Summary
La médiévale utilise le mouvement de rotation doucement induire exercice adulte Drosophila melanogaster en exploitant la géotaxie d’inné, négatif des mouches. Il permet l’analyse des interactions entre l’exercice et de facteurs tels que le génotype, le sexe et régime alimentaire et leur effet sur les dosages moléculaires et physiologiques pour évaluer la santé métabolique.
Abstract
L’incidence des maladies métaboliques complexes a augmenté suite à une transition généralisée vers des modes de vie de l’augmentation de la consommation calorique et niveaux d’activité abaissée. Ces maladies multifactorielles proviennent d’une combinaison de facteurs génétiques, environnementaux et comportements. Une telle maladie complexe est un Syndrome métabolique (MetS), qui est un groupe de troubles métaboliques, y compris l’hypertension, l’hyperglycémie et l’obésité abdominale. Exercice et intervention diététique sont les traitements primaires recommandés par les médecins pour réduire l’obésité et ses maladies métaboliques subséquentes. Exercice intervention, training, à intervalles aérobiques en particulier stimule des changements favorables dans les facteurs de risque communs pour le diabète de Type 2 (T2DM), des maladies cardiovasculaires (MCV) et d’autres conditions. Avec l’afflux de témoignages décrivant l’exercice de l’effet thérapeutique a sur la santé métabolique, établissant un système de modèles exercent dans un milieu contrôlé fournit un outil précieux pour évaluer les effets de l’exercice dans un contexte expérimental. Drosophila melanogaster est un excellent outil pour étudier les changements physiologiques et moléculaires qui résultent de l’intervention de l’exercice. Les mouches ont des durées de vie courtes et des mécanismes similaires de métaboliser les nutriments en comparaison aux humains. Pour provoquer l’exercice chez la drosophile, nous avons développé une machine appelée la médiévale, qui utilise la tendance innée, négatif géotaxie de la mouche d’induire doucement escalade. Cela permet aux chercheurs de réaliser des expériences sur des cohortes de mouches génétiquement diversifiés afin de mieux comprendre l’interaction génotype-par-environnement qui sous-tendent les effets de l’exercice sur la santé métabolique.
Introduction
L’enfance et l’obésité adulte sont développent des épidémies dans les cultures qui consomment les régimes riches en calories et restent inactif pendant de longues périodes de temps, ce qui peut entraîner de graves conséquences à long terme, y compris la résistance à l’insuline, l’inflammation chronique et l’arthrose 1 , 2 , 3 , 4. la prévalence de ces troubles ne cesse d’augmenter en raison du déséquilibre croissant dans l’apport calorique et dépenses attribuées à la consommation élevée de graisses et de sucres et d’un mode de vie sédentaire principalement5. Parallèlement, ce déséquilibre de l’énergie a conduit à une multiplication des cas de diabète de Type 2 (T2DM) et la maladie cardiovasculaire (MCV)5. Individus courent un risque plus élevé de développer ces deux troubles si ils ont été diagnostiqués atteints de troubles du Syndrome métabolique (MetS), dont les symptômes incluent l’obésité abdominale et dyslipidémie2. MetS est façonnée par les interactions complexes entre le génotype et divers facteurs environnementaux, comme le régime alimentaire et exercice6. Ainsi, pour obtenir une pleine compréhension des mécanismes sous-jacents de cette maladie complexe, tous ces facteurs devraient être considéré.
Quand il s’agit de la lutte contre les MetS, les médecins recommandent d’abord qui subissent des changements de style de vie qui incluent manger un régime alimentaire sain et équilibré et une activité physique2,7,8. Étant donné que des médicaments efficaces sont limitées et la chirurgie de pontage gastrique est coûteuse et nécessite une surveillance médicale permanente, des interventions pharmacologiques et chirurgicales ne sont recommandée que pour les cas graves et uniquement en combinaison avec ces changements de mode de vie3 ,7,8. Alors que des interventions de style de vie, tels que l’exercice et un régime, peuvent produire et maintenir les objectifs à long terme de perte de poids, si oui ou non ces mesures correctives peuvent atténuer complètement les effets négatifs associés aux MetS a besoin d’une étude plus approfondie7, 8.
Modèles de souris ont été utilisés pour examiner les effets de l’exercice sur les maladies métaboliques des années ; Toutefois, l’introduction de l’exercice à bord de recherche MetS est une activité relativement récente9,10,11,12. Mouches fournissent le véhicule parfait pour étudier l’exercice en milieu contrôlées en laboratoire, car ils sont facilement manipulables, ont une durée de vie courte, sont peu coûteux à entretenir et les voies métaboliques liés à l’énergie sont hautement conservées entre Drosophila et les humains13. D. melanogaster génomes sont bien caractérisés, et il y a une multitude d’outils génétique disponible pour une utilisation chez la drosophile qui peut donner un aperçu de différents génotypes et des interactions génotype-par-environnement qui pourraient moduler la effet de l’exercice sur la santé des14.
Les méthodes actuelles de l’exercice de Drosophila invoquent tendance de géotaxie innée, négatif de la mouche, l’instinct comportemental à monter vers le haut, pour stimuler la montée chez les adultes dans leur enclos11,12,15 . La tour de puissance, un moyen de stimuler l’exercice chez les mouches, systématiquement déclenche les enclos mouches verticalement et puis retombe eux à la surface du banc, frapper efficacement les mouches au fond du flacon, induisant ainsi leur instinctive géotaxie négative 12 , 16. des expériences réalisées à l’aide de cette machine ont montré que l’exercice est un puissant facteur de protection contre de nombreuses maladies liées au vieillissement, y compris les droits antidumping et compensateurs T2DM et favorise le vieillissement en santé12,17,18 . Plus précisément, ils ont démontré que l’exercice peut réduire l’apparition de la diminution de la mobilité liée à l’âge chez les mouches et améliorer les symptômes liés à l’âge multiples, tels que la performance cardiaque et souligner la réponse17,18. Toutefois, le contrôle vole jamais placé sur la tour a montré des résultats escalade plus élevés que ceux touchés par la machine, ce qui suggère que la force des gouttes répétitifs peut-être causer un dommage à le mouches et affectant la mobilité12. Ceci suggère qu’une autre méthode d’induction d’exercice qui est moins vigoureux et évite de provoquer des traumatismes physiques serait une méthode utile, complémentaire à la Power Tower protocole16.
Pour provoquer doucement l’exercice chez la drosophile, nous avons mis au point un appareil d’exercice appelé la médiévale (Figure 1). La médiévale de (ci-après abrégé en TW) mouvement de rotation déclenche la tendance innée, négatif géotaxie des mouches en redéfinissant constamment gravitationnel haut du flacon, qui, à son tour, stimule la montée dans les mouches. Contrairement aux autres méthodes, le mouvement de rotation de la TW est intrinsèquement doux, ce qui minimise le nombre de facteurs de stress supplémentaires qui peuvent survenir et impact sur les résultats. Ainsi, la machine permet d’induire l’exercice dans un grand nombre de mouches sans provoquer de stress, ce qui permettra aux chercheurs d’étudier les effets de l’exercice sur la santé métabolique (Figure 2), le vieillissement, sommeil et de nombreux autres sujets11.
Notre méthode suit un inverse pyramidale, le protocole de formation intervalle, qui en grande partie incorpore des aspects d’intervalle aérobie (ACI) de formation avec une endurance entraînement physique. Le régime standard de l’ACI est altéré dans le présent protocole pour augmenter progressivement la durée de chaque intervalle, sur une période de cinq jours pour favoriser l’endurance. ACI a été particulièrement utile dans la prévention des MetS par rapport aux autres modes d’intervention et plus efficace dans l’inversion des facteurs de risque communs du Syndrome métabolique à un exercice modéré continue19,20. Cependant, un inconvénient de la TW par rapport à la tour de puissance est que les mouches s’habituer plus rapidement pour le mouvement de rotation, donc variation dans une tendance innée à s’habituer parmi les mouches peut compliquer l’interprétation des avantages de l’exercice. 11 une solution élégante à cette limitation est décrite par Watanabe et énigme15 et leur complément article21.
Protocol
1. médiévale configuration et fonctionnement
Remarque : Voir la Figure 1 pour schémas sur TW exercer construction de machines. Les pièces sont répertoriées dans la Table des matières. Les phrases « TW », « Médiévale », « machine d’exercice » et « machine » est utilisée indifféremment tout au long du protocole.
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Étalonner moteur à l’aide d’interrupteur d’alimentation tels qu’une période de rotation complète est de 15 s (4 tr/min). Calibrer la vitesse de rotation machine avant de placer les flacons fly dans pinces sécurisés sur bras pivotant.
- Régler la vitesse à l’aide d’un chronomètre standard et un objet immobile temporairement attaché à la machine, comme un petit pinceau collée sur le couvercle du moteur avec le pinceau juste toucher un des supports rotatifs. Le temps du nombre de rotations en une minute à l’aide de l’objet immobile comme point de référence et régler la vitesse pour obtenir une période de rotation de s 15 (4 tr/min).
2. voler la collecte et l’entretien
Remarque : Toutes les mouches sont maintenues dans une étuve à 25 ° C avec 50 % d’humidité et un cycle lumière/obscurité de 12 h entre benchtop manipulations décrites ci-dessous. Mouches sont nourries d’un standard de semoule de maïs-mélasse laboratoire sauf indication contraire.
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Préparer les chambres portant pour chaque génotype d’intérêt en utilisant les boîtes de gélose-jus de pomme, une goutte de pâte levure par plaque et 6 oz de bouteilles en plastique pour ramasser les œufs qui éclosent en larves.
- Pour préparer le jus de pomme plaques d’agar, remplissez Pétri de 35 x 10 mm ¾ plein avec 3 % d’agar dissous dans le jus de pomme du commerce. Stocker les plaques solidifiés dans un réfrigérateur jusqu'à l’utilisation.
- Dans un tube à centrifuger conique 50 mL, mélanger la levure sèche active avec de l’eau distillée à raison de 2 mL d’eau pour chaque gramme de levure. Mélanger la levure avec de l’eau pour créer une pâte ayant la consistance du ketchup en utilisant un tige d’agitation en verre. Ajuster les proportions levure et l’eau au besoin pour obtenir la consistance désirée.
- Conserver la pâte de levure au réfrigérateur entre les utilisations. Garder le chapeau du tube lâche pour permettre le dégagement gazeux.
- Utilisez une aiguille fine ou couteau pour perforer des petits trous dans les 6 oz-fond carré bouteilles (polypropylène) sous forme de trous de ventilation pour les chambres portant.
- Tamponnez une petite tache de pâte de levure (environ 3 mm de diamètre) sur chaque plaque d’agar-jus de pomme.
- Placez les mouches adultes du génotype désiré dans la 6 oz bouteille et bouchon avec la gélose jus de pomme. Fixer la plaque sur la bouteille avec des élastiques. Renverser et placer dans un incubateur pour permettre aux adultes à pondre des œufs.
- Changement des plaques d’agar-jus de pomme sur une chambre portant deux fois par jour (matin et soir). Plaques de congé utilisé dans l’incubateur pendant encore 12 à 24 h, afin de permettre la première instar des larves d’éclore.
- Recueillir tout d’abord instar des larves à l’aide d’un mince pinceau ou collection pick (aiguille fine souple fixé à un manche). 50 place premier instar des larves d’un génotype spécifique sur un flacon d’aliments du type d’aliment expérimental désiré pour développer et métamorphose complète alors qu’il est hébergé dans l’incubateur (Figure 2A).
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Recueillir des adultes pour le traitement de l’exercice (Figure 2A).
- Lors de la nymphose, recueillir des nymphes avec un pinceau humide, petit et placer dans des flacons vides avant l’éclosion pour empêcher les mouches adultes d’être exposés à l’alimentation des larve.
- Transférer les mouches adultes pour flacons de nourriture de diète de laboratoire standard comme ils eclose. Un à cinq jours après l’éclosion, séparer les mouches fondées sur le sexe.
- Désigné semestre les adultes prélevés chaque à l’expérimental et les groupes témoins. Maintenir les mouches en flacons d’alimentation de laboratoire standard à une concentration de 50 mouches par flacon.
- Transfert en adultes à flacons d’aliments frais tous les deux jours pour les empêcher de se coincer au cours de l’exercice. Ajouter quelques grains de levures vivantes supplémentaire à la nouvelle nourriture immédiatement avant d’introduire les mouches.
Remarque : Bien qu’il soit possible de maintenir les mouches sans un supplément de levures vivantes, nous avons trouvé que les mouches adultes performent mieux à la supplémentation. Supplémentation de levures vivantes est une variable qui peut être modifiée en fonction des buts expérimentaux du chercheur.
3. Protocole de l’exercice
- Le premier jour de l’exercice (1 jour), flacon poussoir bouchons pour laisser 1 cm d’espace en flacons de contrôle et de 6 cm d’espace entre la nourriture et la fiche d’exercice flacons (Figure 1).
Remarque : Les flacons de contrôle seront ont peu d’espace pour les mouches de passer alors que la machine d’exercice et donc mouches seront livrera à beaucoup moins de mouvements que dans des flacons de l’exercice. - Placer les flacons dans les mors et donnez les mouches 10 min d’acclimater sur la machine (Figure 1B).
Remarque : Un contrôle substitution est de maintenir les mouches non exercés sur la paillasse adjacent à la machine d’exercice avec 6 cm d’espace (dans le flacon) pour déplacer normalement. Des résultats similaires d’exercice par rapport à la fois le « 1 cm sur médiévale » et les contrôles « 6 cm sur paillasse » ont été découverts11. -
Traiter les deux contrôle et exercer des mouches à la rotation de la machine à une température ambiante constante pendant 5 jours consécutifs par semaine avec une alternance de périodes de rotation et de repos (Figure 1D).
Remarque : Une température constante est nécessaire pour éviter les effets confondants de la température sur les niveaux d’activité. Pour les études de température de manipulation, placez le TW à l’intérieur d’un incubateur pour modifier des traitements de température au cours de l’entraînement physique.- Faire fonctionner la machine pour quatre épisodes de 15 min d’exercice le jour 1. Alterner ces combats avec des périodes de repos de 5 min.
- Chacun des jours suivants, ajouter 5 min d’exercice à l’un des assauts d’exercice préexistants. Par exemple, le jour 2, faire le premier exercice de combat long de 20 min, mais maintenir le reste des assauts à 15 min de long.
- Le jour 3, exercice vole pendant 20 min pendant les deux premiers épisodes et 15 min pour les deux épisodes suivants.
- Le jour 4, utiliser 20 min exercice combats pour tous sauf le combat final, qui devrait être long de 15 min.
- Le jour 5, garder tous les épisodes d’exercice long 20 min.
Remarque : Au cours de périodes de repos, les flacons contenant les mouches devraient rester solidement fixées sur le TW. L’orientation des flacons au cours de ces périodes n’est pas pertinente, car la force gravitationnelle subie par toutes les mouches viendront de la même direction.
- Après avoir terminé le traitement de l’exercice pour un jour donné, renvoyez les bouchons de flacon de nourriture à leurs positions normales et mouches à leurs incubateurs jusqu’au lendemain.
- Après avoir achevé le régime de plein exercice, anesthésier les mouches à l’aide de méthodes d’anesthésie standard fly CO2 . Puis transfert vole à nouveau alimentaire flacons ou tubes de microcentrifuge évaluation des caractéristiques phénotypiques d’intérêt.
Remarque : Les phénotypes exemple incluent escalade capacité (flacon de nourriture), stockage des triglycérides (tubes de microcentrifuge) ou l’expression des gènes (tubes de microcentrifuge). Le protocole peut être suspendu ici avec échantillons stockés convenablement selon les évaluations à effectuer. Dosages impliquant des mouches vivantes devront être menées sans délai conformément aux objectifs spécifiques de l’analyse phénotypique.
4. évaluation d’escalade
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Après une journée de repos après avoir terminé le protocole d’exercice, test générale mouche escalade de performance à l’aide d’un rapide géotaxie négative itératif (anneau)-comme géotaxie négative escalade assay22.
- Placer les groupes de 10 mouches dans les flacons vides à l’aide de CO2 anesthésie (ou en le tapotant directement à partir de flacons alimentaires si déjà triée) et sceller avec film de paraffine pour empêcher les mouches de s’échapper. Donner des mouches au moins 10 min s’acclimater au nouveau flacon. Pour éviter les flacons de basculer, tape un cercle de papier cartonné ~ 5 cm de diamètre au fond du flacon de fournir la superficie supplémentaire.
NOTE : Bouchons de flacon ne doivent pas être utilisés, parce qu’ils empêchent le cadre de la cuvette utilisée pour déterminer la hauteur est monté. - Placer les flacons 20 cm devant une grille de 1 x 1 cm sous les yeux d’une caméra montée, stationnaire avec une minuterie intégrée (un téléphone intelligent avec une application de caméra minuterie fonctionne bien).
- Tapoter délicatement les flacons sur les compteur trois fois de frapper tous les mouches jusqu’au bas de la cuvette. Après écoutes le flacon vers le bas de la troisième fois, commencer immédiatement la minuterie de caméra 4 s pour capturer une image afin de déterminer la hauteur a grimpé de chaque volée.
NOTE : Taraudage doit être faite à une intensité uniforme et par le même chercheur sur chaque contraste exercice-contrôle afin de minimiser les variations dans les réponses des mouches à cause des écoutes. - Répétez l’étape 4.1.3 deux fois, au moins 1 min de repos entre les essais, afin de produire un total de trois essais par flacon.
- Placer les groupes de 10 mouches dans les flacons vides à l’aide de CO2 anesthésie (ou en le tapotant directement à partir de flacons alimentaires si déjà triée) et sceller avec film de paraffine pour empêcher les mouches de s’échapper. Donner des mouches au moins 10 min s’acclimater au nouveau flacon. Pour éviter les flacons de basculer, tape un cercle de papier cartonné ~ 5 cm de diamètre au fond du flacon de fournir la superficie supplémentaire.
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Afin de préserver les mouches pour les autres analyses, immédiatement après que l’essai d’escalade a été achevée, flash geler les mouches par immersion dans l’azote liquide.
- Utilisez une fiole de dewar peu profonds, ouvert rempli d’azote liquide jusqu'à une profondeur d’environ 5 cm.
- Transfert des mouches à petit microtubes à centrifuger à l’aide de CO2 anesthésie et puis placer les tubes dans le vase de dewar rempli d’azote liquide. Par ailleurs, si les analyses futures besoin d’évitement du CO2, clin d’oeil geler les mouches directement dans leurs flacons d’escalade en tapotant doucement vole vers le bas de leur flacon alors que le fond est submergé dans l’azote liquide et ensuite transférer les mouches congelés à tubes de microcentrifuge avec une pincette.
Remarque : L’azote liquide est cryogénique et ne doit être utilisé avec bonne ventilation protection du matériel et la salle.
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Traitez les images en utilisant l’outil de sélection multiple de23 ImageJ.
- Ouvrez une image pour le traitement dans ImageJ.
- Définir une échelle de 1 cm basée sur le document de grille de référence pour calculer la distance a grimpé de chaque volée individuelle. Utilisez l’outil « ligne » dans la barre d’outils sur le côté d’un carré de2 cm 1 trace de ce document grille. Cliquez sur l’onglet « Analyse » et sélectionnez « Définir l’échelle ». Définissez la Distance « connu » comme « 1,00"et « Unité de longueur » comme « cm », assurez-vous que « Global » est désactivé et cliquez sur « OK ».
- Sélectionnez l’icône « Multi-point sélection » dans la barre d’outils et d’effectuer un zoom avant sur le fond de la fiole dans l’image. Définir le premier point que tout en bas de la cuvette en cliquant sur la partie inférieure du flacon.
- Cliquez sur le centre de chaque volée dans la fiole pour la marquer comme étant un point de données. Prendre note qu’il y a un total de 11 points par flacon, une marque au fond de la fiole et pour chaque volée.
- Cliquez sur l’onglet « Analyse » et sélectionnez « Mesure » pour générer une table des valeurs mesurées. Enregistrez table en tant que fichier csv.
- Ouvrez le fichier csv dans un tableur et calculer la distance exacte a grimpé de chaque volée en soustrayant les valeurs y des points 2-11 de : point 1 dans le tableau de valeurs mesurées.
- Répétez les étapes 4.3.1 à travers 4.3.6 pour chaque image.
5. triglycéride stockage Assay
Remarque : Les échantillons, normes, solution titrée de glycérol et triglycérol travail solution utilisée tout au long de l’essai doivent être conservés sur la glace pendant la durée du protocole et doivent être conservés au réfrigérateur quand pas en service.
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Élaborer des normes à l’aide de la solution étalon de glycérol.
- Faire le vide (B) en ajoutant 1 000 µL de tampon de l’homogénéisation dans un tube de microcentrifuge b.
- Faire Standard 1 (S1), 2,5 mg/mL par puits, en ajoutant 1 000 µL de la solution étalon de glycérol dans un tube de microcentrifuge étiqueté S1.
- Faire 2 Standard (S2), 1,25 mg/mL par puits, en ajoutant 500 µL de la solution étalon de glycérol à 500 µL de diH2O dans un tube de microcentrifuge étiqueté S2.
- Faire Standard 3 (S3), 0,625 mg/mL par puits, en ajoutant 250 µL de la solution étalon de glycérol à 750 µL du diH2O dans un tube de microcentrifuge étiqueté S3.
- Faire Standard 4 (S4), 0,3125 mg/mL par puits, en ajoutant 125 µL de la solution étalon de glycérol à 875 µL de diH20 dans un tube de microcentrifuge étiqueté S4.
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Préparer la solution de travail triglycérol du Kit de dosage triglycérides sériques.
- Ajouter 40 mL de diH2O au réactif glycérol libre du kit et mélanger en retournant le flacon.
- Ajouter 10 mL de diH2O à la solution de triglycérides du kit et mélanger en retournant le flacon.
- Mélanger la solution de réactif et de triglycéride glycérol et mélanger en retournant pour préparer la solution de travail triglycérol.
Remarque : La solution de travail triglycérol est bonne pour 60 jours et peut effectuer quatre essais de plaque à 96 puits par kit en utilisant le protocole ci-dessous. Les volumes utilisés sont réduites proportionnellement de la trousse de dosage des triglycérides sériques officielle pour une utilisation dans le format de la plaque à 96 puits.
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Vérifiez Blank et normes de pipetage soigneusement 5 µL de chacune des normes dans un appartement de 96 puits à fond, claire microplaque en triple exemplaire (ou quatre exemplaires pour l’essai à blanc).
- Ajouter exactement 125 µL de Solution de travail triglycérol dans chaque cupule contenant une norme. Permettent des solutions réagir pendant 30 min.
- Posez une plaque à 96 puits dans un spectrophotomètre et lire l’absorbance à 540 nm. Utiliser les mesures d’absorbance pour créer une courbe d’étalonnage et de vérifier l’exactitude des normes en évaluation de la valeur de2 R. Si le R2 pour les normes est inférieur à 0,98, re-préparer les normes plus attentivement.
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Commencer le jour 1 du test triglycérides stockage14 en utilisant des tubes de microcentrifuge contenant 10 congelés vole chacun.
Remarque : Une pipette de répéter ou multicanal doit jamais servir dans cette étape car les quantités de chaque réactif utilisé dans l’essai doivent être très précise et cohérente pour obtenir des résultats reproductibles. Dans notre expérience, répéter et à canaux multiples pipettes n’ont pas ce degré de précision et de cohérence. Chaque partie aliquote d’une pipette à canal unique peut être confirmée visuellement par l’expérimentateur pour contrôle de la qualité et n’importe quel biais de pipette spécifiques monocanal seront expérimentés par tous les échantillons dans la même mesure.- Préparer un stock de 200 mL de tampon d’homogénéisation en combinant 0,272 g de KH2PO4, 400 µL d’EDTA 0,5 M et mL 199,6 diH2O dans une bouteille en verre.
- Ajouter exactement 100 µL de tampon de l’homogénéisation à chacun des 40 tubes de microcentrifuge contenant 10 adultes congelés après l’essai d’escalade. Centrifuger les échantillons pendant 30 s à 18 000 g.
- Moudre les mouches à l’aide d’une meule motorisée et pilon (ou une autre forme d’homogénéisation de tissu) pour préparer une solution laiteuse. Assurez-vous de qu'utilise un pilon frais pour chaque échantillon. Centrifuger les échantillons pendant 2 min à 18 000 g.
- Pipetter seulement le top 75 µL de liquide surnageant de chaque tube dans nouveaux tubes de microcentrifuge. S’assurer qu’aucun bit mouche de la pastille n’est transféré. Placer les tubes de nouveau dans le réfrigérateur pendant la nuit.
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Commencer jour 2 du protocole de triglycéride en enlevant 1 jour échantillons du réfrigérateur.
NOTE : Étape 5.5 peut être réalisée le même jour que 5.4 mais nous avons trouvé le signal pour la concentration de triglycérides être plus robuste après une nuit au réfrigérateur. Cependant, le délai entre les étapes 5.4 et 5.5 ne doit pas dépasser 36 h.- (Facultatif) Vortex le premier tube avec le surnageant pour 10 s et pipette 5 µL dans un tube de microcentrifuge propre. Ajouter 95 µL de 0,15 M de NaCl dans le nouveau tube de microcentrifuge. Stocker ces sous-échantillons dans le congélateur-20 ° C pour un dosage plus tard de protéines si vous le souhaitez.
Remarque : Ces échantillons du liquide surnageant avec la solution de NaCl ajoutée peuvent être utilisés pour déterminer la teneur en protéines à l’aide de dosage préféré du chercheur. Nous utilisons la méthode de Bradford24. La teneur en protéines est une façon de normaliser la mesure de la teneur en triglycérides, mais le chercheur devrait également être prudent dans l’interprétation de ces rapports depuis l’exercice et régime alimentaire peut également affecter stockage de protéine. - Pour les flacons de surnageants originales, réplique vortex le premier tube avec le liquide surnageant pendant 10 s, puis prélever 5 µL dans deux puits séparés d’une microplaque 96 puits pour produire des techniques. N’oubliez pas de note quels puits sont utilisés pour chaque échantillon. Répétez cette étape pour les 39 autres tubes.
- Distribuer exactement 5 µL de l’essai à blanc dans la microplaque de quatre, et pour les autres cupules, Pipetter exactement 5 µL de chaque étalon en triple exemplaire.
- Ajouter exactement 125 µL de solution de travail triglycérol dans chaque puits et laisser la solution agir pendant 30 min.
- Placer la plaque de 96 puits dans un spectrophotomètre et lire l’absorbance à 540 nm.
- Convertir les valeurs d’absorbance à la concentration (mg/mL) à l’aide de la courbe d’étalonnage calculée à partir des normes.
- (Facultatif) Vortex le premier tube avec le surnageant pour 10 s et pipette 5 µL dans un tube de microcentrifuge propre. Ajouter 95 µL de 0,15 M de NaCl dans le nouveau tube de microcentrifuge. Stocker ces sous-échantillons dans le congélateur-20 ° C pour un dosage plus tard de protéines si vous le souhaitez.
Representative Results
Nous nous intéressons surtout à identifier les facteurs qui contribuent à la santé métabolique général d’un individu. Il a été précédemment constaté que les interactions génotype-par-régime contribuent substantiellement à la variation des caractéristiques métaboliques14niveau population. Cela signifie que chaque génotype répond aux différences environnementales d’une manière unique et complexe. Pour étendre notre travail sur les effets du génotype et de l’environnement afin d’inclure l’exercice physique, nous avons développé la médiévale, qui est capable d’exposer un grand nombre de génotypes à intervalle aérobie (ACI) de formation de manière à haut débit.
Pour établir si l’exercice sur la TW influencé caractéristiques métaboliques, nous avons mesuré le stockage des triglycérides dans l’Oregon-R (OreR) et y1o1 les mouches, les mouches de type sauvage commun (Figure 2B – C) et normalisé de ces valeurs contre des mouches concentration de protéines, comme initialement indiquée dans Mendez et al. 11. nous avons analysé les données de l’analyse de variance multivariée (MANOVA) comptabilité pour génotype, sexe, exercer de traitement (et leurs interactions), et des effets de bloc expérimental comme réplique de temps et de l’alimentation flacon et trouvent qu’il y avait une importante interaction génotype-par-exercice (p = 0,0017) affectant le stockage des triglycérides. Il y avait un effet significatif de dimorphisme sexuel entre mâles et femelles, les mâles stocker plus de triglycérides que les femelles (p < 0,0001). Nous avons vu que chez les femelles, exercé de mouches avaient significativement plus faible taux de triglycérides que leurs homologues non levées (Figure 2B, p < 0,0001). Chez les mâles, alors que la diminution dans le stockage de triglycérides observé dans l’Oregon-R exercé mouches (comparativement aux groupes témoins) n’était pas statistiquement significative, une différence significative dans le stockage des triglycérides a été observée entre les deux lignes distinctes (Figure 2C, p < 0,0001). Notez que tout en normalisant la concentration de triglycérides contre la concentration de protéine donne un aperçu sur le corps dans l’ensemble mouche rapports de composition, la comparaison de la concentration de triglycérides ou protéine directe entre les différents groupes de mouches peut également fournir des informations spécifiques sur l’effet de l’exercice sur ces phénotypes individuellement.
Étant donné que les variables comme l’exercice adulte, sexe, et génotype ne semblent pas affecter le stockage des triglycérides, il était prévu que ces facteurs aussi autres phénotypes d’impact et d’interagissent avec l’alimentation. Nous avons recueilli des larves d’un type sauvage représentant Drosophila génétique référence panneau ligne (DGRP 153)25 sur soit une haute teneur en graisses ou régime alimentaire normal et l’exercice induit chez les mouches adultes pour une semaine (Figure 2A). Par la suite, nous avons effectué un essai d’annulaires géotaxie négative pour mesurer la capacité s’élevante. L’essai d’escalade utilisé diffère d’un essai normalisé de l’anneau ; au lieu d’un appareil à anneau, flacons avec pellicule de paraffine couvrant les ouvertures servaient à mouches domestiques pendant le test. Autres aspects du test de l’anneau original, comme le temps entre les écoutes les mouches au fond de la cuvette et prendre la photo, ont été retenus22.
Tous les traitements ont été répétés trois moments distincts avec un minimum de 59 mouches individuels par temps de répliquer et de traitement. On a analysé les données de comptabilité MANOVA régime, génotype, sexe, exercer de traitement (et leurs interactions), ainsi que les effets de bloc expérimental de temps replicate, flacon de dosage et flacon test répétés. Nous avons constaté que les femelles exercées a grimpé nettement plus élevée (p < 0,005) élevées sur le régime riche en graisses que n’importe lequel des autres traitements féminins (Figure 2D). Pour les mâles, on a vu que l’exercice amélioré seulement escalade lorsque les hommes ont été soulevées sur le régime alimentaire normal, et celles soulevées sur le régime riche en graisses a montré aucun changement important (Figure 2A). Nous avons également constaté des effets significatifs de dimorphisme sexuel (p < 0,0001) dans l’escalade avec escalade plus élevé que les femelles des mâles. Le résultat surprenant d’une diminution des performances après un exercice pour les femmes de la ligne 153 DGRP (Figure 2-D) pour les femmes ayant un régime alimentaire normal d’escalade (p < 0,0001) est un exemple de comment ce type d’exercice peut ne pas être un une intervention positive uniformément pour tous les génotypes et pourrait être subordonnée à d’autres facteurs environnementaux. En Morvan et al. 11, les femelles de quatre autres lignées génétiques testées pour leur performance escalade après avoir été élevé sur une normale alimentation toutes les capacité escalade a montré avec l’entraînement. Cela laisse croire que la réponse observée dans 153 DGRP génotype spécifique et pas une propriété générale du traitement exercice TW. La variabilité de la réponse à travers le sexe, l’alimentation et les groupes de traitement exercice indique qu’il y a des interactions significatives de sexe-par-alimentation-par-exercice qui affecte la capacité s’élevante de la ligne (p < 0,0001).
Pris ensemble, les résultats indiquent que l’impact de l’exercice sur la santé métabolique de la mouche adulte peut être une fonction de son sexe, génotype et l’alimentation de larve. La variation phénotypique observée en réponse à génotype, variables d’environnement (p. ex., régime alimentaire et exercice) et le sexe a aussi observé dans d’autres études11,12,14,15. Ainsi, la TW et Drosophila peuvent être une stratégie puissante pour élucider les facteurs génétiques et environnementaux, formation Santé métabolique.
Figure 1 : Appareil d’exercice médiévale le. (A) la machine détient 48 flacons et dispose d’une fonction de vitesse réglable. Ici les expériences ont été effectuées à 4 tr/min. (B) alimentaire individuelle flacons contenant les mouches expérimentaux ont été cassés en brides fixées à un axe de rotation. Nourriture et le bouchon (C) la distance entre le flacon était 6 cm pour flacons d’exercice et 1 cm pour les flacons de contrôle. Les flacons ont été ensuite placés sur la machine pour l’exercice. (D), cet exercice de pyramide inversée de 5 jours de régime a servi à exercer les mouches adultes. Chaque jour, un autre cinq minutes a été ajouté à l’un des assauts de l’exercice à rampe progressivement, intensité d’exercice qui modélise l’endurance, entraînement par intervalles. Ce chiffre a été modifié par Mendez et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Méthodes visuelles et des résultats représentatifs. (A) méthodes d’essai alimentation larvaire et adulte exercice effets d’interaction. Les larves ont été soulevés sur alimentation de laboratoire élevé de gras ou normal et passés à une alimentation normale après éclosion. Les mouches adultes ont été séparés par sexe, placés dans des groupes expérimentaux et exercés pendant cinq jours consécutifs. Par la suite, une géotaxie négative annulaires escalade test a été effectué, et mouches ont été gelés pour les mesures de triglycérides. Triglycérides représentant les données sont présentées pour deux lignées génétiques, Oregon R et y1o1 pour (B) les femmes et les hommes (C). Toutes les mouches ont été élevés sur un régime alimentaire normal et exercées à l’âge adulte. Niveaux avec des lettres différentes sont significativement différentes (p < 0,05) à l’aide de l’étudiant post hoc t-test. Ce chiffre contient un sous-ensemble des données rapportées dans le Morvan et al. 11. données escalade représentatives sont indiquées pour la ligne 153 DGRP (D) les femmes et les hommes (E). Chaque point représente la moyenne performance escalade de 232 ou plusieurs individus à travers trois moments indépendants. Barres d’erreur indiquent un écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : un schéma détaillé de la médiévale. (A) schéma de la structure de fixation double flacon utilisée pour relier des flacons à la machine. (B) vue de l’intérieur du système de rotation de disque de la machine. (C) projection parallèle de la face avant de la machine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Fichier de Code supplémentaire : TreadWheel.skp S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Le protocole d’exercice détaillé ici a été montré pour stimuler avec succès des exercices légers chez la drosophile et peut être utilisé pour simuler un exercice d’endurance dans un laboratoire contrôlé11. Il est à noter que, lorsque initialement perfectionner la médiévale, nous considérés comme des produits commerciaux susceptibles d’être modifiés pour effectuer de la même manière (par exemple, une rôtisserie de laboratoire). Cependant, nous ont finalement rejeté cette approche, choisir un design sur mesure, car l’équipement commercial n’avait pas une vitesse de rotation suffisamment basse (4 tr/min) et n’avait pas une capacité suffisante de flacon pour la production d’échantillons de haut débit.
Le protocole TW lui-même peut être ajusté pour englober une vaste gamme de sujets de recherche. Par exemple, réglage de la fréquence et la durée des régimes d’exercice des mouches peut modifier les intensités des travaux-outs qu’ils reçoivent. En prolongeant le protocole de plus d’une semaine, ou à d’autres groupes d’âge, il serait possible d’étudier les effets de l’exercice sur le vieillissement et de diverses maladies liées au vieillissement. Nous recommandons que si une approche étendue exercice est mis en œuvre, puis jour de repos au moins une par semaine ajoutons permettant la récupération. Performance et l’amélioration s’est avéré être supérieur dans les régimes prévoyant une journée de récupération que les régimes qui utilisé consécutives d’exercice quotidien12. En outre, nous mets en garde contre l’extension des longueurs de combat exercice passé 30 min car accoutumance au mouvement de rotation peut survenir après de longues périodes de continu exercent11. Nous avons également observé des variations génétiques dans la motivation des mouches pour maintenir leur niveau d’activité sur la TW11. Ainsi, si vous désirez des périodes plus longues, envisager de surveillance des niveaux d’activité des mouches, tel que présenté par Watanabe et énigme15,21 décrivant leur modification de la notion TW. D’autres facteurs qui pourraient être modifiées comprennent la température et sommeil-éveil motifs qui ne semblent pas concerner les mouvements mouche26,27.
Il existe une pléthore d’analyses disponibles pendant et après l’achèvement de protocole pour contrer les effets de l’exercice au niveau moléculaire, comportementaux et physiologique, ainsi que le potentiel de démêler les effets épigénétiques de l’exercice. Des tests métaboliques supplémentaires (par exemple, le glucose, le glycogène et protéine), performance cardiaque et réaction inflammatoire mesures peuvent être utilisées afin d’étudier l’exercice effet a sur mouche physiologie et corps composition12,14 ,24,28. Divers changements comportements associés à l’induction de l’exercice, comme des changements de comportement alimentaire, l’activité locomotrice et sommeil, peuvent également être mesurés à l’aide d’outils comme le CAFE dosage29 ou l’activité surveillance appareils12,15 ,,30. Changements dans l’expression des gènes et attribués à l’exercice de la respiration cellulaire peuvent également être quantifiées à l’aide de méthodes telles que qRT-PCR11 et respirométrie31. Enfin, la drosophile ont précieuses ressources génétiques disponibles, comme la drosophile génétique référence panneau 2 et la ressource drosophile de Population synthétiques qui permettent aux chercheurs de la plate-forme pour effectuer des études génétiques quantitatives25,32. Ces outils permettent des expériences de cartographie, comme la cartographie Genome-Wide Association études et Quantitative Trait Loci, d’identifier les locus candidats associés à l’alimentation et l’exercice.
Études réalisées à l’aide de la médiévale a démontré que, en moyenne, exercice diminue de poids corporel, stockage total de triglycéride et glycogène, tout en augmentant la teneur en protéines et escalade performance11. En outre, il y avait des réponses variables d’exercer à travers les sexes et les génotypes de poids corporel, ainsi que de triglycérides, protéine, glycogène, de glucose et activité niveaux11,15. Alors que la variabilité de la réponse d’exercer et de régime entre génotypes et le sexe peut-être être difficile à interpréter et, parfois, contraire à l’intuition, il reflète les sources de variation réelle biologique observée dans les populations naturelles. Car nous nous efforçons de comprendre la diversité des facteurs sous-jacents qui contribuent à des taux élevés de MetS, des outils qui facilitent la démêler le rôle relatif des différents facteurs qui contribuent en testant ces facteurs en organismes modèles sera crucial pour nous permettre de pour élaborer des interventions de prévention et de traitement personnalisées. Pour évaluer pleinement l’efficacité de l’exercice, chacun de ces facteurs et leur interaction doit être considérée lorsque les expériences de conduite et de formuler des conclusions.
Le TW, comme la plupart des autres ergomètres mouche, est limité dans sa capacité à quantifier fly motion. Récemment, Watanabe et Riddle développé la rotation exercice Quantification système (REQS), un squelette TW modifié avec une activité de surveillance unit (LAM25H) du système de surveillance de Drosophila série15,21. Comme le TW, ce système utilise un mouvement rotatif pour amener doucement exercice tout en utilisant le bras LAM25H pour dépister et quantifier l’activité des mouche, mais il possède un plus petit nombre de fioles (32 fioles) que le TW15. Pour les études de l’exercice de haut-débit, si la quantification de l’activité n’est pas nécessaire ou souhaité, le TW permet pour un plus grand nombre d’échantillon. La conception TW pourrait aussi être modifiée depuis sa forme actuelle pour accueillir un plus grand nombre de flacons. Ce système, ainsi que d’autres méthodes existantes de l’exercice, ont permis d’établir que l’exercice n’est pas seulement réalisable chez la drosophile mais peut également être étudié afin de déterminer l’effet de l’activité physique sur une variété de réactions physiologiques et moléculaires 11,12,15. Ainsi, le TW, comme une méthode éprouvée d’induire des exercices légers chez les mouches, peut être utilisé pour détecter une grande variété de questions biologiques.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish et le reste du laboratoire Reed pour leur aide à l’élevage mouche et traitement de l’image. Sean Mendez construit l’origine médiévale avec l’aide de l’atelier d’usinage UAB. Cette étude a été financé par le NIH R01 GM 098856 LKR, la créativité de premier cycle et Académie de recherche à l’Université d’Alabama à KEL et ÉCHER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for TreadWheel Construction: | |||
| Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount | McMaster-Carr | 60855K71 | Quantity: 4 |
| Stainless Steel Ball Bearing | McMaster-Carr | 57155K306 | Quantity: 8 |
| Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) | McMaster-Carr | 70235K16 | Quantity: 1 |
| Compact Square-Face DC Gear motor | McMaster-Carr | 6409K23 | Quantity: 1 |
| Tool Holder (clamps) | McMaster-Carr | 1723A22 | Quantity: 5 (10x) |
| 12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod | McMaster-Carr | 5227T24 | Quantity: 1 |
| Set Screw Shaft Collar | McMaster-Carr | 6432K13 | Quantity: 8 |
| Round-Belt Pulley | McMaster-Carr | 6284K51 | Quantity: 5 |
| Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor | McMaster-Carr | 13DV 1A | Quantity: 1 |
| Materials for Fly Maintenace and Husbandry | |||
| 6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) | Genesee Scientific | 32-130 | Quantity: 1 |
| 35x10mm Petri Dishes | VWR | 82050-536 | Quantity: 1 |
| Narrow Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-116 | Quantity: 1 |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | Quantity: 1 |
| Blowgun, Mini | Genesee Scientific | 54-104 | Quantity: 1 |
| Materials for RING-like Assay: | |||
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Quantity: 1 |
| 1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) | various | Quantity: 1 | |
| digital camera with timer or smart phone with camera timer app | various | Quantity: 1 | |
| Materials for Triglyceride Assay: | |||
| Dewar Flask | VWR | 14200-960 | Quantity: 1 |
| Serum Triglyceride Determination Kit | Sigma Aldrich | TRO100 | Quantity: 1 |
| Cordless Pestle Motor | VWR | 47747-370 | Quantity: 1 |
| Pestles | VWR | 47747-358 | Quantity: 1 |
References
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