Summary
Heri, præsenterer vi en protokol, der detaljer de tekniske aspekter og væsentlige krav at sikre robuste IG gen Sekvensanalyse hos patienter med kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), baseret på den akkumulerede erfaring af initiativet europæisk forskning på CLL (ERIC).
Abstract
Under B-celle modning, den komplekse proces af immunglobulin (IG) gen V (D) Jørgensen rekombination kombineret med somatiske hypermutation (SHM) giver anledning til en unik DNA-sekvens inden for hver enkelt B celle. Da B-celle maligniteter resultere fra klonal ekspansion af en enkelt celle, repræsenterer IG gener en unik molekylære signatur fælles til alle maligne celler inden for en bestemt patient; IG gen rearrangementer kan således bruges som klonede markører. Ud over at fungere som et vigtigt klonede id, kan IG gensekvens fungere som en molekylær tidslinje, da det er forbundet med specifikke udviklingsmæssige stadier og dermed afspejler historie af B-celle involveret i den neoplastiske transformation. Derudover for visse maligne sygdomme, især kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), IG gensekvens holder prognostiske og potentielt prædiktive kapaciteter. Når det er sagt, ekstrapolere meningsfulde konklusioner fra IG gen Sekvensanalyse ville være umuligt, hvis robuste metoder og værktøjer ikke var til rådighed til at støtte i deres analyse. Denne artikel vil trække på den store erfaring i den europæiske forskningsinitiativ på CLL (ERIC), detaljer de tekniske aspekter og væsentlige krav skal sikre pålidelig og reproducerbar IG gen Sekvensanalyse i CLL, en test, der er nu anbefales for alle CLL patienter før behandling. Mere specifikt, beskrives de forskellige analytiske faser lige fra clonotypic IG gen omlejring identifikation og bestemmelse af nucleotidsekvensen til den præcise kliniske fortolkning af IG-gen ordne i rækkefølge data.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), den mest almindelige form for leukæmi hos voksne i de vestlige lande, er karakteriseret ved den klonal ekspansion af modne neoplastiske B celler1. Fra et klinisk perspektiv er sygdomsforløb meget variabel med nogle patienter oplever en aggressiv sygdom, der kræver behandling meget tidligt efter diagnosticering, og ofte recidiverende eller er refraktære over for terapi. Dette er i skarp kontrast til en betydelig procentdel af patienter (~ 30%), der præsenterer med en indolent sygdom, aldrig kræve behandling, og har en levetid svarende til alder-matchede raske personer2. Denne kliniske heterogenitet er afspejlet i mangfoldigheden af de molekylære abnormaliteter fundet i CLL-patienter, som i sidste ende drive patogenese og progression af denne sygdom3.
Etablere en præcis CLL diagnose er som regel ligetil, men den førnævnte kliniske heterogenitet kan hindre den effektive forvaltning af CLL patienter og understreger behovet for prognostiske og prædiktive markører, der kunne hjælpe med at behandling besluttende2. Talrige undersøgelser har forsøgt at forfine prognosticering af CLL, som kulminerede i en overflod af nye kliniske og biologiske markører er foreslåede4. Mutationsmønstre status for clonotypic immunoglobulin tunge variabel (IGHV) genet er en af de mest robuste prognostiske markører i CLL, i vid udstrækning skyldes det, at (i) det forbliver stabile over tid og som sygdommen skrider frem, og (ii) det er uafhængige af andre kliniske og biologiske parametre5. Trods meget få, om nogen markører, herunder IGHV mutationsmønstre status, i øjeblikket anvendes i kliniske rutine på tidspunktet for diagnosen.
Første rapporter om den kliniske anvendelighed af IG-gen sekventering i CLL dato helt tilbage i 1999, da 2 uafhængige undersøgelser rapporteret, at patienter med ingen eller minimal somatiske hypermutation (SHM) belastning (unmutated CLL, U-CLL) har en dårligere prognose end patienter med en højere SHM byrde (muterede CLL, M-CLL)6,7. Mere specifikt, til U-CLL gruppe bestod af tilfælde husly clonotypic IGHV gener med få eller ingen SHM og dermed en høj procent identitet til det nærmeste kønscelleoverførsel IGHV gen (≥98%), mens M-CLL bestod af sager med en højere mutationsmønstre belastning (procent identitet til den nærmeste kønscelleoverførsel IGHV gen < 98%). Siden disse tidlige studier, har det hele tiden vist at U-CLL tilfælde vise en kortere tid til første behandling (TTFT) og samlet overlevelse (OS) i forhold til M-CLL.
Set i bakspejlet fremhævet disse skelsættende undersøgelser den afgørende rolle af B-celle receptoren (BcR) IG i CLL pathobiology, dermed bane vejen for omfattende forskning i CLL-microenvironmental interaktioner, som til gengæld ført til en mere omfattende forståelse af den biologiske heterogenitet af denne sygdom8,9. Nyere undersøgelser har ydet supplerende støtte for betydningen af immunogenetic analyser i CLL ved at afsløre, at enkelte tilfælde kan klynge i delmængder på grund deling (uægte) identiske BcR IG gensekvenser, et fænomen betegnes BcR IG stereotypy10 ,11,12,13. Akkumulere beviser støtter tanken om at patienter, der er tildelt de samme stereotype delmængde harbor lignende clinicobiological egenskaber der tydeligt adskiller dem fra andre CLL patienter inden for kategorien samme SHM men med forskellige IG gensekvenser; Det er faktisk blevet rapporteret, at kategoriseringen af CLL patienter baseret på BcR IG stereotypy yderligere forædler bulk opdeling af CLL patienter i U-CLL eller M-CLL grupper14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Fra et klinisk perspektiv er det bemærkelsesværdigt at SHM status af clonotypic IGHV genet synes at korrelere med et specifikt svar på chemoimmunotherapy. I særlige, M-CLL patienter behandlet med en kombination af cyclophosphamid-fludarabine-rituximab (FK), guld standard behandling for lægeligt synspunkt egnede CLL patienter mangler TP53 genet defekter, udstillet betydeligt længere progressionsfri overlevelse (PFS) og OS i forhold til U-CLL-patienter, som fik samme behandling21,22,23. Derfor, identifikation af SHM status er blevet vigtigt i særdeleshed for at bistå i den terapeutiske ledelse af CLL patienter dvs. en intelligent markør, i stedet for vurderingen af det kliniske forløb af den sygdom dvs. en prognostiske markør. I virkeligheden, ifølge den seneste opdatering af retningslinjerne NCI-sponsoreret af International Workshop om CLL, SHM status for omarrangeret IGHV gener bør være målrettet i alle CLL tilfælde før behandling indledning i både almen praksis og kliniske forsøg24. Desuden, på grund af den nylige godkendelse af roman behandling agenter, og det voksende antal stoffer i forsøg, SHM status af IG molekyle kan spille en endnu større rolle i den terapeutiske ledelse af patienter med CLL i den i nærheden af fremtidige5.
Denne rapport beskriver alle aspekter af IG-gen Sekvensanalyse, begynder med at vælge det passende materiale og kulminerede med den kliniske fortolkning af sekventering resultater. Dybdegående vurdering af disse trin er vigtigt i diagnostisk rutine for produktion af pålidelige resultater og for at sikre nøjagtige tålmodige stratificeringsniveau inden for kliniske forsøg. Protokoller leveres til støtte i harmoniseringen af IG-gen Sekvensanalyse, hvilket sikrer at resultaterne er sammenlignelige blandt forskellige laboratorier.
Protocol
Forskning protokol godkendtes af den etiske komité i San Raffaele videnskabelige Institut, Milano, Italien.
1. materialevalg
-
Valg af start materiale
Bemærk: I de fleste tilfælde af CLL celletal tumor er høj på diagnose (> 80-90%). Celle sortering eller berigelse af leukemic celler er således normalt ikke nødvendigt.- Hvis du bruger perifert blod (PB), den mest almindelige materiale valg for IG gen Sekvensanalyse, bruge en blodvolumen mellem 10-20 mL.
- Også i sager med en lav CLL celle byrde, bruge celle sortering af PB prøver eller materiale fra andre væv, som knoglemarven (BM) eller lymfeknuder (LN).
-
Prøvetagningstiden
- Prøvetidspunktet er ikke afgørende, eftersom det IG SHM status er stabil overarbejde; Når det er sagt, undgå prøveudtagning i bestemte perioder, som umiddelbart efter eller under behandlingen, da det lave antal CLL celler kan komplicere analysen og føre til upålidelige resultater.
-
Materiale indsamling og opbevaring
Bemærk: Indsamling og opbevaring af starter materiale afhænger kraftigt materiale valget.- For PB eller BM prøver, bruge EDTA eller CPT (citrat-tris-pyridossalphosphate) indsamling rør til at forhindre hæmning af PCR-amplifikation processen; Alternativt kan du bruge heparin rør.
- For LN prøver er indsamling muligheder enten celle suspensioner, biopsier fra frisk frosset væv eller, i sjældne tilfælde formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) væv.
2. massefylde Gradient adskillelse
Bemærk: Hvis PB eller BM er udgangsmaterialet af valg, som er den mest hyppige scenario, anbefales mononukleære celler isolation ved hjælp af tæthed gradient adskillelse.
- Tilføje 200 µL af EDTA (0,5 M EDTA / pH 8,0) til en 50 mL sterilt collection tube. Der tilsættes 20 mL PB og 15 mL RPMI. Mix af pipettering (2 - 3 gange er tilstrækkelig).
- Tilsættes 15 mL tæthed gradient medium til en ny 50 mL collection tube.
Bemærk: I tilfælde af PB volumen er mindre end 20 mL, mængder af RPMI (tidligere trin) og tæthed farveforløb bør ændres i overensstemmelse hermed. - Langsomt lag i løsningen fra trin 2.1, således at det ikke forstyrrer gradienten. Centrifugeres ved 800 x g i 20 minutter med centrifuge bremse ned.
- Indsamle mononukleære celler ringen, som er dannet mellem den øverste plasma/trombocyt lag og tæthed gradient medium lag ved hjælp af en steril Pasteur pipette og derefter overføre til en steril 15 mL collection tube.
- Føje RPMI til en endelige mængden af 12 mL og blandes. Der centrifugeres ved 750 x g i 8 minutter. Supernatanten.
- Resuspenderes celle ved hjælp af 10 mL af RPMI og gentage trin 2,5.
- Opløse den celle pellet i 1 mL PBS (DPBS, ingen calcium, ingen magnesium). Udføre en celletal, ved hjælp af en Neubauer pladen ved at blande 20 µL af prøven og 80 µL 1:10 Türks løsning.
- Hvis downstream behandling af prøven ikke er planlagt til samme dag, centrifugeres prøve på 750 x g i 8 minutter. Supernatanten og gemme celle pellet på-80o C.
3. nukleinsyre udvinding
- Beslutte på et substrat for analyse af SHM status af IG gener. Genomisk DNA (gDNA) er det mest populære valg, da der er ikke behov for en reverse transkription skridt; Alternativt, brugen af RNA/supplerende DNA (cDNA) sikrer, at mindst på transkriptionel niveau, produktive og funktionelle clonotypic IG omlejring er "begunstiget" målet.
- Brug en af talrige kommercielt tilgængelige kits egnet til gDNA eller total RNA udvinding og syntesen af cDNA (Se Tabel af materialer).
- Vurdere integriteten af DNA eller RNA ved hjælp af følsomme nukleinsyre kvantificering systemer. Hvis bruger FFPE materiale til analysen, vurdere kvaliteten og kvantiteten af den udpakkede gDNA/cDNA ved PCR-amplifikation af et kendt husholdning gen, fx retinoid syre receptor alpha (RARa), beta-actin, osv.
4. forstærkning og sekventering af IGHV-IGHD-IGHJ gen rearrangementer
-
IGH PCR primer udvalg
- Helst, udføre multiplex PCR med IGHV undergruppe specifikke 5' primere og IGHJ gen specifikke 3' primere25,26. Hvis resultaterne er optimale, forberede separat PCR blander ved hjælp af enkelt IGHV undergruppe-specifikke primere.
- Brug 5' primere, at anneal enten leder region beliggende umiddelbart opstrøms af IG omlejring eller inden for regionen kodning (f.eks. ramme 1, FR1) af IGHV-genet.
- Brug leder primere, der giver mulighed for forstærkning af hele omarrangeret IGHV-IGHD-IGHJ gensekvens, som igen vil sætte den nøjagtige skøn over SHM niveauer. Således er IGHV leder primere anbefalet af ERIC i deres ajourførte retningslinjer for IG gen ordne i rækkefølge analyse27.
- I tilfælde hvor leader primere undlader at forstærke clonotypic IG omlejring, brug IGHV FR1 primere. Imidlertid forstærke rammer primere ikke hele clonotypic IG gen omlejring, hvilket kan medføre unøjagtige bestemmelse af niveauet for SHM. I dette scenarie, klart i rapporten klinisk at brugen af IGHV FR1 primere kan overvurdere det sande procent identitet til nærmeste germline-genet.
- 3' enden, bruge konsensus primere målretning IGHJ gener, multiplex sæt af IGHJ gen-specifikke primere eller isotypespecifikke primere, afhængig af underlaget. Primer sekvenser er fastsat i tabel 1, mens figur 1 skildrer de forskellige placeringer for primer udglødning.
-
PCR-amplifikation af IGHV-IGHD-IGHJ-gen rearrangementer
- Forberede primer blandingen ved hjælp af equimolar mængder af hver undergruppe primer(s) for at sikre uvildig forstærkning.
- For eksempel, når du bruger leder primere, er to forskellige primere brugt til at forstærke rearrangementer tilhører IGHV1 undergruppe. Således brug et antal af disse 2 primere (IGHV1L og IGHV1bL), der er halvdelen i forhold til IGHV4L, som er den eneste primer for IGHV4 undergruppe rearrangementer.
- Gælde det modsatte synspunkt i forbindelse med IGHJ1-2 og IGHJ4-5 primere. Da disse primere målrette to forskellige IGHJ gen undergrupper, dobbelt mængde i forhold til IGHJ3 og IGHJ6 primere.
- Brug tabel 1 til at bestemme de nøjagtige primer mængder under udarbejdelsen af relevante primer blander.
- Mix PCR reagenser som anført i tabel 2. Efter kombinerer alle PCR-reagenser i et PCR rør, tilsæt 0,5 µL af Taq-polymerase og 100 ng gDNA eller 2 µL cDNA (cDNA bør forberedes ved hjælp af 1 µg af RNA).
Bemærk: En Taq enzym med korrekturlæsning aktivitet er ikke afgørende som forstærkning fejlprocenten er ekstremt lavt og vil derfor ikke påvirke niveauet af SHM. - Kør den termiske PCR-protokol detaljeret i tabel 3.
- Forberede primer blandingen ved hjælp af equimolar mængder af hver undergruppe primer(s) for at sikre uvildig forstærkning.
-
Clonality vurdering
Bemærk: En kritiske næste skridt indebærer evaluering clonality mønster af PCR-produktet. Ved vurderingen af clonality i CLL patienter, er den mest almindelige at finde en enkelt, monoklonale peak/band.- Bruge metoder med høj følsomhed, såsom fragment eller heteroduplex analyse, for clonality vurdering28,29.
- Fragment analyse
- Udføre multiplex PCR'er ved hjælp af 5'-mærket IGHV leder eller FR1 undergruppe specifikke PCR-primere; Dette vil give PCR-produkter, der kan være adskilt af kapillær elektroforese, derved tillade clonality vurdering af IGH PCR produkter baseret på deres IGHV komplementaritet bestemmelse region 3 (CDR3) længder.
- Bruge primere, reagenser og termiske forhold, der er identiske med de tidligere nævnte (se tabel 1-3). Brugerdefinerede 5´-mærket primere navngives fluorescently oligos med et valg af farvestoffer på 5'-enden. Eksempler på reporter farvestoffer 6-FAM, HEX, NED eller TET. 2 separate reaktioner er således påkrævet baseret på brug af 3 forskellige farvestoffer pr. reaktion.
- Vurdere størrelsen af PCR produkter på et seks procent (6%) polyacrylamid gel (denne procentdel resulterer i optimale opløsning), ved hjælp af 1 x TBE som kører buffer. Køre på 80 V i 45 min.
Bemærk: Det anbefales, at PCR-produkter får lov til at migrere på gelen i tilstrækkelig lang tid saa monoklonale prøver kan være adskilt fra polyklonale baggrunden og DNA størrelse markør kan adskille tilstrækkeligt. Faktorer som størrelse og tykkelse af gel kan påvirke migration så ingen enkelt indstilling (spænding og tid) kan sikre et optimalt resultat, der sagde, indstille spændingen på 80 V i 45 minutter er et godt udgangspunkt, som det minimerer risikoen for prøven overfører også hurtigt og 'kører' off gel. - Kontrollerer PCR produkter af ca. 500 basepar når du bruger IGHV leder primere og 350 basepar, når ved hjælp af IGHV FR1 primer blander.
Bemærk: I sjældne tilfælde, CLL tilfælde har vist sig for at bære dobbelt, monoklonale produkter og endnu sjældnere tilfælde, kan tilfælde udviser en oligoklonale mønster. Intercalating agent såsom ethidiumbromid (EtBr) eller mindre farlige og mere følsomme kommercielt tilgængelige DNA pletter kan anvendes til visualisering af DNA på acrylamid geler UV excitation eller blåt-lys.
-
PCR produkt rensning
Bemærk: PCR produkter er renset for at fjerne enhver polyklonale baggrund med oprindelse fra normale B celler inden for CLL prøve samt primer dimerer, der kan føre til suboptimale sekvensering. Bruge enhver metode, der fjerner personlige dNTP'er og primere PCR oprydning, såsom en enzymatisk behandling, fx Sap (rejer alkalisk fosfatase) / Exo (Exonuclease jeg), eller kolonne-baserede rensning.- Indlæse det samlede volumen af PCR produkt på en 3% lav-smeltende agarosegel.
- Tillad PCR-produkter til at køre på gelen, indtil de adskilt fra baggrunden.
- Punktafgifter de skarpe, fremtrædende PCR bands, rense og elueres. Hvis to rearrangementer opdages, begge bands skal være skåret ud og sekventeret separat.
- For at udføre Sap/Exo oprydning, Følg fabrikantens anvisninger med hensyn til de specifikke diskenheder til at bruge; men en typisk reaktion kan indeholde 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo og 2 µL 5 x inkubation buffer pr. 5-10 µL PCR reaktionen. Mix af forsigtigt vortexing hver prøve og Ruger på en PCR blok ved 37 ° C i 30 minutter. Inaktivere enzymerne ved opvarmning til 85 ° C i 15 minutter.
- Indlæse en lille mængde af PCR-produkter på en 3% agarosegel at vurdere renhed af produktet.
5. Sanger sekventering
Bemærk: Flere sekventering strategier findes dog uanset den nøjagtige fremgangsmåde, direkte sekventering af begge tråde er obligatorisk for at sikre et pålideligt resultat.
-
Generelle sekventering protokoller
- Hvis forstærkning er udført med enkelt primere, fortsætte med sekventering ved hjælp af passende IGHV - og IGHJ- eller konstant region-specifikke primere. Denne tilgang kan også vedtages, hvis multipleksede fluorescently mærket primere har været brugt og PCR produktet blev vurderet ved hjælp af fragment analyse (sekventering primere ikke bør være mærket).
- Hvis multipleksede primere har været brugt og clonality blev vurderet på en gel, derefter bruge en downstream primer på det første trin af sekventering fx en konsensus IGHJ primer med sekvensen er 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'. Alternativt, en CH primer kan bruges hvis cDNA blev brugt som substrat. Brug derefter undergruppe-specifikke IGHV leder eller FR1 primere til andet trin af sekventering.
-
Eksempel sekventering protokol
Bemærk: Flere sekventering protokoller findes og et eksempel protokol er nærmere beskrevet nedenfor.- Fortynd 33 ng af PCR-produktet i en samlet maengde paa 11,5 µL bruger, fx sterilt vand. Denaturere PCR produkt ved opvarmning til 95 ° C i 5 minutter. Samme sted på is i 10 minutter for at forhindre dannelsen af sekundære strukturer.
- Tilføje 8 µL af master mix til hvert rør sammen med 0,5 µL (svarende til 5 pmol) på primeren.
- Som et kontrolelement, forberede et rør, der indeholder 8 µL af master mix, 0,5 µL pUC18 kontrol skabelon, 2 µL (-) 47 sekventering primer og 9,5 µL sterilt vand. Den endelige samlede rumfang i hvert rør skal være 20 µL.
- Brug termisk cykling betingelser for sekventering reaktion som beskrevet i tabel 4.
- Forberede stopopløsning ved at blande 2 µL af natriumacetat 3M (pH 5,2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8,0) og 1 µL af glykogen (koncentration 20 mg/mL), derefter tilsættes 5 µL til hver prøve. Overføre produktet til et nyt microcentrifuge-rør.
- Tilsættes 60 µL af 100% ethanol (-20 ° C) og bland forsigtigt. Der centrifugeres ved 14.000 rpm i 15 minutter (4 ° C). Supernatanten.
- Tilsæt 100 µL af 70% ethanol (-20 ° C) og forsigtigt blandes. Der centrifugeres ved 14.000 rpm i 10 minutter (4 ° C). Supernatanten. Gentag én gang.
- Tørre pellet i 90 minutter ved stuetemperatur. Tilføje 40 µL af sodium dodecyl sulfat (SDS) løsning til hver prøve.
- Overføre prøven til en sekvensering pladen, dække med strip caps eller tape sæler, indlæse til maskinen og udføre Sanger sekvensering. Sekventering plade er som regel en 96-brønd, v-bund, fuld-nederdel PCR plade kompatibel med sequencer. Pladerne kan være barcoded afhængigt af om Sekventeringen er udføres in-house, på et kommercielt selskab eller en akademisk sequencing center/platform.
- Efter sekvensering, 'sy sammen' de 2 læser genereret fra de enkelte sekventering skridt til at danne en komplet IGHV gen omlejring dvs konsensus sekvens.
6. Sekvensanalyse
Bemærk: De følgende afsnit fokus på output fremstillet IMGT/V-QUEST værktøj30 , når du analyserer omarrangeret IG sekvenser, og IMGT/JunctionAnalysis31, som begge er særdeles relevante for klinisk rapportering og forskning undersøgelser. IMGT/V-QUEST er en justering værktøj, der sammenligner brugeren indsendt IG sekvenser med IMGT reference register angiver30. Af værktøjets output indeholder flere afsnit, hvori brugeren kan definere visse parametre.
- Angive arter, fx Homo sapiens (human), og receptor type eller locus (f.eks. indvendige Gearnav, IGK eller IGL).
- Indsæt sekvenser at blive analyseret i FASTA format og herunder overskrifter, i tekstområdet (i partier af op til 50 sekvenser pr. løb). Alternativt, en mulighed for at angive stien til en lokal fil indeholdende FASTA sekvenser er fastsat.
- Vælg en af følgende 3 visningsindstillinger for resultaterne:
- Detaljeret visning: Vælg denne indstilling for at få resultaterne for hver sekvens individuelt.
- Syntese Se: Vælg denne indstilling for at kompilere en oversigtstabel, bestilt af IGHV-gen og allel navn eller sekvens input rækkefølge. Denne indstilling giver også en justering af sekvenser, der i enhver indsendte parti, tildeles samme IGHV gen og allel.
- Excel-fil: Vælg denne indstilling for at give alle output filer som regneark indarbejdes i en enkelt fil. Alle visningsmuligheder har et stort udvalg af grundlæggende og avancerede parametre at vælge imellem, men kun de faktorer, der er mest relevante for CLL IG Sekvensanalyse er beskrevet nedenfor i afsnittet 'Repræsentant resultater'.
7. anholdelse/AssignSubsets værktøj
- For at undersøge BcR IG stereotypy inden for CLL (yderligere detaljer givet nedenfor i afsnittet repræsentant resultater), Send IGHV-IGHD-IGHJ FASTA sekvenser til anholdelse/AssignSubsets værktøj32. Værktøjet rapporterer tildeling til store CLL stereotype undersæt. Delmængde-tildeling værktøj samt detaljerede instruktioner findes på anholdelse/AssignSubset hjemmeside32 og også på ERIC hjemmeside under fanen tjenester.
Representative Results
Eksemplerne nedenfor viser resultaterne fra IG gen sekventering analyse følgende trinene beskrevet ovenfor. Selv om DNA og/eller RNA ekstraktion er rutinemæssige procedurer for de fleste kliniske/forskningslaboratorier, indebærer et første afgørende skridt kontrol kvalitet/mængde gDNA og/eller RNA bruger et spektrofotometer eller anden egnet teknologi med høj følsomhed. Det næste vigtige skridt involverer PCR-amplifikation af clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen omordning. Som nævnt ovenfor, kun de IGHV leder primere giver mulighed for forstærkning af den fulde længde af den omarrangeret IGHV gensekvens, dermed tillade den sande SHM belastning bestemmes; IGHV leder primere er derfor anbefalede primer valg (figur 2). I sjældne tilfælde hvor IGHV leder primere kan forstærke clonotypic IG omlejring, kan IGHV FR1 primere anvendes. Som det fremgår i figur 3, der kan ses flere PCR produkter/bands, især når gDNA er udgangsmaterialet; disse bands skal være skåret ud og sekventeret separat. Hvis både IGHV leder og IGHV FR1 primere undlader at give resultater, bør analysen gentages med en ny patient prøve (når det er muligt). Den sidste checkpoint inden sekventering er at fastlægge clonality af prøven ved hjælp af fragment analyse (figur 4).
Sekvenser opnået skal analyseres ved hjælp af IMGT/V-QUEST værktøj30. Bruger-valgte parametre omfatter arter, receptor type eller locus, søgning efter indsættelse, og sletning option, etc. og er opført sammen med antallet af sekvenser analyseret. Hver FASTA sekvens vises og V-DOMÆNET analyseret ved IMGT/V-QUEST er markeret med grønt. Derudover hvis inputsekvensen var i den modsatte retning (antisensstoffer), programmet automatisk giver den supplerende omvendt rækkefølge og hedder det ovenfor FASTA sekvens.
Resultatet oversigtstabel tilbydes direkte under FASTA sekvens, på toppen af den detaljerede visning resultater side, og indeholder oplysninger, der er vigtige for den kliniske rapportering af IG-gen Sekvensanalyse i CLL. Hver række i tabellen er forklaret nedenfor.
Resultat Resumé. Den første række i resultattabellen hedder funktionaliteten af inputsekvensen: en IG omarrangeret sekvens kan være enten produktiv eller uproduktive (figur 5A & 5B). En IG gen omlejring er uproduktive Hvis stop kodon er til stede inden for V-D-J-regionen (for VH) eller V-J-regionen (for VL) og/eller hvis omlægning er ud af rammen på grund af indsætninger/sletninger. En tredje output er angivet, da funktionen ikke kan bestemmes, dvs., hvis IGHV-IGHD-IGHJ junction ikke kan identificeres; i dette tilfælde, ville resultatet Resumé læse som 'Ingen omlejring fundet' eller 'Ikke krydset fundet'. Det er vigtigt at bemærke at det kun er produktive, og dermed, funktionelle rearrangementer bør analyseres yderligere. Hvis sålen forstærket IG omlejring er ikke funktionel (uproduktive eller 'ingen omlejring fundet'), PCR forstærkning processen bør gentages. Hvis resultatet er fortsat negativ bør en ny patient prøve opnås.
V-gen og allel. Rækken 'V-gen og allel' angiver nærmeste kønscelleoverførsel IGHV gen og allel med sin alignment score og procent identitet. Hvis flere molekylærgenetisk og alleler giver den samme høje score, er alle angivet. Procent identitet mellem den indsendte sekvens og nærmeste IGHV gen og allel er af særlig betydning, da det bestemmer SHM status. Denne værdi beregnes ud fra den første nukleotid af V-regionen til 3' enden af V-regionen undtagen CDR3. Benyttes IGHV FR1 primere, bør den sekvens, svarende til primeren altid fjernes for at sikre som nøjagtig et resultat som muligt. Det skal bemærkes at lave identitet procent (< 85%) kan skyldes en indsættelse eller sletning (behandles yderligere nedenfor) og skulle dette være tilfældet ' advare ' vises i rækken 'Resultat oversigt' advare brugeren.
J-gen og allel. Som beskrevet for V-gen og allel ovenfor, angiver rækken 'J-gen og allel' nærmeste kønscelleoverførsel IGHJ gen og allel med sin alignment score og procent identitet. IGHJ gen er ret kort og dens 5' enden kan er blevet trimmet på grund af exonuclease aktivitet, søgte alternative valg dog også af værktøjet, baseret på det højeste antal på hinanden følgende identiske nukleotider.
D-gen og allel af IMGT/JunctionAnalysis. Havde gen og allel af IMGT/JunctionAnalysis' angiver den nærmeste kønscelleoverførsel IGHD gen og allel med D-regionen læsning ramme identificeret af værktøjet i bruger sekvens. IMGT/JunctionAnalysis31 giver en detaljeret og præcis analyse af krydset og er blevet integreret i grænsefladen IMGT/V-QUEST værktøj. Dette værktøj styrer alle aspekter af vanskeligheder forbundet med IGHD-gen og allel identifikation dvs, (i) den korte længde af D-regionen; (ii) brug af 2 eller endda 3 læsning rammer; (iii) exonuclease trimning i begge ender af gen; og (iv) tilstedeværelsen af mutationer.
FR-IMGT længder, CDR-IMGT længder og AA JUNCTION. Denne række indeholder længden af IGHV FRs og CdR vist i parenteser og adskilt af prikker og aminosyre (AA) krydset. AA sekvens af krydset illustrerer en i - eller ud-af-indramme omlejring (ud-af-indramme positioner er angivet med tegnet '#'), (ii) tilstedeværelsen eller fraværet af stop kodon (en stop codon er vist med en stjerne ' *'), og (iii) tilstedeværelsen eller fraværet af den ankre af VH CDR3-IMGT: C (2.-CYS 104) og W (J-TRP 118).
Somatiske hypermutations består overvejende af enkelt nucleotid ændringer, dog små indsættelser og sletninger i V-regionen kan observeres, omend på en meget lavere frekvens33. Når ved hjælp af standard IMGT/V-QUEST parametre, indsættelser og sletninger er ikke automatisk opdaget; dog stærke indikationer at en sekvens kan foretage sådanne ændringer, dvs., en lav procent identitet og/eller forskellige IGHV CDR1-IMGT og CDR2-IMGT længder mellem indsendte bruger sekvens og den nærmeste kønscelleoverførsel gen og allel, er opdaget ved den værktøj og en advarsel advarsel vises nedenstående oversigtstabel resultater (figur 5 c).
IMGT sørger for en valgmulighed, kaldes 'Search for indsættelser og sletninger' i afsnittet "Avancerede parametre" placeret under afsnittet 'visningsresultater'. I tilfælde hvor relevante advarsler vises, er det tilrådeligt at bruge denne funktionalitet. Når indsættelser og sletninger opdages, er omfattende detaljer om konstateringen forudsat i «Resultat Resumé» sektion inklusive (i) hvor indsættelse eller sletning er placeret dvs, VH FR-IMGT eller CDR-IMGT; (ii) antallet indførte/deleterede nukleotider; (iii) sekvensen (kun for indsættelser); (iv) om en frameshift er opstået; v V-regionen codon hvorfra indsættelse eller sletning starter; og (vi) de berørte nukleotid holdning i de indsendte sekvens (fig. 5 d). For indsættelser, værktøjet fjerner insertion(s) fra den indsendte bruger sekvens og derefter igen analyserer den ordne i rækkefølge benytter de standard IMGT/V-QUEST parametre. Hvis sletninger opdages, føjer værktøjet huller, repræsenteret af prikker, at erstatte de slettede nukleotider før gentage analyse.
For hver diagnostisk eller prognostiske test udføres i kliniske laboratorier, er strenge standarder og en høj grad af reproducerbarhed af allerstørste betydning. IMGT/V-QUEST output giver meget af de nødvendige oplysninger til rapportering af resultater af IG-gen Sekvensanalyse i CLL, nemlig, (i) IGHV, IGHD og IGHJ gener og alleler udnyttet; (ii) funktionalitet af clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlejring dvs., om omlægning er produktive eller uproduktive; og (iii) den omarrangeret procent identitet IGHV gen og allel i forhold til sine nærmeste kønscelleoverførsel IGHV gen og allel. Omfattende oplysninger om klinisk indberetning af IG gener i CLL, fortolkning af problematisk eller teknisk udfordrende tilfælde og anbefalinger til den nøjagtige og robust bestemmelse af IGHV gen SHM status i CLL, er læseren rettet for nylig opdateret ERIC retningslinjer og rapporter27,34.
Endelig, på grund af vores voksende viden om BcR IG stereotypy i CLL, supplerende anbefalede krav til klinisk indberetning af IG-gen rearrangementer i CLL vedrører tildeling af sager til major stereotype undersæt. Det anbefales nu at stat i den kliniske betænkning om de analyserede produktive IGHV gen omlejring kan henføres til en af de store stereotype delmængder, nemlig delmængder #1, #2, #4 og #812,27. Tildeling til store CLL stereotype delmængder bør udføres med brug af anholdelse/AssignSubsets værktøj (figur 6)32.
| 5' IGHV FR1 primere | Primer sekvens | Mængde for 60 μl primer mix | |
| IGHV1 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG | 10 | |
| IGHV2 | CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV3 | GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV4 | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG | 10 | |
| IGHV5 | GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC | 10 | |
| IGHV6 | CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG | 10 | |
| 5' IGHV leder primere | |||
| IGHV1L | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG | 5 | |
| IGHV1bL | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) | 5 | |
| IGHV2aL | AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (AC) AC | 5 | |
| IGHV2bL | AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC | 5 | |
| IGHV3aL | AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC | 5 | |
| IGHV3bL | AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC | 5 | |
| IGHV4L | AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT | 10 | |
| IGHV5L | AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC | 10 | |
| IGHV6L | AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC | 10 | |
| 3' IGHJ primere | |||
| IGHJ1-2 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 20 | |
| IGHJ3 | TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC | 10 | |
| IGHJ4-5 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC | 20 | |
| IGHJ6 | TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC | 10 | |
Tabel 1. Primer sekvenser og mængder til PCR-amplifikation af clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen omordning.
| Reagens | Volumen (μL) |
| RB x 10 buffer | 5 |
| MgCl2 (50 mM) | 3 |
| dNTP'er (10 mΜ) | 2 |
| Primer IGHV leder/FR1 mix (10 μM) | 3 |
| Primer IGHJ mix (10 μM) | 3 |
| H2O | 31,5 |
| Samlede volumen | 47,5 |
Tabel 2. Reagenser til PCR-amplifikation af clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen omordning.
| Temperatur | Varighed | Cyklus antallet | Beskrivelse |
| 94 ° C | 5 minutter | 1 | polymerase aktivering |
| 94 ° C | 1 minut | 39 | denaturering |
| 59 ° C | 1 minut | udglødning | |
| 72 ° C | 1,5 minutter | udvidelse | |
| 72 ° C | 10 minutter | 1 | endelige udvidelse |
| 18 ° C | ∞ | 1 | bevarelse |
Tabel 3. Termisk cykling betingelser for PCR-amplifikation af clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen omordning.
| Temperatur | Varighed | Cyklus antallet | Beskrivelse |
| 94 ° C | 5 minutter | 1 | polymerase aktivering |
| 96 ° C | 20 sekunder | 30 | denaturering |
| 50 ° C | 20 sekunder | udglødning | |
| 60 ° C | 4 minutter | udvidelse | |
| 4 ° C | ∞ | 1 | bevarelse |
Tabel 4. Termisk cykling betingelser for IG gen sekventering reaktion.
Figur 1. Skematisk fremstilling af en IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlejring med forskellige primer udglødning steder angivet. 5' IGHV primere anneal til leader-sekvensen, ligger opstrøms af IGHV kodende sekvens. 5' IGHV ramme (FR) primere anneal til starten af FR1-regionen, som er beliggende i omarrangeret IGHV genet, der henviser til, at 3' IGHJ primere anneal til slutningen af omarrangeret IGHJ genet. UTR: utranslaterede region. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. PCR-amplifikation af IGHV-IGHD-IGHJ-gen omrokering i 7 patientprøver med 5' IGHV leder primere. Den ottende lane repræsenterer en positiv kontrol, mens den negative kontrol for PCR blev indlæst i den niende lane. Den forventede PCR produkt er ca 500 basepar i størrelse, når du bruger IGHV leder primere. Stjerne i den sidste kolonne i gelen angiver 100 bp DNA stigen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. PCR-amplifikation af IGHV-IGHD-IGHJ-gen omrokering i 13 patientprøver med IGHV FR1 primere. Den fjortende lane indeholder den positive kontrol, mens den negative kontrol blev indlæst i den femtende lane. Som det fremgår i lane 2, som DNA var råvare, overholdes flere PCR bands, hvilket bør være skåret ud og sekventeret separat. Prøver i baner 5, 7 og 13 givet polyklonale resultater (fremgår af smear i gel), og dermed, PCR skridt bør gentages. Hvis en anden PCR undlader at forstærke omarrangeret IG molekylærgenetisk analyse bør udføres på en ny prøve (hvis muligt) eller brug en anden primer sat. Den forventede PCR produkt er ca 350 basepar i størrelse, når du bruger IGHV FR1 primer blander. Stjerne i den sidste kolonne i gelen angiver 100 bp DNA stigen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Vurdering af clonality ved hjælp af genescan analyse. I genescan analyse giver monoklonale PCR produkter anledning til en dominerende toppen af fluorescerende produkter af samme størrelse (øverste panel), hvorimod polyklonale PCR produkter resultere i en mere normal fordeling af produktstørrelser (nederste panel). De røde spor er toppe fra en fluorescently mærket DNA ladder, der er indlæst i samme kapillar injektion som eksemplet ved at blive analyseret. Størrelse standard fragmenter er udsat for den samme elektroforese kraft som prøven og er derfor udsat for de samme injektion betingelser. Ensartet afstand mellem størrelse standard fragmenter bekræfter præcis størrelse kald. De blå spor repræsenterer de monoklonale (toppanelet) eller polyklonale (nederste panel) karakter af prøverne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Eksempler på resultatet sammenfattende bordene leveres af IMGT/V-QUEST. (A) resultat oversigtstabel for en produktiv IGHV-IGHD-IGHJ-gen omordning (ingen stop codon(s) og en i-frame sekvens junction). V-gen og allel og J-gen og allel identificeret i bruger sekvens af IMGT/V-søgen i dette tilfælde er IGHV4 - 34 * 01 og IGHJ6 * 02 (på grundlag af den højeste alignment score evaluering). Procent identitet er 99.65% på grund af en enkelt somatisk mutation. D-gen og allel identificeret ved IMGT/JunctionAnalysis er IGHD3 - 3 * 01 i læsning frame 1. Længder af 4 ramme regioner (FRs) samt de 3 komplementaritet bestemmende områder (CdR) er angivet i parentes. Aminosyresekvensen (AA) af IGHV-D-J krydset tilbydes også. I dette eksempel krydset består 22 AAs. (B) resultat oversigtstabel for en IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlejring sekvens, der er uproduktive på grund af en ud-af-indramme junction. Et X til CDR3-IMGT længden angiver, at denne sekvens længden ikke kunne bestemmes. '#' Tegn observeret i AA junction sekvens indikerer en frameshift. (C) resultat oversigtstabel advarsel for lav V-regionen identitet (60.94%) og angiver, at indstillingen 'indsættelser og sletninger' i afsnittet "Avancerede parametre" bør anvendes. (D) resultat oversigtstabel for tilfældet med kønscelleoverførsel lav procent identitet illustreret i (C) efter gentagne Sekvensanalyse ved hjælp af indstillingen 'Søg for indsættelser og sletninger'. Den korrekte identitet procent vises i parentes og er beregnet at overveje indsættelse som en enkelt mutationsmønstre begivenhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Delmængde tildeling rapporttabel genereret af værktøjet anholdelse/AssignSubsets. FASTA IG sekvenser fra 10 CLL patienter (A1-A10) blev indsendt til værktøjet anholdelse/AssignSubsets. Sag A4 blev tildelt til CLL stereotype delmængde #2 (patienter i denne gruppe er kendt for at have en dårlig prognose uanset SHM belastning) med høj genkendelsessikkerhed. Syv af de andre tilfælde/sekvenser blev ikke tildelt en større stereotype delmængde og dermed klassificeret som ikke-tildelt. To af de indsendte sekvenser (A7 og A8) kan ikke bruges til delmængde tildeling og blev i stedet klassificeret som sprunget/usunde på grund af problemer med sekvens, dvs, på grund af en ud-af-indramme junction eller tilstedeværelsen af stop kodon. En omfattende forklaring af tabeloverskrifterne og værktøjet er tilgængelig på anholdelse/AssignSubsets hjemmeside32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Studiet af IG gener i CLL har været afgørende for at give en bedre forståelse i sygdom pathobiology men også for at forbedre patientens risiko stratificering. Det er derfor altafgørende, at Multi-trins procedure af IG-gen Sekvensanalyse og efterfølgende fortolkning af sekvens data er udført på en standardiseret måde. Tilgængeligheden af egnede og tilstraekkelige patient materiale og timingen af prøveudtagning bør ikke have indflydelse på evnen til at udføre IG gen mutationsmønstre analyse, da testen kan udføres på PB og på enhver proeve med en høj CLL tumor celletal. Adskillelse af mononukleære celler ved hjælp af gradient adskillelse metoder er rutinemæssigt udføres i laboratorier, der diagnosticerer, og som altid, der bør udvises forsigtighed ved tilføjelse af blod/RPMI løsning til det rør, som indeholder gradient; denne opgave bør udføres i en langsom, blid måde for at undgå at forstyrre gradueringen og forhindre tab af celler.
Efter celleseparering udpakkes nukleinsyrer. Både gDNA og cDNA er egnet til SHM analyse af clonotypic indvendige Gearnav omlejring, men der er fordele og ulemper til anvendelse af enten materiale. Arbejdsprocessen laboratorium forløber hurtigere når du bruger gDNA da ingen reverse transkription skal udføres før PCR-amplifikation. Det sagt, bruger gDNA som substrat for PCR kan resultere i forstærkningen af både produktive og uproduktive rearrangementer, som igen kan føre til yderligere hands-on laboratoriearbejde, dvs, rensning eller gel excision af flere PCR produkter og enkelte sekventering af alle rearrangementer. Når man sammenligner gDNA og cDNA tilgange, for sidstnævnte skal en reverse transkription trin udføres, før du fortsætter med PCR-amplifikation. Dog i dette tilfælde, for de fleste tilfælde vil kun produktive IG rearrangementer blive forstærket og efterfølgende sekventeret. Kun en enkelt PCR produkt bliver således renset og sekventeret, mens resultaterne fortolkning er mere ligetil.
Forstærkning effektivitet afhænger i høj grad kvaliteten af gDNA/cDNA, som bør vurderes ved hjælp af en følsom kvantificering metode og primere udnyttet. Primere bruges er afgørende for hele analyseproceduren, fordi den nøjagtige bestemmelse af SHM niveau kan kun opnås ved at forstærke den hele sekvensen af omarrangeret IGHV genet. En fuld længde omordning kan kun vurderes, hvis 5' IGHV leder primere bruges, dermed begrunder de seneste henstillinger af ERIC for brug af leder primere27. Brugen af alternative primere, fører til forstærkning af ufuldstændig IGHV-IGHD-IGHJ-gen rearrangementer, passer ikke til IGHV gen mutationsmønstre analyse, og dermed frarådet kraftigt. Den eneste undtagelse vedrører sager, som gentagne gange giver negative resultater, når der IGHV leder primere og analyse af ny patient materiale er enten ikke muligt eller også gør ikke give resultater. Hvis brug af en anden patient prøve og/eller materiale (gDNA/cDNA) og forskellige primere sætter stadig fail til at producere en PCR produkt, mulige årsager kunne være at tumor celle byrden er for lavt, eller at lymfocytose skyldes ikke en CLL klon (i hvilket tilfælde den immunophenotype skal genevalueres). Primere, der anvendes til analysen skal altid fremgå af rapporten kliniske.
Som CLL skyldes ophobning af monoklonale B celler forsynet med den samme IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlejring, vil vurderingen for langt de fleste tilfælde clonality afsløre en unik monoklonale peak, dvs, en enkelt klon. I sjældne tilfælde kan dobbelt rearrangementer eller endda oligoklonale mønstre observeres35. I sådanne tilfælde gelelektroforese er ikke den foretrukne teknik til clonality vurdering og bør anvendes mere følsomme metoder såsom fragment analyse. Når clonality er blevet bekræftet, vedrører det sidste skridt før sekventering oprensning af PCR-produkt for at sikre, at sekvenser af høj kvalitet opnås. Endelig, værktøjet IMGT/V-QUEST er den ressource anbefalet for IG Sekvensanalyse af ERIC. Som IMGT databaser er konstant opdateret og rapportere resultater på en konsekvent og godt kommenteret måde, dette værktøj sikrer standardiseret analyse og letter sammenlignende analyse blandt forskellige kliniske eller akademiske faciliteter.
Immunogenetic analyse i CLL har prognostiske og, navnlig intelligent konsekvenser, robust analyse af IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlejring herunder tildelingen til store CLL stereotype delmængder, er ikke længere kun ønskeligt, men af afgørende betydning. Dette er særlig tydeligt i denne æra af roman therapeutics og potentiale, IG gen analyse er at guide behandling beslutninger5,21,22,23,36,37 ,38, som officielt fremgår af den seneste opdatering af NCI-sponsoreret retningslinjerne fra den internationale Workshop på CLL24. At sagde, strenge standarder er berettiget, især da bestemmelse af SHM status for clonotypic omarrangeret IGHV gen i CLL patienter er ikke en bagatel og indebærer en multi-step proces. Vigtigst af alt, visse eksperimenterende trin, især valget af primere, udbytte overlegne resultater når specifikke indstillinger og/eller tilgange overholdes, andre tekniske aspekter er indstillet til en vis grad af fleksibilitet, som materialevalg eller den metode til vurdering af clonality, at de fører til subtile forskelle, hvis nogen, for så vidt angår de endelige resultater.
I det sidste årti, ERIC har bestræbt sig på at fremme standardisering og harmonisering af forskellige metoder, der er relevante for CLL diagnosticering og prognosticering. Dette afspejles i de offentliggjorte anbefalinger og retningslinjer for immunogenetic analyse27,34, talrige organiserede pædagogiske værksteder og arrangementer, oprettelsen af en IG netværk samt et ekspertforum til diskutere og vejlede om IG gen ordne i rækkefølge fortolkning i CLL. Det overordnede mål med ERIC gennem disse handlinger er at fremme optimal klinisk forvaltning og patientpleje. Trods intense bestræbelser, denne opgave er langt fra afsluttet, og faktisk er blevet mere kompleks som følge af udviklingen af nye høj overførselshastighed sekventering sigter immun profilering. Ikke desto mindre, selv om stadig udfordringer forude, intensive bestræbelser for robust standardisering af IG-gen analyse i CLL fortsat og er i øjeblikket genstand for igangværende aktiviteter inden for ERIC.
Disclosures
Forfatterne har nogen relevante interessekonflikt at videregive.
Acknowledgments
Vi takker nuværende og tidligere medlemmer af vores forskningsgrupper, den IgCLL og ERIC, for deres engagement og begejstring i at studere immunogenetics i CLL. Vi vil også gerne anerkende et tillidsfuldt samarbejde mellem alle medlemmer af IMGT/CLL-DB-initiativet og i særdeleshed, Professor Marie-Paule Lefranc og Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Université Montpellier II, Montpellier, Frankrig, og IMGT, den internationale ImMunoGeneTics informationssystem, for deres enorme støtte og hjælpe med IG gen Sekvensanalyse. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra TRANSCAN-179 roman JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 og særlige Program molekylære klinisk onkologi-5 promille #9965), Milano, Italien; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rom, Italien; Svenske Kræftens Bekæmpelse, det svenske Forskningsråd, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Uppsala Universitet, Uppsala University Hospital og Lion's Cancer Research Foundation, Uppsala; ODYSSEUS-programmet, gennemføres i henhold til den "Action for the strategisk udvikling på the forskning og teknologiske sektor", finansieret af det operationelle program "Konkurrenceevne, iværksætteri og Innovation" (nationale strategiske referenceramme 2014-2020) og samfinansieret af Grækenland og Den Europæiske Union (den europæiske regionale Udviklingsfond).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
| BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
| BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
| Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
| Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
| RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
| Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
| Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
| Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
| Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
| Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
| Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
| QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
| 5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
| Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
| DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
| PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
| Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | - | PCR/Clonality assessment |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
| UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
| 10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
| DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
| Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
| Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
| GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
| Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
| Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
| Centrifuge | equipment | ||
| PCR machine | equipment | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, IARC publications. (2017).
- Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed? Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).
- Sutton, L. A., Rosenquist, R. The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Cancer Biology. , (2015).
- Mina, A., et al. Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet? Blood Reviews. , (2017).
- Sutton, L. A., et al. Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification. Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).
- Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).
- Burger, J. A., Chiorazzi, N. B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).
- Packham, G., et al. The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy. Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).
- Messmer, B. T., et al. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).
- Stamatopoulos, K., et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 109 (1), 259-270 (2007).
- Agathangelidis, A., et al. Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies. Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).
- Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).
- Baliakas, P., et al. Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study. The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).
- Gounari, M., et al. Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8. Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).
- Ntoufa, S., et al. B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4. Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).
- Mansouri, L., et al. Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).
- Navrkalova, V., et al. ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres. Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).
- Rossi, D., et al. Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).
- Sutton, L. A., et al. Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors. Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).
- Fischer, K., et al. Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial. Blood. 127 (2), 208-215 (2016).
- Rossi, D., et al. Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).
- Thompson, P. A., et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 127 (3), 303-309 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia. Blood. , (2018).
- van Dongen, J. J., et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).
- Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire. Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).
- Rosenquist, R., et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).
- Linke, B., et al. Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes. Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).
- Gonzalez, M., et al. Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies. Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).
- Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).
- Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 20, Suppl 1. i379-i385 (2004).
- Bystry, V., et al. ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy. Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).
- Belessi, C. J., et al. IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: "CLL-biased" deletions in a subset of cases with stereotyped receptors. European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).
- Langerak, A. W., et al. Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).
- Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL. Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).
- Farooqui, M. Z., et al. Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial. The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).
- Furman, R. R., et al. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).
- Burger, J. A., et al. Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).
