Her presenterer vi en protokoll som detaljer de tekniske aspektene og viktige krav for å sikre robust IG genet sekvens analyse hos pasienter med kronisk lymfatisk leukemi (CLL), basert på erfaring av europeisk forskning initiativ på CLL (ERIC).
Under B celle modning, den komplekse prosessen med immunglobulin (IG) gen V (D) J rekombinasjon kombinert med somatisk hypermutation (SHM) gir opphav til en unik DNA sekvens innenfor hver B celle. Siden B-cell malignancies skyldes klonal ekspansjon av en enkelt celle, representerer IG gener en unik molekylær signatur felles til alle ondartede celler i en individuell pasient; Dermed kan IG genet rearrangements brukes som klonal markører. I tillegg et viktig identifikator for klonal, kan IG genet sekvensen fungere som en molekylær tidslinje siden det er knyttet til bestemte utviklingsstadier, og derfor gjenspeiler historien til B-cellen i neoplastic transformasjonen. Videre for visse malignitet, spesielt kronisk lymfatisk leukemi (CLL), IG genet sekvensen holder prognostiske og potensielt prediktiv evner. Når det er sagt, ekstrapolere meningsfull konklusjoner fra IG genet sekvens analyse ville være umulig hvis robust metoder og verktøy ikke var tilgjengelig for hjelp i sine analyser. Denne artikkelen, tegning på store opplevelsen av den europeiske TFI på CLL (ERIC), detaljer de tekniske aspektene og vesentlige krav nødvendig for å sikre pålitelig og reproduserbar IG genet sekvens analyse i CLL, en test som er nå anbefalt for alle CLL pasienter før behandling. Mer spesifikt, beskrives de ulike analytiske stadiene spenner fra identifisering av clonotypic IG genet omorganisering og fastsettelse av nukleotid sekvensen til nøyaktig klinisk tolkningen av IG genet sekvens data.
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL), den mest vanlige formen av leukemi hos voksne i vestlige land, er preget av klonal moden neoplastic B celler-1. Fra en klinisk perspektiv er sykdom kurset svært variabelt med noen pasienter opplever en aggressiv sykdom, som krever behandling tidlig etter diagnose, og ofte relapsing eller være gjenstridig å terapi. Dette er i sterk kontrast til en betydelig andel av pasienter (~ 30%) som presenterer med en lat sykdom, aldri krever behandling, og har en forventet levealder ligner på friske age samsvar individer2. Denne klinisk heterogenitet gjenspeiles i mangfoldet av molekylære forandringene i CLL pasienter som til slutt kjøre patogenesen og progresjon av denne sykdommen3.
Etablere en nøyaktig diagnose av CLL er vanligvis enkel, men de nevnte klinisk heterogeniteten kan hindre effektiv styring av CLL pasienter og understreker behovet for prognostiske og prediktiv indikatorer som kan hjelpe behandling beslutningstaking2. Tallrike studier har forsøkt å avgrense prognostication av CLL, kulminerte i en overflod av romanen kliniske og biologiske markører blir foreslått4. Mutational status clonotypic immunglobulin tunge variabel (IGHV) genet er en av de mest robuste prognostiske markørene i CLL, hovedsakelig på grunn av at (i) det er fortsatt stabil over tid og som sykdommen utvikler seg, og (ii) det er uavhengig av andre klinisk og biologiske5. At tross, svært få, om noen markører, inkludert IGHV mutational status, er brukt i klinisk rutine på diagnosetidspunktet.
Første rapporter på klinisk nytten av IG genet sekvenser i CLL dato så langt tilbake som 1999, da 2 uavhengige studier rapportert at pasienter med ingen eller en minimal somatisk hypermutation (SHM) belastning (unmutated CLL, U-CLL) har en dårligere prognose enn pasienter bærer et høyere SHM byrden (muterte CLL, M-CLL)6,7. Mer spesifikt, gruppen U-CLL besto av tilfeller skjuler clonotypic IGHV gener med få eller ingen SHM og dermed en høy prosent identitet til nærmeste germline IGHV genet (≥98%), mens M-CLL besto av tilfeller med høyere mutational Last (prosent identitet til den nærmeste germline IGHV gene < 98%). Siden disse tidlige studiene, har det blitt stadig demonstrert at U-CLL tilfeller viser en kortere tid-å-første behandling (TTFT) og total overlevelse (OS) sammenlignet med M-CLL.
I ettertid markert disse banebrytende studiene pivotal rollen som B-celle reseptor (BcR) IG i CLL pathobiology, dermed banet vei for omfattende forskning i CLL-microenvironmental vekselsvirkningene som, i sin tur førte til en mer omfattende forståelse av det biologiske mangfold i denne sykdommen8,9. Nyere studier har gitt ekstra støtte for betydningen av immunogenetic analyser i CLL ved å avsløre at enkeltsaker kan klyngen i undergrupper på grunn av deling (kvasi) identisk BcR IG gensekvenser, et fenomen som betegnes BcR IG stereotypy10 ,11,12,13. Samler bevis støtter ideen om at pasienter som er tilordnet samme stereotype delsett harbor lignende clinicobiological egenskapene som skiller dem klart fra andre CLL pasienter innenfor samme SHM kategori, men med forskjellige IG gensekvenser; Det har faktisk blitt rapportert at kategorisering av CLL pasienter basert på BcR IG stereotypy videre foredler bulk segregering av CLL pasienter i U-CLL eller M-CLL grupper14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Fra en klinisk perspektiv er det bemerkelsesverdig at SHM statusen clonotypic IGHV genet synes å korrelere med en bestemt respons til chemoimmunotherapy. I spesielt M-CLL pasienter behandlet med en kombinasjon av fludarabine/cyklofosfamid/rituximab (FCR), gullstandarden behandling for medisinsk passer CLL pasienter mangler TP53 gene feil, vist betydelig lenger progresjon overlevelse (PFS) og OS sammenlignet med U-CLL pasienter som fikk samme behandling21,22,23. Derfor identifikasjon av SHM status har blitt viktig spesielt for å bistå i terapeutisk behandling av CLL pasienter dvs. en prediktiv markør, i stedet for å vurdere kliniske løpet av den sykdom dvs. en prognostiske markør. Faktisk, etter den siste oppdateringen av NCI sponset retningslinjene fra International verkstedet på CLL, bør SHM status omlegge IGHV gener være bestemt i alle CLL tilfeller før behandling innvielsen i både generelle praksis og klinisk forsøk24. Videre, på grunn av den siste godkjenningen av ny behandling agenter og det økende antallet narkotika i prøvelser, SHM status IG molekylet kan spille en enda større rolle i terapeutisk behandling av pasienter med CLL i nær fremtid5.
Denne rapporten viser alle aspekter av IG genet sekvens analyse, begynner med å velge det aktuelle materialet og kulminerte med klinisk tolkningen av sekvensering resultatene. Grundig vurdering av disse trinnene er viktig i diagnostiske rutine for produksjon av pålitelige resultater og å sikre nøyaktige pasienten lagdeling i kliniske forsøk. Protokoller er beregnet til hjelp i harmonisering av IG genet sekvens analyse, slik at resultatene er sammenlignbare blant annet laboratorier.
Studiet av IG gener i CLL har vært avgjørende ikke bare for å gi en bedre forståelse til sykdom pathobiology, men også for å forbedre pasientens risiko lagdeling. Det er derfor viktig at flere trinn prosedyren av IG genet sekvens analyse og påfølgende tolkningen av sekvens dataene er utført på en standardisert måte. Tilgjengeligheten av egnet og tilstrekkelig pasienten materialet og tidspunkt for prøvetaking bør ikke påvirke muligheten til å utføre IG genet mutational analyse siden testen kan utføres på PB og enhver prøven med en høy CLL svulst celle teller. Separasjon av blod mononukleære celler med gradient separasjon metoder utføres rutinemessig i laboratorier, og som alltid, bør man være forsiktig når du legger til blod/RPMI løsningen til røret som inneholder til gradienten; denne oppgaven bør utføres på en langsom, mild måte å unngå å forstyrre graderingen og hindre tap av celler.
Etter celle separasjon pakkes nukleinsyrer. Både gDNA og cDNA er egnet for SHM analyse av clonotypic IGH omorganisering, men det er fordeler og ulemper for bruk av enten materiale. Laboratoriet arbeidsflyten går raskere når du bruker gDNA siden ikke motsatt transkripsjon må utføres før PCR forsterkning. Det sagt, bruker gDNA som substrater for PCR kan resultere i forsterkningen på både produktiv og unproductive rearrangements som igjen kan føre til ytterligere hands-on laboratoriearbeid, dvs. rensing eller gel excision av flere PCR-produkter og personlige sekvensering av alle rearrangements. Når du sammenligner gDNA og cDNA tilnærminger, sistnevnte må en omvendt transkripsjon trinn utføres før du fortsetter med PCR forsterkning. Men i dette tilfellet, for de fleste tilfeller bare produktiv IG rearrangements forsterket og deretter sekvensielt. Dermed er bare ett PCR produkt renset og sekvensert, resultater tolkningen er mer ukomplisert.
Effektiviteten av forsterkning avhenger i stor grad på kvaliteten på gDNA/cDNA, som bør vurderes en følsom kvantifisering metode og primerne utnyttet. Primere brukt er kritisk i hele analytiske prosedyren fordi nøyaktig bestemmelse av SHM nivået kan bare oppnås ved å forsterke hele sekvensen av omlegge IGHV genet. En full lengde omorganisering kan bare vurderes hvis du 5′ IGHV leder primere, dermed rettferdiggjøre siste anbefalingene av ERIC for bruk leder primere27. Bruk av alternative primere, fører til forsterkning av ufullstendig IGHV-IGHD-IGHJ gene rearrangements, passer ikke for IGHV gene mutational analyse, og derfor frarådet sterkt. Unntaket gjelder saker som gjentatte ganger gi negative resultater når IGHV leder primere brukes og analyse av nye pasienten materialet er enten ikke mulig eller også gjør ikke gir resultater. Hvis bruk av en annen pasient prøve og/eller materiale (gDNA/cDNA) og forskjellige primere setter fortsatt ikke produsere et PCR-produkt, mulige årsaker kan være at svulst celle byrden for lavt ikke eller at lymphocytosis på grunn av en CLL klone (da det immunophenotype bør vurderes på nytt). Primere brukt for analyse bør alltid være angitt i klinisk rapporten.
Som CLL resultater fra akkumulering av monoklonale B celler som bærer den samme IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering, for de aller fleste tilfeller clonality vil vurdering avdekke en unik monoklonale topp, dvs. en enkel klone. I sjeldne tilfeller kan dobbel rearrangements eller selv oligoclonal mønstre observeres35. I slike tilfeller gel geleelektroforese er ikke den foretrukne metoden for clonality vurdering og mer følsomme metoder som fragment analyse bør brukes. Når clonality har blitt bekreftet, gjelder det siste trinnet før sekvensering rensing av PCR produktet slik at sekvenser av høy kvalitet er oppnådd. Endelig er verktøyet IMGT/V-QUEST ressursen anbefalt IG sekvens analyse av ERIC. IMGT databasene er kontinuerlig oppdatert og rapportere resultater i en konsistent og godt kommentert måte, dette verktøyet sikrer standardisert analyse og forenkler komparativ analyse blant forskjellige kliniske eller akademiske fasiliteter.
Immunogenetic analyse i CLL har Prognostisk og, spesielt, prediktiv implikasjoner, robust analyse av IGHV-IGHD-IGHJ gene omorganisering inkludert oppdraget til store CLL stereotype delsett, er bare ikke lenger ønskelig, men viktig. Dette er spesielt tydelig i denne tid med romanen legemiddelselskap og potensialet som IG genet analyse guide behandling beslutninger5,21,22,23,36,37 ,38, som offisielt angitt med den siste oppdateringen av NCI sponset retningslinjene fra International verkstedet på CLL24. At sa, strenge standarder er berettiget, særlig ettersom fastsettelse av SHM statusen til clonotypic omorganisert IGHV gene i CLL pasienter er ikke en triviell sak og innebærer en flertrinnsprosess. Viktigere, enkelte eksperimentelle trinn, særlig valg av primere, gi bedre resultater når spesifikke alternativer og/eller tilnærminger følges, andre tekniske aspekter er mottakelig for noen grad av fleksibilitet, som materiale eller metode for å vurdere clonality, skyldes det faktum at de fører til små forskjeller, hvis noen, med hensyn til det endelige resultatet.
Det siste tiåret, har ERIC forsøkt å fremme standardisering og harmonisering av ulike relevant for CLL diagnostikk og prognostication. Dette gjenspeiles i publiserte anbefalinger og retningslinjer for immunogenetic analyse27,34, mange organisert pedagogiske verksteder og hendelser, etablering av en IG nettverk, samt en ekspert online forum til Diskuter og gi veiledning om IG genet sekvens tolkning i CLL. Det overordnede målet med ERIC gjennom disse handlingene er å fremme optimal klinisk forvaltning og pasient. Til tross for intens innsats, oppgaven er langt fra fullstendig, og faktisk blitt mer komplisert på grunn av utviklingen av romanen høy gjennomstrømming sekvensering rettet immun profilering. Likevel, selv om utfordringene vedvarer, intens innsats for robust standardisering av IG genet analyse i CLL fortsette og er fokus for pågående aktiviteter innen ERIC.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker nåværende og tidligere medlemmer av våre forskningsgrupper, IgCLL gruppe og ERIC, for deres engasjement og entusiasme i å studere immunogenetics i CLL. Vi ønsker også å erkjenne tillitsfullt samarbeid med alle medlemmene av IMGT/CLL-DB initiativ og, spesielt, Professor Marie-Paule Lefranc og Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d’Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Université Montpellier II, Montpellier, Frankrike, og IMGT, det internasjonale ImMunoGeneTics informasjonssystemet, for deres enorme støtte og hjelp med IG genet sekvens analyse. Dette arbeidet var støttes delvis av tilskudd fra TRANSCAN-179 ROMANEN JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (etterforsker Grant #20246 og spesielle Program molekylær Clinical onkologi-5 promille #9965), Milano, Italia; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Roma; Svenske Cancer Society, svenske Forskningsrådet, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Uppsala universitet, Uppsala universitetssykehus og løven Cancer Research Fundation, Uppsala; ODYSSEVS program, gjennomført under “Handling for den strategiske utviklingen på the forskning og teknologiske sektoren”, finansiert av operative programmet “Konkurranseevne, entreprenørskap og innovasjon” (NSRF 2014-2020) og co-finansiert av Hellas og Den europeiske unionen (EU regionaldepartementet Fund).
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | – | PCR/Clonality assessment |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
Centrifuge | equipment | ||
PCR machine | equipment | ||
Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |