; (iii) אקסונוקלאז זמירה בשני הקצוות של הגן; ו, (iv) הנוכחות של מוטציות.
FR-IMGT אורכי, אורכי CDR-IMGT ו- AA צומת. שורה זו מספקת את אורך IGHV FRs ועל Cdr שמוצג בתוך סוגריים מרובעים, המופרדים באמצעות נקודות ו לצומת חומצת אמינו (AA). רצף AA לצומת מדגים (i) ב- out-של-מסגרת או שחלוף (מיקומי מחוץ לתמונה מסומנים באמצעות הסימן "#"), (ii) נוכחות או היעדרות של עצירה codons (stop codon מוצג על ידי כוכבית ' *'), ו- (iii) נוכחות או היעדרות של עוגנים של VH CDR3-IMGT: C (2nd-CYS 104) ו- W (J-TRP 118).
Hypermutations סומאטית מורכב בעיקר שינויים נוקלאוטיד יחיד, אולם קטן הוספות ומחיקות בתוך אזור V יכול להיות שנצפו, אף על פי-הרבה נמוך תדר33. כאשר משתמש ברירת המחדל IMGT/V-QUEST פרמטרים, הוספות ומחיקות לא באופן אוטומטי מזוהים; עם זאת, סימנים רציניים כי רצף עשוי לבצע כזה שינויים, קרי, זהות אחוז נמוך ו/או באורכים שונים IGHV CDR1-IMGT ו- CDR2-IMGT בין הרצף המשתמש שהוגשו הקרוב germline ג'ין ואת אלל, מזוהים על-ידי הכלי, התראת אזהרה מופיע להלן טבלת סיכום תוצאות (איור 5C).
IMGT מספק אפשרות שנקראת 'החיפוש אחר הוספות ומחיקות' במקטע 'פרמטרים מתקדמים' ממוקם מתחת למקטע 'הצג תוצאות'. במקרים שבהם מופיעות אזהרות הרלוונטיים, רצוי להשתמש בפונקציונליות זו. כאשר זוהו הוספות ומחיקות, פרטים מקיפים על מציאת הן בתנאי במקטע 'סיכום תוצאה' כולל (i) איפה ההוספה או המחיקה הוא ממוקם קרי, VH FR-IMGT או CDR-IMGT; (ii) מספר נוקלאוטידים להוסיף/למחוק; (iii) הרצף (רק עבור הוספות); (iv) אם אירעה frameshift; (v) codon V-אזור שממנו ההוספה או המחיקה מתחילה; (vi) העמדה נוקלאוטיד המושפעת נשלח רצף (איור 5D). עבור הוספות, הכלי מסיר את insertion(s) הרצף המשתמש שהוגשו ומנתח ואז מחדש את הרצף באמצעות הפרמטרים IMGT/V-QUEST סטנדרטי. אם מזוהים מחיקות, הכלי מוסיף פערים, המיוצג על-ידי נקודות, כדי להחליף את נוקלאוטידים שנמחקו לפני הניתוח.
לגבי כל אבחון או prognostic בדיקה שבוצעה במעבדות קליניות, תקנים מחמירים, רמה גבוהה של הפארמצבטית הם בעל חשיבות עליונה. הפלט IMGT/V-QUEST מספקת של המידע הנדרש לדיווח תוצאות ניתוח רצף גנטי IG CLL, קרי, (i) IGHV, הגנים IGHD ו- IGHJ, אללים מנוצל; (ii) את הפונקציונליות של clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ ג'ין שחלוף קרי, האם הסידור החדש הוא מועיל או לא מועיל; ג'ין IGHV (iii) אחוז בזהות שסודר ו אלל בהשוואה שלה germline IGHV ג'ין, אלל הקרוב ביותר. לפרטים מקיף לגבי דיווח קליני של IG גנים ב- CLL, הפרשנות של בעייתי או טכנית מאתגר מקרים והמלצות מצפני מדוייק וחזק IGHV ג'ין SHM מצב ב- CLL, מכוונת את הקורא עד לאחרונה עודכן אריק הנחיות ודוחות27,34.
בסופו של דבר, בשל הידע שלנו הולך וגדל הנוגע BcR איג stereotypy ב CLL, דרישה הכרחית נוספת המומלצת עבור דיווח קליני של IG rearrangements ג'ין ב- CLL מתייחס ההקצאה של המקרים מייג'ור תקטלג קבוצות משנה. עכשיו מומלץ למצב בדו ח קליני אם שחלוף גנטי IGHV פרודוקטיבי שנותחה ניתן להקצות לאחד תת-קבוצות הסטראוטיפי הגדולות, כלומר קבוצות משנה #1, #2, #4 או #812,27. המשימה ערכות משנה CLL תקטלג הגדולות צריכה להתבצע עם השימוש של הכלי (איור 6) מעצרו/AssignSubsets32.
| 5' תחל IGHV FR1 | פריימר רצף | כמות עבור 60 μL פריימר מיקס | |
| IGHV1 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG | 10 | |
| IGHV2 | CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV3 | GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV4 | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG | 10 | |
| IGHV5 | GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC | 10 | |
| IGHV6 | CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG | 10 | |
| 5' IGHV מנהיג תחל | |||
| IGHV1L | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG | 5 | |
| IGHV1bL | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) | 5 | |
| IGHV2aL | AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (מזגן) AC | 5 | |
| IGHV2bL | AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC | 5 | |
| IGHV3aL | AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC | 5 | |
| IGHV3bL | AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC | 5 | |
| IGHV4L | AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT | 10 | |
| IGHV5L | AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC | 10 | |
| IGHV6L | AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC | 10 | |
| 3' IGHJ primers | |||
| IGHJ1-2 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 20 | |
| IGHJ3 | TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC | 10 | |
| IGHJ4-5 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC | 20 | |
| IGHJ6 | TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC | 10 | |
טבלה 1. פריימר רצפים וכמויות עבור הגברה PCR של clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ ג'ין שחלוף.
| מגיב | נפח (μL) |
| RB x מאגר 10 | 5 |
| MgCl2 (50 מ מ) | 3 |
| dNTPs (10 mΜ) | 2 |
| פריימר IGHV מנהיג/FR1 מיקס (10 μM) | 3 |
| פריימר IGHJ לערבב (10 μM) | 3 |
| H2O | 31.5 |
| הנפח הכולל | 47.5 |
בטבלה 2. ריאגנטים עבור הגברה PCR של clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ ג'ין שחלוף.
| טמפרטורה | משך | מחזור מספר | תיאור |
| 94 ° C | 5 דקות | 1 | הפעלת פולימראז |
| 94 ° C | 1 דקה | 39 | דנטורציה |
| 59 ° C | 1 דקה | חישול | |
| 72 ° C | דקה וחצי | סיומת | |
| 72 ° C | 10 דקות | 1 | סיומת הסופי |
| 18 ° C | ∞ | 1 | שימור |
בטבלה 3. תנאי הרכיבה תרמית עבור הגברה PCR של clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ ג'ין שחלוף.
| טמפרטורה | משך | מחזור מספר | תיאור |
| 94 ° C | 5 דקות | 1 | הפעלת פולימראז |
| 96 ° C | 20 שניות | 30 | דנטורציה |
| 50 ° C | 20 שניות | חישול | |
| 60 ° C | 4 דקות | סיומת | |
| 4 ° C | ∞ | 1 | שימור |
בטבלה 4. תנאי הרכיבה תרמית עבור התגובה רצף של גנים IG.
איור 1. ייצוג סכמטי של שחלוף גנטי IGHV-IGHD-IGHJ עם פריימר שונים חישול מיקומים שצוינו. 5' IGHV תחל anneal רצף מובילה הממוקמת במעלה הזרם של רצף קידוד IGHV. 5' IGHV מסגרת (FR) תחל anneal כדי להתחיל את האזור FR1, הנמצא בתוך הגן IGHV שסודר, ואילו את 3' IGHJ תחל anneal עד הסוף של הגן IGHJ שסודר. UTR: אזור לא מתורגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. PCR הגברה של התארגנות מחודשת ג'ין IGHV-IGHD-IGHJ 7 הדגימות החולה באמצעות 5' IGHV מנהיג תחל. השביל ח' מייצג פקד חיובי ואילו הפקד שלילי עבור ה-PCR נטען לנתיב התשיעי. המוצר PCR הצפוי הוא כ 500 בסיסי זוגות בגודל בעת שימוש IGHV מנהיג תחל. הכוכבית בעמודה האחרונה של הג'ל עולה בסולם הדנ א bp 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. PCR הגברה של התארגנות מחודשת ג'ין IGHV-IGHD-IGHJ 13 הדגימות החולה באמצעות תחל IGHV FR1. במסלול הארבע עשרה מכיל את הפקד חיובי בעוד היה מוטען שלילי לנתיב החמש עשרה. כמו evidenced בנתיב 2, אשר די אן איי היה חומר המוצא, מספר להקות PCR שנצפו, אשר צריך להוציא וסודרו בנפרד. דוגמאות הנמצאים בסמטאות 5, 7, ו- 13 הניב תוצאות polyclonal (שמעידים על השמצות הג'ל) ו, לכן, השלב ה-PCR יש לחזור. אם PCR השני נכשל להגביר את IG שסודר gene (s) הניתוח להתבצע על מדגם חדש (אם הדבר אפשרי) או באמצעות פריימר שונות לקבוע. המוצר PCR הצפוי הוא כ 350 בסיסי זוגות בגודל בעת שימוש mixes פריימר IGHV FR1. הכוכבית בעמודה האחרונה של הג'ל עולה בסולם הדנ א bp 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. הערכה של clonality באמצעות ניתוח genescan. בניתוח genescan, מוצרי ה-PCR monoclonal להצמיח לשיא הדומיננטי של פלורסנט מוצרים בגודל זהה (החלונית העליונה), ואילו מוצרים PCR polyclonal לגרום לפיזור רגיל יותר בגדלים המוצר (החלונית התחתונה). עקבות אדום הם פסגות של סולם הדנ א שכותרתו fluorescently שנטען בתהליך הזרקה נימי אותו כדוגמה ארובת העין. השברים בגודל סטנדרטי נחשפים לכוח electrophoretic אותו כמו הדגימה, ולכן חשופים לאותם תנאים הזרקה. המרווח אחיד של השברים רגיל גודל מאשר גודל מדויק טלפון... עקבות הכחולים מייצגים monoclonal (הלוח העליון) או polyclonal (פאנל התחתונה) טבעו של הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. דוגמאות של טבלאות סיכום התוצאה שסופקו על-ידי IMGT/V-QUEST. (א) טבלת סיכום תוצאות עבור שחלוף גנטי פרודוקטיבי IGHV-IGHD-IGHJ (לא codon(s) stop וצומת במסגרת רצף של). V-הגן אלל, J-גן ואת אלל המזוהה לפי הרצף משתמש על-ידי IMGT/V-QUEST במקרה זה הם IGHV4 - 34 * 01 ו- IGHJ6 * 02 (על בסיס הערכת ציון היישור הגבוהה ביותר). זהות אחוז לא 99.65% עקב מוטציה יחידה סומאטית. של D-גן ו אלל המזוהה על-ידי IMGT/JunctionAnalysis הוא IGHD3 - 3 * 01 קריאה מסגרת 1. אורך האזורים 4 framework (FRs), כמו גם 3 משלימים את החסר הקובע האזורים (Cdr) מסומנים בסוגריים מרובעים. רצף חומצות אמיניות (AA) של צומת IGHV-D-J הינה גם מסופקת. בדוגמה זו, הצומת מורכבת 22 AAs. (B) טבלת סיכום תוצאות עבור רצף שחלוף גנטי IGHV-IGHD-IGHJ זה לא מועיל עקב צומת מחוץ לתמונה. X אורך CDR3-IMGT מציינת כי על הרצף הזה האורך לא היתה אפשרות לקבוע. הסימנים "#" נצפו ברצף צומת AA מציינים frameshift. (ג) תוצאת טבלת סיכום אזהרה של V-אזור נמוך זהות (60.94%), המציין כי יש להשתמש באפשרות 'הוספות ומחיקות' בסעיף 'מתקדם פרמטרים'. (ד) טבלת סיכום תוצאות עבור המקרה עם germline זהות אחוז נמוך מאויר באיורים (ג) לאחר חזרה על הניתוח רצף שימוש באפשרות 'חיפוש של תוספות ומחיקות'. האחוזים הזהות הנכון מוצג בסוגריים מרובעים, מחושבת בהתחשב ההוספה כאירוע יחיד mutational. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. ערכה הקצאה דוח טבלת שנוצר על-ידי הכלי מעצר/AssignSubsets. רצפי FASTA IG מחולים CLL 10 (A1-A10) הוגשו בכלי המעצר/AssignSubsets. A4 תיק שובץ CLL תקטלג משנה #2 (חולים בתוך קבוצה זו ידועים יש פרוגנוזה ללא התחשבות SHM עומס) עם ביטחון עצמי גבוה. שבע הרצפים האחרים המקרים/לא הוקצה לקבוצת משנה הסטראוטיפי הגדולות, מסווג ומכאן שלא הוקצו. שני הרצפים הועלה (A7 ו- A8) לא היתה אפשרות להשתמש עבור הקצאה משנה, היו במקום זה מסווג כמו דילג/בריאה עקב בעיות עם רצף, קרי, בשל צומת מחוץ לתמונה או הנוכחות של תחנת codons. הסבר מקיף את כותרות הטבלה, הכלי זמין באתר האינטרנט מעצר/AssignSubsets32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
המחקר של IG גנים ב- CLL כבר חיוניים לא רק על מתן הבנה טובה יותר לתוך המחלה pathobiology אלא גם לשיפור ריבוד הסיכון לחולה. לכן זה בעל חשיבות עליונה כי הליך רב שלבי ניתוח רצף גנטי IG ופרשנות עוקבות של רצף הנתונים מתבצע בצורה סטנדרטית. הזמינות של החומר המטופל מתאים ומספיק ותזמון של דגימה לא צריך להשפיע על היכולת לבצע ניתוח mutational גנטי IG מאז הבדיקה יכולה להתבצע על חמאת בוטנים ועל דוגמה עם ספירת תאים גבוהה CLL הגידול. הפרדת תאי תאי דם באמצעות שיטות הפרדת צבע מתבצע באופן שגרתי במעבדות לאבחון, כמו תמיד, כדאי לשים לב בעת הוספת הפתרון דם/RPMI הצינור המכיל מעבר הצבע; פעילות זו צריכה להתבצע בצורה איטית, עדין כדי להימנע מהפרעה מעבר הצבע ולמנוע האובדן של תאים.
בעקבות הפרדת התא, חומצות גרעין מחולצים. הן gDNA ו- cDNA מתאימים לניתוח SHM של התארגנות מחודשת וקשתות clonotypic, עם זאת, ישנם יתרונות וחסרונות לשימוש של חומר או. מעבדה זרימת העבודה ממשיכה מהר יותר בעת שימוש gDNA מאז שעתוק במהופך אין חייב להתבצע לפני ה-PCR הגברה. אמר, באמצעות gDNA כפי המצע עבור ה-PCR עלול לגרום ההגברה של rearrangements היצרני והן יצרנית אשר, בתורו, יכול להוביל את עבודת מעבדה תרגולים נוספים, קרי, טיהור או ג'ל כריתה של מספר מוצרים PCR ורצף בודדים של כל rearrangements. בעת השוואה בין הגישות gDNA ו- cDNA, עבור הלה צעד שעתוק במהופך חייב להתבצע לפני שתמשיך עם הגברה PCR. עם זאת, במקרה זה, ברוב המקרים, רק rearrangements איג פרודוקטיבי מוגבר, לאחר מכן וסודרו. לפיכך, רק מוצר ה-PCR אחד מטוהר, רציף, ואילו תוצאות פרשנות היא יותר ישירה.
היעילות של הגברה תלויה, במידה רבה איכות gDNA/cDNA, אשר וצריך להעריך באמצעות שיטה כימות רגיש, תחל את מנוצל. צבעי יסוד בשימוש הם קריטיים כדי ההליך האנליטי כולו כי הקביעה מדויקת של רמת SHM תוכל להיות מושגת רק על ידי הגברה את הרצף השלם של הגן IGHV שסודר. רק יכול להיות מוערך על שחלוף באורך מלא אם 5' IGHV מנהיג תחל משמשים, ובכך להצדיק את ההמלצות האחרונות על-ידי אריק לשימוש של מנהיג תחל27. השימוש תחל חלופיים, שמוביל ההגברה של rearrangements לא שלם של ג'ין IGHV-IGHD-IGHJ, אינו מתאים לניתוח mutational ג'ין IGHV, ומכאן חריפה ייעץ. החריגה היחידה נוגעת למקרים בהם שוב ושוב לתוצאות שליליות כאשר תחל מנהיג IGHV משמשים, ניתוח של המטופל חומר חדש הוא לא אפשרי או גם האם לא מניבות תוצאות. אם השימוש מדגם החולה שונים ו/או חומר (gDNA/cDNA), תחל שונים מגדיר עדיין להיכשל כדי לייצר מוצר ה-PCR, סיבות אפשריות יכול להיות כי הנטל תא הגידול הוא נמוך מדי או את ריבוי לימפוציטים ואינו שיבוט CLL (ובמקרה immunophenotype צריך להיות מחדש). יש לציין תחל המשמש לניתוח תמיד בדו ח קליני.
כפי CLL היא תוצאה של ההצטברות של תאי B monoclonal הנושאת את הסידור החדש באותו גן IGHV-IGHD-IGHJ, עבור הרוב המכריע של המקרים clonality הערכת תחשוף ייחודי monoclonal לשיא, קרי, שיבוט יחיד. במקרים נדירים, כפול rearrangements או אפילו oligoclonal דפוסי ייבחנו35. במקרים כאלה, בג'ל אינו הטכניקה המועדפת להערכת clonality ולא צריך להיות מיושם שיטות רגיש יותר כגון ניתוח שבר. ברגע clonality אושרה, השלב האחרון לפני רצף מתייחס הטיהור של המוצר PCR על מנת להבטיח כי רצפים באיכות גבוהה מתקבלים. לבסוף, הכלי IMGT/V-השאיפה היא המשאב מומלץ לניתוח רצף IG על ידי אריק. IMGT מסדי הנתונים מתעדכנים כל הזמן, לדווח על תוצאות וגאנדהרו, באופן טוב המבואר, כלי זה מבטיח ניתוח מתוקננת ואסטמה ומקילה על ניתוח השוואתי בין מתקני קליני או אקדמיות שונות.
ניתוח immunogenetic ב CLL יש prognostic, בפרט, השלכות חיזוי, ניתוח חזקים של הסידור החדש ג'ין IGHV-IGHD-IGHJ כולל את המשימה CLL הגדולות תקטלג קבוצות משנה, אינו רק רצוי אלא חשיבות מרכזית. זה בולט במיוחד בעידן זה של הריפוי ואת הפוטנציאל שיש IG מפענוח להנחות טיפול החלטות5,21,22,23,36,37 ,38, כמו באופן רשמי שמציין העדכון האחרון של ההנחיות NCI במימון מבית המלאכה הבינלאומי ב CLL24. כי אמר, קפדני סטנדרטים הם לאחריות, במיוחד כאשר הנחישות של מצב SHM clonotypic מחדש ג'ין IGHV בחולי CLL אינה עניין של מה בכך ולא כרוך תהליך רב שלבי. והכי חשוב, שלבים ניסיוני מסוימים, בייחוד הבחירה של תחל תוצאות משופרות תשואה ספציפי אופציות ו/או מתקרב הם דבקו, היבטים טכניים אחרים נתונות מידה מסוימת של גמישות, כגון בחירת חומרים או שיטה להערכת clonality, בשל העובדה כי הם מובילים את ההבדלים הדקים, אם בכלל, לגבי התוצאות הסופיות.
במהלך העשור האחרון, אריק שואבת כדי לקדם את סטנדרטיזציה והרמוניזציה של שיטות שונות הקשורה שעייפים ולכלי CLL. זה משתקף בשיעור שפורסמו המלצות וקווים מנחים עבור ניתוח immunogenetic27,34אינספור סדנאות חינוך מאורגן, אירועים, הקמת רשת איג, כמו גם פורום מקוון מומחה כדי לדון ולספק הדרכה על פרשנות רצף גנטי IG ב- CLL. המטרה הכוללת של אריק דרך פעולות אלה היא לקדם טיפול בחולה וניהול קליני אופטימלית. למרות המאמצים אינטנסיבי, משימה זו היא רחוקה מסיומה, למעשה הפך מורכבים יותר בשל ההתפתחות של הרומן רצף תפוקה גבוהה, במטרה לאפיין את סוגי מערכת החיסון. ובכל זאת, למרות האתגרים נמשכות, מאמץ אינטנסיבי התקינה חזקים של IG מפענוח ב- CLL המשך, הם כיום המוקד של פעילות שוטפת בתוך אריק.
Disclosures
המחברים יש לא רלוונטי ניגוד עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים אנשי ההווה והעבר שלנו קבוצות מחקר, קבוצה IgCLL, אריק, עבור שלהם מחויבות והתלהבות בלימוד immunogenetics ב CLL. אנו גם רוצים להכיר שבבואה שיתוף פעולה של כל החברים של יוזמת IMGT/CLL-DB, ובעיקר, פרופסור מארי-פול Lefranc, ד ר ורוניק Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, ההיסטוריוגראפיה מונפלייה II, מונפלייה, צרפת, ו- IMGT, הבינלאומי ImMunoGeneTics מידע מערכת, שלהם עצום לתמוך ולעזור עם ניתוח רצף גנטי IG. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים TRANSCAN-179 הרומן JTC 2016; Associazione Italiana לכל החיפוש אחר לה סול למקורות Cancro (חוקר גרנט #20246 ו מיוחד תוכנית מולקולרית קליניים אונקולוגיה-5 לכל מיל #9965), מילאנו, איטליה; Progetti di Rilevante Interesse נאציונלה (משחקים מהפ) #2015ZMRFEA, MIUR, רומא, איטליה; האגודה למלחמה בסרטן שוודית, המועצה למחקר השבדי, קנוט, אליס ולנברג קרן, Institutet קרולינסקה, אוניברסיטת אופסלה, החולים האוניברסיטאי אופסלה של האריה קרן למחקר סרטן, אופסלה; תוכנית אודיסאוס, מיושמת תחת "פעולה עבור אסטרטגי על מחקר, טכנולוגית בתחום", במימון התכנית המבצעית "תחרותיות, יזמות וחדשנות" (NSRF 2014-2020) ובמימון משותף יוון, האיחוד האירופי (קרן לפיתוח האזור האירופי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
| BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
| BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
| Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
| Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
| RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
| Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
| Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
| Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
| Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
| Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
| Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
| QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
| 5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
| Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
| DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
| PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
| Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | - | PCR/Clonality assessment |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
| UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
| 10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
| DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
| Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
| Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
| GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
| Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
| Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
| Centrifuge | equipment | ||
| PCR machine | equipment | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, IARC publications. (2017).
- Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed? Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).
- Sutton, L. A., Rosenquist, R. The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Cancer Biology. , (2015).
- Mina, A., et al. Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet? Blood Reviews. , (2017).
- Sutton, L. A., et al. Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification. Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).
- Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).
- Burger, J. A., Chiorazzi, N. B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).
- Packham, G., et al. The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy. Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).
- Messmer, B. T., et al. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).
- Stamatopoulos, K., et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 109 (1), 259-270 (2007).
- Agathangelidis, A., et al. Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies. Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).
- Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).
- Baliakas, P., et al. Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study. The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).
- Gounari, M., et al. Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8. Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).
- Ntoufa, S., et al. B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4. Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).
- Mansouri, L., et al. Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).
- Navrkalova, V., et al. ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres. Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).
- Rossi, D., et al. Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).
- Sutton, L. A., et al. Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors. Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).
- Fischer, K., et al. Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial. Blood. 127 (2), 208-215 (2016).
- Rossi, D., et al. Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).
- Thompson, P. A., et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 127 (3), 303-309 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia. Blood. , (2018).
- van Dongen, J. J., et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).
- Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire. Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).
- Rosenquist, R., et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).
- Linke, B., et al. Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes. Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).
- Gonzalez, M., et al. Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies. Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).
- Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).
- Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 20, Suppl 1. i379-i385 (2004).
- Bystry, V., et al. ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy. Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).
- Belessi, C. J., et al. IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: "CLL-biased" deletions in a subset of cases with stereotyped receptors. European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).
- Langerak, A. W., et al. Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).
- Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL. Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).
- Farooqui, M. Z., et al. Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial. The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).
- Furman, R. R., et al. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).
- Burger, J. A., et al. Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).
