Summary
TreadWheel 회전 모션을 사용 하 여 부드럽게 파리 타고 난, 부정적인 geotaxis을 이용 하 여 성인 초파리 melanogaster 에서 운동 유도. 대사 상태를 평가 하기 위해 운동 유전자, 섹스, 다이어트, 생리 및 분자 분석에 미치는 영향 등의 요소 사이의 상호 작용의 분석에 대 한 수 있습니다.
Abstract
복잡 한 대사 질환의 발병 률 증가 열 량 섭취 량 및 낮춘된 활동 레벨의 라이프 스타일을 향해 광범위 한 전환의 결과로 증가 했다. 이러한 multifactorial 질병 유전자, 환경, 그리고 행동 요인의 조합에서 발생 한다. 하나 같은 복잡 한 질병은 변화 증후군 (뉴욕 메츠), 대사 장애, 고혈압, 혈당, 복 부 비만 등의 클러스터입니다. 운동과 식이 중재는 비만 그 이후의 대사 질환을 완화 하기 위해 의사에 의해 권장 기본 치료법입니다. 운동 개입, 특히 에어로빅 간격 훈련, 유형 2 당뇨병 Mellitus (T2DM), 심장 혈관 질병 (CVD), 및 다른 조건에 대 한 일반적인 위험 요소에 유리한 변화를 자극. 증거의 유입과 함께 치료 효과 운동 설명 대사 건강, 실험에서 운동 효과 평가 하기 위한 유용한 도구를 제공 하는 모델 운동 제어 설정에서 시스템 구축에 있다. 초파리 melanogaster 운동 개입에 기인 하는 생리 및 분자 변화 조사를 위한 훌륭한 도구입니다. 파리 짧은 수명이 있고 인 간에 비해 영양소 물질 대사로 변화 시키기의 유사한 기계 장치. 초파리에 있는 운동 유도, 우리 라는 TreadWheel, 파리의 타고 난, 부정적인 geotaxis 경향이 부드럽게 등반 유도 이용 하는 기계를 개발 했다. 연구원을 대사 건강에 운동의 효과 기본 환경에 의해 유전자 상호 작용을 이해 하기 유전자 다양 한의 큰 동료에 실험을 수행할 수 있습니다.
Introduction
유년기와 성인 비만 전염병 높은 칼로리 다이어트를 소비 하 고 심각한 장기 결과, 인슐린 저항, 관절염, 만성 염증 등으로 이어질 수 있는 시간의 연장된 기간 동안 유휴 상태로 유지 하는 문화권에서 성장 하 고 있다 1 , 2 , 3 , 4. 칼로리 섭취 량에 지방과 당 분은 주로 앉아있는 생활5의 높은 소비에 지출 성장 불균형으로 인해 상승 계속이 무질서의 보급. 대응 하 게,이 에너지 불균형 경우 유형 2 당뇨병 Mellitus (T2DM) 및 심장 혈관 질병 (CVD)5의 증가를 주도하 고 있다. 개인 변화 증후군 (뉴욕 메츠), 그 증상은 복 부 비만 dyslipidemia2장애 진단 되었습니다 두 질환을 개발의 높은 위험이 있습니다. 메츠는 유전자 형 및 다이어트 등 다양 한 환경 요인 사이의 복잡 한 상호 작용에 의해 형성 되 고 운동6. 따라서,이 복잡 한 질병의 근본적인 메커니즘의 완전 한 이해를 얻으려면, 이러한 요인을 모두 고려해 야 합니다.
그것에 올 때 메츠 퇴치, 의사 먼저 먹고 건강 한, 균형 잡힌 식이 요법과 신체 활동2,,78포함 하는 라이프 스타일 변화를 겪고 권장 합니다. 심한 경우와 함께 이러한 생활 습관의 변화3에만 약리학 및 외과 개입만 권장 있기 때문에 효과적인 약물은 제한 위장 수술은 비용이 많이 드는 하며 평생 의료 모니터링, ,,78. 동안 라이프 스타일 개입, 운동과 다이어트, 등의 생산 하 고, 장기적인 체중 감량 목표를 유지, 여부에 상관 없이 이러한 시정 조치 완전히 메츠와 관련 된 부정적인 효과 개량 해야 진학7, 8.
마우스 모델 년; 대사 질환에 운동의 효과 검사 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 운동 연구 메츠에 비행의 소개는 비교적 최근의 노력9,10,,1112이다. 파리 제공 운동 제어 된 실험실 설정에서 공부 하는 완벽 한 차량 때문에 그들은 쉽게 조작, 짧은 수명을, 유지, 저렴 하 고 에너지 관련 대사 경로 매우 초파리 사이 보존 인간13. D. melanogaster 게놈은 잘 특징 이다, 그리고 다양 한 유전학 도구 다양 한 genotypes 변조 수 있는 환경에 의해 유전자 상호 작용에 대 한 통찰력을 제공할 수 있는 초파리 에서 사용할 수 있는 organismal 건강14에 운동의 효과.
초파리 를 행사 하는 현재 방법 호출 파리의 타고 난, 부정적인 geotaxis 경향, 위쪽으로 올라, 그들의 인클로저11,12,15 내 성인 등반을 자극 하는 행동 본능 . 전력 타워, 파리, 운동을 자극 하는 방법은 체계적으로 수직 비행 인클로저를 제기 하 고 삭제 그들 다시 벤치 표면에 효과적으로 유리병의 바닥에 파리를 노크 따라서 그들의 본능적 인 부정적인 geotaxis 유도 12 , 16.이 기계를 사용 하 여 실시 하는 실험 했다 운동 T2DM, 증 착 등의 많은 나이-관련 질병에 대 한 강력한 보호 요소 이며, 건강 한 노화12,17,18 촉진 . 특히, 그들은 그 수 파리에서 나이 관련 이동성 감소의 발병을 줄일 수 및 심장 성능 등 여러 연령 관련 증상을 개선 운동과 스트레스 응답17,18시연. 그러나, 제어 파리 발생 하는 반복적인 방울의 힘 파리 부상 수 있습니다 제안에 영향을 미치는 이동성12기계 보다 더 높은 등반 점수를 보여주 타워에 배치 하지. 이 유도 하는 운동 이며 덜 강력한 물리적 외상 발생을 방지 하는 대체 방법을 전력 타워 프로토콜16에 유용, 보완 방법 될 것 이라고 제안 합니다.
초파리, 운동을 부드럽게 유도 하 우리 라는 TreadWheel (그림 1). 운동 기계 개발 (이제부터로 축약 TW) TreadWheel 회전 모션 끊임없이 재정의 중력 상단의 튜브, 차례 차례로, 파리에서 등반을 자극 하 여 파리 타고 난, 부정적인 geotaxis 추세를 트리거합니다. 다른 방법과 달리는 TW의 회전 움직임은 본질적으로 부드러운는 발생할 결과 영향을 줄 수 있는 추가적인 스트레스의 수를 최소화 한다. 따라서, 기계 연구원 대사 건강 (그림 2), 노화, 수 면, 그리고 다른 많은 주제11에 운동의 효과 연구 하면 스트레스를 유도 하지 않고 파리의 많은 수에 있는 운동 유도 하는 수단을 제공 합니다.
우리의 방법은 역 피라미드, 크게 통합 하는 일부 지구력 훈련 (AIT) 에어로빅 간격의 간격 훈련 프로토콜 훈련 운동. 표준 AIT 정권이 점차 증가 지구력 증진을 5 일 동안 각 간격의 기간에이 프로토콜에서 변경 됩니다. AIT 다른 개입 방법을 기준으로 메츠를 방지에 특히 유용 했습니다 고 반전 연속 적당 한 운동19,20보다 대사 증후군의 일반적인 위험 요소에 더 효과적 이었습니다. 그러나,는 전력 타워에 상대적인 TW의 단점은 파리 더 빨리 회전 동작에 길 들, 따라서 타고 난 경향이 파리 사이 길 들에서 운동의 장점의 해석을 복잡 하 게 수 있습니다. 11 와타나베와 수수께끼15 와 그들의 보완 제21이 제한에 우아한 해결책을 설명 합니다.
Protocol
1. TreadWheel 설치 및 운영
참고: 기계 건설 운동 TW에 설계도 대 한 보충 그림 1 을 참조 하십시오. 부품 재료의 테이블에에서 나열 됩니다. 어구 "TW", "TreadWheel", "운동 기계", 및 "기계"는 프로토콜을 통해 같은 의미로 사용 됩니다.
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보정 되도록 전체 회전 기간 15 전원 스위치를 사용 하 여 모터 s (4 rpm). 회전 팔에 연결 된 보안된 클램프로 플라이 튜브를 배치 하기 전에 기계 회전 속도 보정.
- 표준 초시계와 일시적으로 작은 페인트 브러시 회전 괄호 중 하나를 만지고 그냥 브러쉬 모터 커버 테이프 등 컴퓨터에 연결 된 부동 개체를 사용 하 여 속도 조정 합니다. 회전 수를 기준점으로 부동 개체를 사용 하 여 1 분에 시간과 15 s 회전 기간 (4 rpm)를 달성 하기 위해 속도 조정.
2. 비행 수집 및 유지 보수
참고: 모든 파리 50% 습도 및 아래에서 설명 하는 벤치탑 조작 사이 12 h 명암 주기 25 ° C 인큐베이터에 유지 됩니다. 파리는 다른 설명이 없는 한 표준 cornmeal 당 밀 랩 다이어트를 먹인 다.
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애벌레로 부 화는 달걀을 수집을 애플 주스 한 접시, 접시, 당 효 모 반죽과 6 온스 플라스틱 병의 한 방울을 사용 하 여 관심사의 각 유전자 형에 대 한 누워 챔버를 준비 합니다.
- 준비 애플 주스 한 천 배지, 3% 천 35 m m x 10 m m 접시 ¾-전체 채우기가 사과 주스에 녹아. 사용까지 냉장고에 응고 접시를 저장.
- 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서가 활성 건조 효 모 누 룩의 각 그램에 물 2 mL의 비에 증류수 결합 되어 있습니다. 케 찹 유리 교 반 막대를 사용 하 여 일관성 붙여넣기를 만드는 물으로 혼합 효 모. 원하는 일관성을 달성 하기 위해 필요에 따라 누 룩과 물 비율을 조정 합니다.
- 사용 하는 사이 냉장고에서 효 모 반죽을 저장 합니다. 튜브 캡 드 가스 처리 있도록 느슨한 유지.
- 날카로운 바늘을 사용 하 여 또는 6 온스에 작은 구멍을 펀치 칼 누워 챔버에 대 한 환기 구멍으로 광장 아래쪽 병 (폴 리 프로필 렌).
- 각 애플 주스 한 천 격판덮개에 효 모 반죽 (직경에서 3 m m)의 작은 자리를 줘 봐.
- 6 온스 병 및 사과 주스 한 천 배지와 모자 병에 원하는 유전자 형의 성인 파리를 배치 합니다. 고무 밴드와 함께 병에 접시를 보호 합니다. 반전, 그리고 성인 계란을 낳을 수 있도록 인큐베이터에 배치.
- 애플 주스 한 천 배지는 누워 실에는 하루에 두 번 (아침과 저녁) 변경 합니다. 첫 번째 수 있도록 또 다른 12-24 h에 대 한 인큐베이터에서 두고 사용 접시 애벌레 부 화를 탈피 하 고
- 수집 처음에 얇은 붓 또는 컬렉션 선택 (유연한 얇은 바늘 핸들에 연결 된)를 사용 하 여 애벌레 탈피. 장소 50 처음 개발을 원하는 실험 음식 유형 및 완전 변성 동안 인큐베이터 (그림 2A)에 음식 유리병에 특정 유전자 형의 애벌레 탈피.
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성인 운동 치료 (그림 2A)에 대 한 수집 합니다.
- Pupation에 작은, 젖은 붓으로 번데기를 수집 하 고 빈 튜브 일수로 성인 파리 애벌레 다이어트에 노출 되지 않도록 하려면 이전에.
- Eclose 그들은 표준 실험실 다이어트 음식 튜브를 성인 파리를 전송 합니다. 일수로, 후 1 ~ 5 일 파리 섹스에 따라 구분 합니다.
- 성인의 수집 된 각 실험에 지정 반 고 제어 그룹. 병 당 50 파리의 농도에서 표준 랩 다이어트의 튜브에 파리를 유지 합니다.
- 전송 성인 신선한 음식 튜브를 매 2 일 운동을 하는 동안 붙어 점점에서 그들을 방지 하기 위해. 파리를 도입 하기 전에 즉시 새로운 음식에 보충 라이브 누 룩의 몇 가지 곡물을 추가 합니다.
참고: 그것은 살아있는 효 모 보충 없이 파리를 유지 수, 우리는 발견 성인 파리 최고의 보완 수행. 살아있는 효 모 보충 연구자의 실험 목표에 맞게 수정할 수 있는 변수 이다.
3. 운동 프로토콜
- 운동 (1 일)의 첫 날, 푸시 유리병 음식과 운동 튜브 (그림 1C)에 플러그 사이 공간 제어 튜브에 1 cm와 6 cm의 공간을 떠나 플러그.
참고: 제어 튜브 운동 기계에 이동 하는 파리에 대 한 공간이 제한 됩니다 고 따라서 파리에 참여 합니다 많은 운동 튜브에 보다 덜 운동. - 튜브 클램프, 놓고 그 후 파리에 게 10 분 (그림 1B) 기계에 적응.
참고: 일반적으로 이동 하는 벤치탑에 하기 파리 6 cm 간격 (유리병) 운동 기계에 인접 한 유지 하는 대체 컨트롤이입니다. "TreadWheel에 1 cm" 및 "6 cm 벤치탑에" 컨트롤 운동의 비슷한 결과11을발견 되었습니다. -
모두 제어 치료를 운동 회전 기계에 일정 한 실내 온도에서 회전 및 나머지 (그림 1D)의 복싱 교류 주당 5 일 연속에 대 한 있습니다.
참고: 일정 한 온도 활동 수준에 온도의 혼란 효과 피하기 위해 필요 합니다. 온도 조작 연구, 운동 훈련 기간 동안 온도 처리를 수정 하는 인큐베이터 안에 TW를 놓습니다.- 주 1 일 운동의 4 15 분 복싱에 대 한 컴퓨터를 실행 합니다. 이러한 관찰 5 분 휴식 기간으로 대체.
- 다음 일 기존 운동 복싱 중 운동 5 분을 추가 합니다. 예를 들어 하루 2, 첫 번째 운동 시 합 20 분 길이, 만들지만 긴 15 분 복싱의 나머지를 유지.
- 3 일에 첫 두 복싱 동안 및 15 분 20 분 파리 다음 두 복싱에 대 한 운동.
- 4 일에 15 분 긴 해야 최종 시 합을 제외 하 고 모든 20 분 운동 복싱을 사용 합니다.
- 5 일째에 모든 운동 복싱 20 분 오래 유지.
참고: 나머지 기간 동안, 파리를 포함 하는 튜브 있어야는 TW에 안전 하 게 클램프 합니다. 이 기간 동안 튜브의 방향 모든 파리에 의해 경험 중력 같은 방향에서 올 것입니다 때문에 무관 하다.
- 특정된 날짜에 대 한 운동 치료를 완료 한 후 그들의 정상적인 위치로 식품 유리병 플러그를 반환 하 고 날까지 그들의 부 화기에 파리를 반환 합니다.
- 전체 운동 정권의 완료 anesthetize 후 파리 표준을 사용 하 여 CO2 마 취 방법을 비행. 다음 전송 새로운 음식 튜브 또는 microcentrifuge 튜브의 phenotypic 특성의 평가 대 한 이동합니다.
참고: 예를 들어 고기 등반 능력 (식품 유리병), 트리 글리세라이드 스토리지 (microcentrifuge 튜브), 또는 유전자 발현 (microcentrifuge 튜브) 포함. 프로토콜 수행 평가 따라 적절 하 게 저장 하는 샘플 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 살아있는 파리를 포함 분석 phenotypic 분석 결과의 특정 목표에 따라 신속 하 게 실시 해야 합니다.
4. 등반 평가
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나머지 운동 프로토콜의 완료 후의 어느 날, 후 빠른 반복 부정적인 geotaxis (반지)를 사용 하 여 성능을 등반 일반 비행 테스트-22시험의 부정적인 geotaxis 등반 처럼.
- 빈 유리병에 그룹 10 파리의 장소 CO2 마 취를 사용 하 여 (또는 경우 이미 정렬 음식 튜브에서 직접 도청) 파리 탈출 하지 못하도록 파라핀 필름으로 밀봉. 새로운 병에 적응 파리 적어도 10 분에 게. 이상의 팁을에서 병을 방지 하기 위해 추가 면적을 제공 하는 유리병의 바닥에 ~ 5 cm 직경 두꺼운 용지 원 테이프.
참고: 병 마 개 사용할 수 없습니다 그들은 높이 결정 하는 데 사용 하는 유리병의 일부를 방해 하기 때문에 올랐다. - 내장 타이머 (타이머 카메라 응용 프로그램 작동 잘와 스마트폰) 탑재, 고정 된 카메라의 전체 보기에 튜브 1 cm × 1 cm 그리드 앞 20cm를 배치 합니다.
- 유리병의 바닥 아래로 모든 파리를 노크 카운터 3 번에 부드럽게 튜브를 누릅니다. 3 시간 유리병, 도청 후 즉시 4 s 카메라 타이머 각 비행에 의해 상승 하는 높이 확인 하려면 이미지 캡처를 시작 합니다.
참고: 도청 할 수 일관 된 강렬에 및 도청으로 인해 파리의 응답에 있는 변화를 최소화 하기 위해 각 운동 제어 반면에서 같은 연구원에 의해. - 실험, 병 당 3 개의 시험의 총 생산 사이 적어도 1 분 나머지와 함께 두 번, 4.1.3 단계를 반복 합니다.
- 빈 유리병에 그룹 10 파리의 장소 CO2 마 취를 사용 하 여 (또는 경우 이미 정렬 음식 튜브에서 직접 도청) 파리 탈출 하지 못하도록 파라핀 필름으로 밀봉. 새로운 병에 적응 파리 적어도 10 분에 게. 이상의 팁을에서 병을 방지 하기 위해 추가 면적을 제공 하는 유리병의 바닥에 ~ 5 cm 직경 두꺼운 용지 원 테이프.
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등산 분석 결과 완료 된 후에 즉시 다른 분석에 대 한 파리를 보존, 플래시 액체 질소에 침수에 의해 파리를 동결.
- 얕은, 오픈 topped dewar 플라스 크를 사용 하 여 액체 질소로 ~ 5 cm의 깊이에 가득합니다.
- 전송 파리 dewar 플라스 크의 CO2 마 취 그리고 장소 튜브를 사용 하 여 작은 microcentrifuge 관에 액체 질소로 가득 합니다. 또는, CO2의 제거를 요구 하는 미래 분석 스냅 동결 파리 그들의 등반 튜브에서 직접 하단 액체 질소에 빠져들은 다음에 냉동된 파리를 전송 하는 동안 그들의 유리병의 바닥에 파리를 부드럽게 눌러 microcentrifuge 튜브 집게를 사용 하 여입니다.
참고: 액체 질소 저온 이며 적절 한 보호 장비 및 객실 환기만 사용 해야 합니다.
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ImageJ23 멀티 포인트 선택 도구를 사용 하 여 프로세스 이미지.
- ImageJ 내 처리에 대 한 이미지를 엽니다.
- 각 개별 비행에 의해 상승 하는 거리를 계산 하기 위해 배경 그리드 종이에 따라 1 cm 규모를 설정 합니다. "선 도구" 도구 모음에서 추적 1 cm2 광장의 한쪽에 배경 그리드 종이에서 사용 합니다. "분석" 탭에서 클릭 하 고 "비율 설정"을 선택 합니다. '1.00' 및 "cm'," 길이의 단위 "확인 되었는지"글로벌"," 알려진 거리 "를 설정 하 고"확인 "을 클릭 합니다.
- 도구 모음에서 "멀티 포인트 선택" 아이콘을 선택 하 고 이미지에서 유리병의 하단에 확대. 유리병의 가장 낮은 부분에 클릭 하 여 유리병의 맨으로 첫 번째 점을 설정 합니다.
- 데이터 요소 표시를 유리병에 각 비행의 중앙에 클릭 하십시오. 유리병 11 포인트, 유리병의 바닥을 표시 한 고 각 비행에 대 한 하나는 기록해 둡니다.
- "분석" 탭에서 클릭 하 고 "측정" 측정 된 값의 테이블을 생성을 선택 합니다. Csv 파일에서 테이블을 저장 합니다.
- 스프레드시트 프로그램에서 csv 파일을 열고 측정된 값 테이블에서 포인트 1에서 2-11 점의 y 값을 빼서 각 비행에 의해 상승 하는 정확한 거리를 계산 합니다.
- 각 이미지에 대 한 4.3.1 4.3.6 통해 단계를 반복 합니다.
5. 트리 글리세라이드 스토리지 분석 결과
참고: 샘플, 표준, 글리세롤 표준 솔루션 및 triglycerol 작업 솔루션 분석 결과 전체 사용 프로토콜의 동안 얼음에 보관 해야 하 고 때 사용 중인 냉장고에 저장 한다.
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글리세롤 표준 솔루션을 사용 하 여 표준 준비.
- B. 표시 된 microcentrifuge 튜브를 균질 버퍼의 1000 µ L을 추가 하 여 빈 (B) 만들기
- 글리세롤 표준 솔루션의 1000 µ L s 1 라는 microcentrifuge 튜브에 추가 하 여 표준 1 (S1), 잘, 당 2.5 mg/mL를 확인 합니다.
- 표준 2 (S2), 잘, 당 1.25 mg/mL 500 µ L 글리세롤 표준 솔루션의 diH2O s 2 라고 표시 된 microcentrifuge 관에서의 500 µ L을 추가 하 여 확인 합니다.
- 글리세롤 표준 솔루션의 250 µ L diH2O s 3 라는 microcentrifuge 튜브에 750 µ L을 추가 하 여 표준 3 (S3), 잘, 당 0.625 mg/mL를 확인 합니다.
- S4 표시 microcentrifuge 튜브에 diH20의 875 µ L을 125 µ L의 글리세롤 표준 솔루션을 추가 하 여 표준 4 (S4), 잘, 당 0.3125 mg/mL를 확인 합니다.
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혈 청 트리 글리세라이드 결정 키트에서 triglycerol 작업 솔루션을 준비 합니다.
- 키트에서 무료 글 리세 린 시 약을 diH2O의 40 mL를 추가 하 고 병을 반전 하 여 혼합.
- 키트에서 트리 글리세라이드 솔루션 diH2O 10 mL을 추가 하 고 병을 반전 하 여 혼합.
- 글리세롤 시 약 및 트리 글리세라이드 솔루션을 결합 하 고 반전 triglycerol 작업 솔루션을 준비 하 여 혼합.
참고: triglycerol 작업 솔루션 60 일 동안 좋은 이며 아래 프로토콜을 사용 하 여 키트 당 4 96 잘 접시 분석을 완료할 수 있습니다. 사용 된 볼륨 96 잘 접시 형식에 사용 하기 위해 공식 혈 청 트리 글리세라이드 결정 키트에서 비례 축소 됩니다.
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신중 하 게 각 표준의 5 µ L 96 잘 평면 바닥, 3 중 (또는 quadruplicate는 빈에 대 한) 명확한 microplate에 pipetting으로 빈 및 표준 확인 합니다.
- 각 잘을 포함 하는 표준에 Triglycerol 작업 솔루션의 정확 하 게 125 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 반응 솔루션을 허용 합니다.
- 분 광 광도 계에 96 잘 접시를 놓고 540에서 흡 광도 읽고 nm. 흡 광도 측정을 사용 하 여 표준 곡선을 작성 하 고 R2 값을 계산 하 여 표준의 정확도 확인 합니다. 기준에 대 한 R2 를 사용 하 여 0.98 보다 작으면, 표준에 더 신중 하 게 준비 다시.
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트리 글리세라이드 저장14 냉동 10를 포함 하는 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 분석 결과의 1 일 시작 각 난다.
참고: 반복 또는 다중 채널 피 펫 해야 결코 사용이 단계에서 분석 결과에서 사용 하는 각 시 약의 양을 아주 정확 하 고 재현 가능한 결과 얻으려면 일관 해야 하기 때문에. 우리의 경험에서는, 반복 및 다중 채널 펫 필요가 없습니다이 정도의 정확성과 일관성. 단일 채널 피 펫에서 각 약 수를 시각적으로 품질 관리에 대 한 실험에 의해 확인 될 수 있다 하 고 어떤 단일 채널 피 펫 전용 편견 같은 정도로 모든 샘플에서 경험이 될 것입니다.- KH2포40.272 g, 0.5 M EDTA의 400 µ L 199.6 mL diH2유리병에 O의 결합 하 여 균질 버퍼의 200 mL 재고를 준비 합니다.
- 10 성인 등산 분석 결과 후 동결을 포함 하는 40 microcentrifuge 튜브의 각 균질 버퍼의 정확히 100 µ L를 추가 합니다. 다음, 30에 대 한 샘플을 원심에서 18000 g s.
- 갈기 전동된 그 라인 더와 유 봉 (또는 다른 형태의 조직 균질) 밀키 솔루션 준비 하를 사용 하 여 이동 합니다. 각 샘플에 사용 되는 신선한 유 봉 다는 것을 확인 하십시오. 그런 다음, 원심 18000 g에서 2 분에 대 한 샘플.
- 새로운 microcentrifuge 튜브로만 각 관에서 표면에 뜨는 액체의 정상 75 µ L 플라스틱. 펠 릿에서 아무 비행 비트 이상의 전송 됩니다 확인 하십시오. 냉장고에 하룻밤 새 튜브를 배치 합니다.
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냉장고에서 하루 1 샘플을 제거 하 여 트리 글리세라이드 프로토콜의 주 2를 시작 합니다.
참고: 단계 5.5 5.4로 같은 날 수행 수 있습니다 하지만 우리는 냉장고에 하룻밤 후 더 강력한 수 트리 글리세라이드 농도 대 한 신호를 발견. 그러나, 단계 5.4와 5.5 사이 시간 36 h를 넘지 말아야 한다.- (선택 사항) 10 s와 피 펫에 대 한 표면에 뜨는 액체와 함께 첫 번째 튜브 소용돌이 깨끗 한 microcentrifuge 관으로 5 µ L. 새로운 microcentrifuge 튜브에 0.15 M NaCl의 95 µ L를 추가 합니다. 원하는 경우 이러한 하위 단백질의 분석 결과 나중에-20 ° C 냉동 실에 저장 합니다.
참고: 이러한 샘플 추가 NaCl 솔루션 상쾌한의 단백질 콘텐츠 연구원의 선호 분석 결과 사용 하 여 결정 하 사용할 수 있습니다. 우리24브래드 메서드 사용합니다. 단백질 콘텐츠 표준화 중성 지방 콘텐츠를 측정 하는 방법입니다 하지만 연구원 또한 운동 이후 이러한 비율을 해석에 신중 해야 한다 고 다이어트도 단백질 저장에 영향을 미칠 수 있습니다. - 원래 표면에 뜨는 튜브에 대 한 소용돌이 10 s, 다음 피 펫 5 µ L 96 잘 microplate 기술 생산의 두 개의 별도 우물으로 표면에 뜨는 액체와 함께 첫 번째 튜브 복제 합니다. 웰 스는 각 샘플에 대 한 사용 됩니다 참고를 해야 합니다. 39 다른 튜브에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 미 판의 4 개의 우물에 빈의 정확히 5 µ L 플라스틱 그리고 나머지 우물 3 중에서 각 표준의 정확히 5 µ L 플라스틱.
- 각 음을 정확히 125 µ L triglycerol 작업 솔루션을 추가 하 고 30 분 동안 반응 솔루션을 허용.
- 분 광 광도 계에 96 잘 접시를 놓고 540에서 흡 광도 읽고 nm.
- 기준에서 계산 표준 곡선을 사용 하 여 농도 (mg/mL)으로 흡 광도 값을 변환 합니다.
- (선택 사항) 10 s와 피 펫에 대 한 표면에 뜨는 액체와 함께 첫 번째 튜브 소용돌이 깨끗 한 microcentrifuge 관으로 5 µ L. 새로운 microcentrifuge 튜브에 0.15 M NaCl의 95 µ L를 추가 합니다. 원하는 경우 이러한 하위 단백질의 분석 결과 나중에-20 ° C 냉동 실에 저장 합니다.
Representative Results
우리는 개인의 전반적인 신진 대사 건강에 영향을 주는 요소 식별에 특히 관심이 다입니다. 그것은 이전 상호 작용 유전자 형에 의해 다이어트 대사 특성14에 인구 수준의 변화에 실질적으로 기여 발견 되었다. 즉, 각 유전자는 독특하고 복잡 한 방식으로 환경 차이에 응답. 운동 포함 하도록 유전자 형에 의해 환경 효과에 우리의 작업을 확장, 우리 개발 TreadWheel, genotypes 에어로빅 간격 훈련 (AIT)는 높은 처리량 방법의 많은 노출 수입니다.
트리 글리세라이드 저장 측정 여부는 TW에 운동 영향 변화 특성을 설정 하기 위해 오 레 곤-R (OreR)와 y1에 w1 파리, 일반적인 wildtype 파리 (그림 2B-C), 그리고 파리에 대 한 해당 값을 정규화 단백질 농도, 멘데스 외 에 원래 보고 11. 우리 다변량 분산 분석 (MANOVA) 유전자 형, 섹스, 운동 치료 (와 그들의 상호 작용), 그리고 시간 복제 등 식품 실험 블록 효과 유리병 및 발견 했습니다 중요 한 회계 데이터 분석 운동에 의해 유전자 상호 작용 (p = 0.0017) 트리 글리세라이드 저장소에 영향을 미치는. 남성 및 여성 (p < 0.0001) 보다 더 많은 트리 글리세라이드를 저장 하는 남성과 여성 사이 중요 한 성적 동종이 형 효과 했다. 우리는 여성, 운동된 파리 하기 들 보다 상당히 낮은 triglyceride 레벨 했다 보았다 (그림 2B, p < 0.0001). 남성, 오 레 곤-R에서 트리 글리세라이드 스토리지에서 감소 운동 하는 동안 (컨트롤)에 비교 하 여 파리 아니었다 통계적, triglyceride 스토리지에 상당한 차이 사이 두 개의 별도 라인 (그림 관찰 되었다 2C, p < 0.0001). 그 동안 표준화 트리 글리세라이드 농도 단백질 농도 대 한 통찰력을 제공 합니다 전체 비행 신체에 구성 비율, 파리의 다른 그룹 사이에서 직접 중성 지방 또는 단백질 농도의 비교도 제공할 수 있습니다 note 이 고기에 운동의 효과 대 한 특정 정보 개별적으로.
변수 같은 성인 운동, 섹스, triglyceride 저장소에 영향을 미칠 유전자 형 표시 됩니다 때문에, 그것은이 요인 또한 영향을 다른 고기 및 다이어트와 상호 작용 하는으로 예상 했다. 우리는 1 주일 (그림 2A)에 대 한 애벌레는 대표적인 wildtype 초파리 유전자 참조 패널 라인 (DGRP 153)25 높은 지방 또는 정상적인 다이어트 및 성인 파리에서 유도 된 운동에서에서 발생합니다. 그 후, 우리는 등반 능력을 측정 하는 고리 모양의 부정적인 geotaxis 분석 결과 수행. 사용 하는 등반 시험 표준 반지 분석 결과;에서 달랐다 링 장치 대신 구멍을 덮고 파라핀 영화와 튜브는 분석 결과 중 집으로 날아 사용 되었다. 원래 반지 분석 결과, 유리병의 바닥에 파리 고, 사진을 복용 사이의 시간 등의 다른 측면은 유지22.
모든 치료 시간 복제 및 치료 당 59 개별 파리의 최소 3 개의 별도 시간을 반복 했다. 다이어트, 유전자 형, 섹스 MANOVA 고려 하 여 데이터 분석, 시간 복제, 분석 결과 유리병, 유리병 분석 결과 복제 실험 블록 효과 뿐만 아니라 치료 (와 그들의 상호 작용), 운동. 우리 운동된 여성 상당히 높은 상승 발견 (p < 0.005) 어떤 다른 여성 치료 (그림 2D) 보다 높은 지방 다이어트에 reared 때. 남성, 그것은 운동만 남성 정상적인 규정식에 제기 했다 고 그는 (그림 2E) 중요 한 변화가 나타났다 고 지방 규정식에 제기 등반 향상을 보였다. 우리는 또한 중요 한 성적으로 동종이 형 효과 발견 (p < 0.0001) 남성 여성 보다 높은 등반으로 등반. 정상적인 식사를 소비 하는 여성을 위한 DGRP 153 선 (그림 2D)에서 여성에 대 한 운동 다음 성능 등반에 감소의 놀라운 결과 (p < 0.0001)은 어떻게이 유형의 운동 되지 않을 수 있습니다의 예는 모든 genotypes에 대 한 균일 하 게 긍정적인 개입 및 다른 환경 요인에 파견 될 수 있습니다. 멘데스 외 에 11, 선에서 4 개의 다른 유전자는 정상에 제기 되었습니다 데 후 그들의 등반 성능에 대 한 테스트는 여성 다이어트 운동 훈련 모든 보였다 향상 된 등반 능력. 이 DGRP 153에서 관찰 하는 응답은 유전자 형 및 TW 운동 치료의 일반 속성이 아닌 것을 제안 합니다. 섹스, 다이어트, 그리고 운동 치료 그룹에 걸쳐 응답에서 가변성 나타냅니다 라인의 등반 능력에 영향을 미치는 중요 한 섹스-의해-다이어트-의해-운동 상호 작용 (p < 0.0001).
함께 찍은, 결과 성인 비행의 대사 건강에 운동의 충격의 섹스, 유전자 형, 애벌레 다이어트의 기능 수 나타냅니다. Phenotypic 변화 관찰에 유전자 형, 환경 변수 (예:다이어트, 운동), 그리고 섹스도 관찰 되었습니다 다른 연구11,12,,1415에. 따라서, TW와 초파리 대사 건강을 형성 하는 유전과 환경 요인을 명료 하 게 하는 강력한 전략을 수 있습니다.
그림 1 : The TreadWheel 운동 기계. (A) 기계 48 병을 보유 하 고 조정 가능한 속도 기능이. 여기 실험 4 rpm에서 수행 했다. (B) 개별 음식 튜브 실험 파리를 포함 하는 회전 차축에 연결 하는 괄호에 찍은 했다. (C) 유리병 사이의 거리 플러그 및 음식 운동 튜브 및 제어 튜브에 대 한 1 c m 6 c m 이었다. 튜브 운동에 대 한 컴퓨터에 배치 했다. (D) 5 일 역 피라미드 운동 정권 성인 파리 행사에 사용 되었다. 매일, 추가 5 분에 추가 되었습니다는 모델 지구력, 운동 강도를 점차적으로, 진입로 운동 복싱 중 하나 간격 훈련. 이 그림 멘데스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 시각적 방법 및 대표 결과. (A) 애벌레 다이어트 및 성인 운동 상호 작용 효과 테스트 하기 위한 방법. 애벌레는 높은 지방 또는 일반 실험실 다이어트에 제기 하 고 일수로 시 일반 음식에 전환 했다. 성인 파리 섹스로 구분, 실험 그룹으로 배치 되었고 5 연속 일 행사. 이후에, 고리 모양의 부정적인 geotaxis 분석 결과 등반 실시 했다 고 파리 트리 글리세라이드 측정에 대 한 고정 했다. 두 유전자 라인, 오 레 곤 R과 y1에 대 한 대표적인 triglyceride 데이터 표시 됩니다 (B) 여성 및 남성 (C) w1 . 모든 파리 정상적인 규정식에 reared 되었고 성인에서 행사. 다른 글자와 레벨은 크게 다른 (p < 0.05) 임시 게시 학생의 t를 사용 하 여-테스트. 이 그림 멘데스 외 에 데이터의 하위 집합을 포함 11. 대표적인 등반 데이터 라인 DGRP 153 (D) 암컷과 수 컷 (E)에 대 한 표시 됩니다. 각 포인트 3 개의 독립적인 시간 지점에서 232 이상의 개인의 평균된 등반 성능을 나타냅니다. 오차 막대는 하나의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1:는 TreadWheel의 상세한 회로도. (A) 컴퓨터에 튜브를 연결 하는 데 사용 하는 듀얼 유리병 클램프 구조의 다이어그램. (B) 컴퓨터의 회전 드라이브 시스템의 실내 전망. (C) 컴퓨터의 정면 평행 투영 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 코드 파일: TreadWheel.skp 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기 자세한 운동 프로토콜 성공적으로 초파리 에서 부드러운 운동 자극을 보여왔다 고 지구력 운동11설정 제어 실험실에서 시뮬레이션을 사용할 수 있습니다. TreadWheel 개념을 처음 개발할 때 우리가 마찬가지로 수행을 수정할 수 있습니다 상용 제품을 고려 주목 해야 한다 (예를 들어, 실험실 rotisserie). 그러나, 우리가 궁극적으로 거부이 방법을 상용 장비는 충분히 낮은 회전 속도 (rpm 4) 하지 않은 높은 처리량 샘플 세대에 대 한 충분 한 유리병 용량 부족 때문에 맞춤 디자인을 선택.
다양 한 연구 주제를 포괄 하는 TW 프로토콜 자체를 조정할 수 있습니다. 예를 들어 주파수 및 파리의 운동 정권 기간 조정 받을 작품-아웃의 강도 변경할 수 있습니다. 1 주일 또는 다른 연령 그룹에 더 이상 프로토콜을 확장 하 여 그것 노화 다양 한 연령과 관련 된 질병에 대 한 운동의 효과 연구 하는 것입니다. 확장된 운동 접근 방식을 구현 하는 경우 다음 주 당 적어도 1 개의 나머지 하루 추가 해야 복구를 위해 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 성능 및 개선 포함 연속 매일 운동12를 사용 하는 그 정권 보다 복구 하루 정권에서 큰 것으로 보였다. 또한, 우리는 오랜 기간 지속적인 운동11후 회전 동작에 habituation 발생할 수 있으므로 운동 시 합 길이 지난 30 분을 연장 하는 것에 대 한 주의 것입니다. 우리는 또한 TW11에 그들의 활동 수준을 유지 하기 위해 동기 부여 파리의 유전자 변화를 관찰 하 고. 따라서, 더 이상 관찰 바란다면 와타나베와 수수께끼15,21 설명 TW 개념의 그들의 수정에 의해 발표로 파리 활동 수준 모니터링 고려 하십시오. 변화 될 수 있는 다른 요인은 온도 및 포함 잠 철 야 패턴 비행 움직임26,27영향을 표시 합니다.
동안과 운동 후 효과 해명 하기 잠재력 뿐 아니라 생리, 행동, 및 분자 수준에서 운동의 효과 해결 하기 위해 프로토콜 완료 후 사용할 수 있는 분석의 과다 한이 있다. 추가 대사 분석 실험 (예: 포도 당, 글 리 코겐, 단백질), 심장 성능 및 염증 반응을 측정 추가 탐험 효과 운동 사용할 수 있습니다 비행 생리학 및 신체 구성12,14에 ,,2428. 운동 유도, 행동, 운동 활동 및 수 면, 수 유에 변화 등와 관련 된 다양 한 행동 변화 또한 측정 될 수 있다 카페 분석 결과29 또는 활동 모니터링 장치12,15 같은 도구를 사용 하 여 ,30. 유전자 발현과 세포 호흡 운동에 변화 수 있습니다 또한 qRT-PCR11 , respirometry31같은 방법을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 마지막으로, 초파리 는 초파리 유전학 참조 패널 2 초파리 합성 인구 자원 연구원 수행 하기 위해 플랫폼을 제공 하는 등 사용할 수 있는 귀중 한 유전 자원 양적 유전자 연구25,32. 이러한 도구는 게놈 넓은 협회 연구 및 양적 특성 Loci 매핑, 운동 및 다이어트와 관련 된 후보 loci를 식별 하기 위해 같은 매핑 실험 가능
연구는 TreadWheel를 사용 하 여 완료, 평균, 운동 감소 체중, 총 triglyceride 저장 및 글 리 코겐, 단백질 함량을 증가 하 고 성능11등반 하면서 설명 했다. 또한, 남녀와 몸 무게로 트리 글 리세 리드, 단백질, glycogen, 포도 당, 및 활동 레벨11,15genotypes 운동 변수 응답 했다. 동안 운동과 genotypes와 섹스 다이어트에 대 한 응답의 변화 해석에 도전 수 있습니다, 시간에 어긋나 요, 그것은 반영 한다 자연적인 인구에서 관찰 된 실제 생물 학적 변이의 소스. 우리는 메츠의 높은 속도에 기여 하는 기본 요인의 다양성을 이해 하기 위해 노력 하 고, 모형 유기 체에서 이러한 요소를 테스트 하 여 다양 한 요인의 상대적 역할 disentangling 촉진 도구 우리의 능력에 중요 한 것 개인된 예방 및 치료 개입을 개발 하십시오. 완벽 하 게 운동의 효과 평가, 각 이러한 요소와 그들이 어떻게 상호 작용 고려 되어야 한다 때 실험을 실시 하 고 결론을 공식화.
대부분의 다른 비행 운동 기계 처럼 TW 플라이 모션을 계량 하는 기능에 제한 됩니다. 최근, 와타나베와 수수께끼는 회전 운동 정량화 시스템 (REQS), 초파리 모니터링 시스템 시리즈15,21에서 단위 (LAM25H)을 모니터링 활동으로 수정 TW 등뼈를 개발 했다. TW, 마찬가지로이 시스템 회전 하는 동의 사용 하 여 추적 하 고 계량 비행 활동, LAM25H 팔을 사용 하는 동안 운동을 부드럽게 유도 하지만 TW15보다 튜브 (32 병)의 더 작은 수를 보유 하고있다. 높은 처리량 운동 연구, 활동 정량화 필요 하거나 원하는 경우는 TW 큰 샘플 수 있습니다. TW 디자인 또한 튜브의 더 많은 수를 수용 하기 위해 그것의 현재 모양에서 수정 될 수 있습니다. 다른 기존의 운동 방법, 운동만 초파리 에서 달성 되지 않습니다 하지만 또한 생리 및 분자 응답 의 다양 한 신체 활동의 효과 결정 하 공부 될 수 있다 확립 하는 데 도움이 함께이 시스템, 11,,1215. 따라서, TW, 파리, 부드러운 운동 유도의 입증 된 방법으로 사용할 수 있습니다 큰 다양 한 생물 학적 질문을.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 줄리 Jarnigan, 메러디스 오웬스, 레이첼 힐, 브랜든 Moye로 라 Mafla, 올리비아, 생선과 비행 축산 및 이미지 처리와 함께 그들의 도움에 대 한 리드 연구소의 나머지 부분을 감사 하 고 싶습니다. 숀 멘데스 UAB 머신 샵의 도움으로 원래 TreadWheel 내장. 이 연구에 대 한 자금 LKR 학부 창의력과 켈리와 BJW 알라바 마의 대학에 연구 아카데미 NIH R01 GM 098856에 의해 제공 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for TreadWheel Construction: | |||
| Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount | McMaster-Carr | 60855K71 | Quantity: 4 |
| Stainless Steel Ball Bearing | McMaster-Carr | 57155K306 | Quantity: 8 |
| Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) | McMaster-Carr | 70235K16 | Quantity: 1 |
| Compact Square-Face DC Gear motor | McMaster-Carr | 6409K23 | Quantity: 1 |
| Tool Holder (clamps) | McMaster-Carr | 1723A22 | Quantity: 5 (10x) |
| 12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod | McMaster-Carr | 5227T24 | Quantity: 1 |
| Set Screw Shaft Collar | McMaster-Carr | 6432K13 | Quantity: 8 |
| Round-Belt Pulley | McMaster-Carr | 6284K51 | Quantity: 5 |
| Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor | McMaster-Carr | 13DV 1A | Quantity: 1 |
| Materials for Fly Maintenace and Husbandry | |||
| 6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) | Genesee Scientific | 32-130 | Quantity: 1 |
| 35x10mm Petri Dishes | VWR | 82050-536 | Quantity: 1 |
| Narrow Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-116 | Quantity: 1 |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | Quantity: 1 |
| Blowgun, Mini | Genesee Scientific | 54-104 | Quantity: 1 |
| Materials for RING-like Assay: | |||
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Quantity: 1 |
| 1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) | various | Quantity: 1 | |
| digital camera with timer or smart phone with camera timer app | various | Quantity: 1 | |
| Materials for Triglyceride Assay: | |||
| Dewar Flask | VWR | 14200-960 | Quantity: 1 |
| Serum Triglyceride Determination Kit | Sigma Aldrich | TRO100 | Quantity: 1 |
| Cordless Pestle Motor | VWR | 47747-370 | Quantity: 1 |
| Pestles | VWR | 47747-358 | Quantity: 1 |
References
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