Summary
TreadWheel bruker roterende bevegelse å forsiktig indusere øvelse i voksen Drosophila melanogaster ved å utnytte fluer medfødt, negative geotaxis. Det tillater for analyse av samspillet mellom trening og faktorer, for eksempel genotype, sex, og diett og deres innvirkning på fysiologiske og molekylære analyser å vurdere metabolske helse.
Abstract
Forekomsten av komplekse metabolske sykdommer har økt som følge av en utbredt overgangen mot livsstil økt kalori inntak og senket aktivitetsnivå. Disse multifaktoriell sykdommer oppstår fra en kombinasjon av genetisk, miljø- og atferdsmessige faktorer. En slik komplisert sykdom er Metabolsk syndrom (MetS), som er en klynge av metabolske forstyrrelser, inkludert hypertensjon, hyperglykemi og abdominal fedme. Trening og kosttilskudd intervensjon er de primære behandlingene anbefalt av leger å redusere fedme og dens påfølgende metabolske sykdommer. Øvelse intervensjon, spesielt aerobic intervalltrening, stimulerer gunstige endringer i felles risikofaktorer for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), hjerte sykdom (CVD) og andre forhold. Tilstrømningen av bevis har som beskriver den terapeutiske effekt øvelsen på metabolske helse, etablere et system som modeller trening i en kontrollert setting gir et verdifullt verktøy for å vurdere effekten av trening i eksperimentell sammenheng. Drosophila melanogaster er et flott verktøy for å undersøke de fysiologiske og molekylære endringene som følge av trening intervensjon. Fluene har kort lifespans og lignende mekanismer metabolizing næringsstoffer i forhold til mennesker. For å indusere øvelse i Drosophila, utviklet vi en maskin som kalles TreadWheel, som utnytter fly's medfødte, negative geotaxis tendens til å indusere forsiktig klatring. Dette gjør at forskere å utføre eksperimenter på store kohorter av genetisk ulike fluer å forstå genotype-av-miljø samhandlingene underliggende effekten av trening på metabolske helse.
Introduction
Barndom og voksen fedme vokser epidemier i kulturer som bruker høy kalori dietter og være inaktiv over lengre tid, som kan føre til alvorlig langsiktige konsekvenser, herunder insulinresistens, kronisk betennelse og slitasjegikt 1 , 2 , 3 , 4. utbredelsen av disse lidelser fortsetter å stige på grunn av den voksende ubalansen i kaloriinntaket og utgifter til opphøyet forbruk av fett og sukker og en hovedsakelig stillesittende livsstil5. Tilsvarende har ubalansen energi ført til en økning i tilfeller av Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) og hjerte sykdom (CVD)5. Individer har høyere risiko for å utvikle begge lidelser hvis de har blitt diagnostisert med sykdommen Metabolsk syndrom (MetS), som har symptomer inkluderer abdominal fedme og dyslipidemi2. MetS er formet av komplekse samspillet mellom genotype og ulike miljømessige faktorer, som kosthold og mosjon6. Derfor, for å få en full forståelse av de underliggende mekanismene denne komplekse sykdommen, alle disse faktorene bør vurderes.
Når det gjelder bekjempelse MetS, anbefale leger først gjennomgår livsstilsendringer som inkluderer å spise et sunt, balansert kosthold og fysisk aktivitet2,7,8. Siden effektive medisiner er begrenset og gastric bypass operasjon er dyrt og krever livslang medisinsk overvåking, anbefales farmakologiske og kirurgisk inngrep bare for alvorlige tilfeller og i kombinasjon med disse livsstilsendringer3 ,7,8. Mens livsstil intervensjoner, som trening og slanking, kan produsere og opprettholde langsiktig vekttap mål, må hvorvidt disse korrigerende tiltak kan fullt bøte negative effekter knyttet MetS lære7, 8.
Musen modeller har blitt brukt til å undersøke effekten av trening på metabolske sykdommer i år; innføring av trening fly forskning på MetS er imidlertid en relativt ny forsøke9,10,11,12. Fluer gir den perfekte bilen for å studere trening i en kontrollert laboratorium, siden de er lett manipulert, har en kort levetid, er billig å opprettholde, og energi-relaterte metabolske veier er svært bevart mellom Drosophila og mennesker13. D. melanogaster genomer blir godt preget, og det er et vell av genetikk verktøy tilgjengelig for bruk i Drosophila som kan gi innsikt i ulike genotyper og genotype-av-miljø interaksjoner som kunne modulerer til effekten av trening på organismebiologi helse14.
Aktuelle metoder for trening Drosophila påkalle fly's medfødte, negative geotaxis tendenser, atferdsmessige instinkt å klatre oppover, å stimulere klatring i voksne i deres vedlegg11,12,15 . Power tårnet, en metode å stimulere øvelse i fluer, reiser systematisk fly vedleggene vertikalt og deretter faller dem tilbake til benken overflaten, effektivt slå fluene til bunnen av hetteglass, dermed indusere deres instinktive negative geotaxis 12 , 16. eksperimenter utført med denne maskinen viste at øvelsen er en kraftig beskyttende faktor mot mange alder-relaterte sykdommer, inkludert CVD og T2DM, og fremmer sunn aldring12,17,18 . Spesielt vist de at trening kan redusere utbruddet av alder-relaterte mobilitet nedgang i fluer og forbedre flere alder-relaterte symptomer som cardiac ytelse og stress respons17,18. Men flyr kontroll aldri plassert på tårnet viste høyere klatring score enn de opplever maskinen, tyder kraft av gjentatte dråper kan være skadet fluene og påvirke mobilitet12. Dette tyder på at en alternativ metode for å indusere øvelse som er mindre sterkere og unngår fysiske traumer ville være en nyttig og utfyllende til Power Tower protokollen16.
For å indusere forsiktig øvelse i Drosophila, utviklet vi en øvelse machine kalt TreadWheel (figur 1). TreadWheel er (heretter forkortet til TW) roterende bevegelse utløser fluene medfødt, negative geotaxis tendens av stadig redefinere gravitasjons øverst hetteglass, som igjen stimulerer klatring i fluene. I motsetning til andre metoder er roterende bevegelse av TW iboende milde, som minimerer antall ekstra stressfaktorer som kan oppstå og påvirke resultatene. Dermed gir maskinen midler til å indusere øvelse i stort antall fluer uten å indusere stress, noe som vil muliggjøre forskere til å studere virkningene av øvelse metabolsk helse (figur 2), aldring, sove og mange andre emner11.
Vår metode følger en invers pyramideformet, intervall trening-protokollen, som hovedsakelig inneholder aspekter av aerobic intervalltrening (AIT) med noen utholdenhet trening trening. Standard AIT regimet endres i denne protokollen til å gradvis øke varigheten av hvert intervall over en fem-dagers periode å fremme utholdenhet. AIT er spesielt nyttig i å forebygge MetS i forhold til andre og effektiv mer reversere Metabolsk syndrom felles risikofaktorer enn kontinuerlig moderat trening19,20. En ulempe av TW i forhold til makt tårnet er imidlertid at flyr raskt venne til roterende bevegelse, dermed variasjon i medfødte tendens til å venne blant fluene kan komplisere tolkningen av fordelene ved trening. 11 en elegant løsning på denne begrensningen beskrives av Watanabe og gåten15 og deres utfyllende artikkel21.
Protocol
1. TreadWheel installasjon og drift
Merk: Se supplerende figur 1 for skjemaer på TW utøve maskinbygging. Påkrevde deler er oppført i Tabellen for materiale. Setninger "T", "TreadWheel", "øvelse machine" og "maskin" brukes om hverandre i protokollen.
-
Kalibrere motor med strømbryteren slik at en full rotasjon er 15 s (4 rpm). Kalibrere maskinen rotasjonshastighet før du plasserer fly ampuller i sikret klemmer knyttet til roterende armer.
- Justere hastigheten ved hjelp av en standard stoppeklokke og immobile objektets midlertidig festet til datamaskinen, som en liten pensel teipet til dekselet med pensel bare trykke på en av roterende parentesene. Tid antall rotasjoner i ett minutt med immobile objektet som et referansepunkt og justere hastigheten for å oppnå en 15 s roterende periode (4 rpm).
2. fly samling og vedlikehold
Merk: Alle fluer vedlikeholdes i en 25 ° C inkubator med 50% fuktighet og en 12 h lys/mørke syklus mellom Borstemmaskin manipulasjoner beskrevet nedenfor. Fluene er matet en standard cornmeal-melasse lab diett ikke annet er oppgitt.
-
Forberede legging kamre for hver genotype rundt med eplejuice agar plater, en dråpe gjær lim per plate, og 6 oz. plastflasker å samle egg som vil luke i larvae.
- Å forberede eplejuice agar plater, fylle 35 x 10 mm Petri retter ¾-full med 3% agar oppløst i Beef eplejuice. Lagre befestet plater i kjøleskap før bruk.
- I en 50 mL konisk sentrifuge tube, kombinere Beef tørrgjær med destillert vann i forholdet 2 mL vann hver gram av gjær. Mix gjær med vann for å lage en lime med konsistensen av ketchup med et glass røring stang. Justere gjær og vann proporsjoner for å oppnå ønsket konsistens.
- Lagre gjær lim i kjøleskap mellom bruker. Holde røret hetten løs å tillate de gassing.
- Bruk en skarp nål eller kniv for å slå små hull i den 6 oz. square bunn flasker (polypropylen) som ventilasjonshull for legging kamrene.
- DAB en liten flekk gjær lim (~ 3 mm i diameter) på hver eplejuice agar plate.
- Plass voksen flyr av ønsket genotype i 6 oz. flaske og cap flasken med eplejuice agar platen. Sikre platen til flasken med gummistrikk. Inverter, og plasser i en inkubator å tillate voksne å legge egg.
- Endre eplejuice agar plater på en legging kammer to ganger om dagen (morgen og kveld). La brukes plater i inkubator for en annen 12-24 h å tillate først skikkelsen Larvene å klekkes.
- Samle først skikkelsen Larvene bruke en tynn pensel eller samling pick (fleksibel tynn nål knyttet til et håndtak). Sted 50 første skikkelsen larver av et bestemt genotype på mat ampuller med ønsket eksperimentelle mat type å utvikle og fullstendig forvandling mens ligger i inkubator (figur 2A).
-
Samle voksne for trening behandling (figur 2A).
- På pupation, samle pupae med en liten, fuktig pensel og plasser i tomme flasker før eclosion å forhindre voksen fluer blir utsatt for larver diett.
- Overføre voksen flyr til mat ampuller av standard lab kosthold som de lille. Ett til fem dager etter eclosion, skille fluer basert på kjønn.
- Angi halvparten av de innsamlede voksne hver til den eksperimentelle og kontroll grupper. Opprettholde fluer i ampuller av standard lab diett i en konsentrasjon av 50 fluer per medisinglass.
- Overføre voksne til fersk mat ampuller hver to dager for å hindre dem i å bli sittende fast under trening. Legge til flere korn av supplerende levende gjær til nye maten umiddelbart før innføre fluene.
Merk: Det er mulig å opprettholde fluer uten et levende gjær supplement, vi har funnet at voksne fluene utfører best med tilskudd. Levende gjær kosttilskudd er en variabel som kan endres for å passe forskerens eksperimentelle mål.
3. utøve protokollen
- På den første dagen av trening (dag 1) plugger trykk medisinglass for å forlate 1 cm plass i kontroll hetteglassene og 6 cm mellomrom mellom mat og pluggen i øvelsen ampuller (figur 1 c).
Merk: Kontroll hetteglassene har begrenset plass til fluer flytte på øvelse machine og dermed fluer vil delta i mye mindre bevegelse enn i øvelsen hetteglass. - Plasser ampuller i klemmer, og deretter gi fluene 10 min å acclimate på maskinen (figur 1B).
Merk: En alternativ kontroll er å opprettholde de unexercised fluene på Borstemmaskin tilstøtende treningsapparatet med 6 cm plass (i ampullen) for å flytte normalt. Lignende resultater trening både "1 cm på TreadWheel" og "6 cm på Borstemmaskin" kontrollene har blitt funnet11. -
Behandle både kontroll og øvelse fluer rotasjon på maskinen på konstant romtemperatur for 5 dager per uke med vekslende anfall av rotasjon og resten (figur 1D).
Merk: En konstant temperatur er nødvendig for å unngå forvirrende virkninger av temperaturen på aktivitetsnivå. For temperatur manipulasjon studier, plassere TW inne en inkubator for å endre temperaturen behandlinger under trening.- Kjøre maskinen for fire 15 min anfall av trening på dag 1. Alternative disse kampene med 5 min hvileperioder.
- Hver av de følgende dagene, legge 5 min trening til en av de eksisterende trening kampene. For eksempel på dag 2, gjøre den første øvelse bout 20 minutter lang, men opprettholde resten av kampene på 15 min lenge.
- På dag 3 flyr øvelse for 20 min i løpet av de første to kampene og 15 minutter for de følgende to kampene.
- På dag 4, bruke 20 min trening kamper for alle unntatt siste kampen, som skal bare 15 min lenge.
- På dag 5 holde alle øvelse utbrudd 20 min lenge.
Merk: Under hvileperioder, hetteglass med fluene bør være sikkert festet på TW. Retningen til ampullene i disse periodene er ikke relevant fordi kraft oppleves av alle fluer kommer fra samme retning.
- Etter endt trening behandling for en gitt dag, returnere mat medisinglass pluggene normal plassering og tilbake fluer til deres inkubatorer før neste dag.
- Etter ferdigstillelse av hele øvelsen regimet, bedøve fly flyr ved hjelp av standard CO2 anestesi metoder. Deretter overføre flyr til nye mat ampuller eller microcentrifuge rør for vurdering av fenotypiske egenskaper av interesse.
Merk: Eksempel fenotyper inkluderer klatring evne (mat medisinglass), triglyserider lagring (microcentrifuge rør) eller genuttrykk (microcentrifuge rør). Protokollen kan pauses her med prøver lagret riktig avhengig av vurderingene skal utføres. Analyser med levende fluer må utføres umiddelbart i samsvar med spesifikke mål til fenotypiske analysen.
4. klatring vurdering
-
Etter en dag med hvile etter trening protokollen, teste generelle fly klatring ytelse ved hjelp av en rask iterativ negative geotaxis (RING)-som negative geotaxis klatring analysen22.
- Sett grupper av 10 fluer i tomme flasker bruker CO2 anestesi (eller trykke direkte fra mat ampuller hvis allerede sortert) og forsegle med parafin film å hindre fluene fra å rømme. Gi fluer minst 10 min acclimate til nye ampullen. For å hindre ampuller velter, tape en ~ 5 cm diameter kartong sirkel til bunnen av ampullen å gi ekstra areal.
Merk: Vial plugger bør ikke brukes fordi de hindrer del av ampullen brukes til å fastslå høyden klatret. - Plassere ampuller 20 cm foran et 1 cm x 1 cm rutenett i full visning av en montert, stasjonære kameraet med en innebygd timer (en smart telefon med en classes kamera programmet fungerer godt).
- Trykk ampuller forsiktig på teller tre ganger å slå alle flyr ned til bunnen av ampullen. Etter tappe ampullen ned tredje gang, starte umiddelbart 4 s kameraet tidtakeren å fange et bilde for å bestemme høyden klatret av hvert fly.
Merk: Tappe bør gjøres med konsekvent intensitet og samme forskeren i hver øvelse-kontroll kontrast å minimere variasjon i fluene svar på grunn av trykke. - Gjenta trinn 4.1.3 to ganger, med minst 1 min hvile mellom studier, totalt tre forsøk per medisinglass.
- Sett grupper av 10 fluer i tomme flasker bruker CO2 anestesi (eller trykke direkte fra mat ampuller hvis allerede sortert) og forsegle med parafin film å hindre fluene fra å rømme. Gi fluer minst 10 min acclimate til nye ampullen. For å hindre ampuller velter, tape en ~ 5 cm diameter kartong sirkel til bunnen av ampullen å gi ekstra areal.
-
For å bevare fluene for andre analyser, umiddelbart etter klatring analysen er fullført, flash fryse fluene ved nedsenkning i flytende nitrogen.
- Bruk en grunne, åpen-topped dewar kolbe fylt til en dybde på ~ 5 cm med flytende nitrogen.
- Overføre flyr til små microcentrifuge rør med CO2 anestesi og plasser rør i dewar flasken fylt med flytende nitrogen. Hvis fremtidige analyser krever unngåelse av CO2, fryse eventuelt snapin fluene direkte i deres klatring ampuller av trykke forsiktig flyr til bunnen av deres medisinglass mens bunnen er neddykket i flytende nitrogen, og deretter overføre de frosne flyr til microcentrifuge rør ved hjelp av pinsett.
Merk: Flytende nitrogen er kryogene og bør bare brukes med riktig beskyttende utstyr og rom ventilasjon.
-
Behandle bilder ved hjelp av ImageJ23 multi-Point markeringsverktøyet.
- Åpne opp et bilde til behandling innen ImageJ.
- Angi en 1 cm skala basert på bakgrunnen rutenettet papir å beregne avstanden klatret av hver individuelle fly. Verktøyet "linje" fra verktøylinjen spor én side av en 1 cm2 firkant fra bakgrunnen rutenettet papir. Klikk på kategorien "Analysere" og velg "Angi skala". Angi "Kjent avstand" "1.00" og "Enhet av lengde" som 'cm', kontrollere at "Global" er merket, og klikk på "OK".
- Velg ikonet "Multi-point valg" fra verktøylinjen og zoome inn på bunnen av ampullen i bildet. Angi det første punktet som bunnen av ampullen ved å klikke på den nederste delen av ampullen.
- Klikk på midten av hver fly i ampullen du merke den som et datapunkt. Ta oppmerksom på at det er totalt 11 poeng per medisinglass, en merking bunnen av ampullen og for hvert fly.
- Klikk på kategorien "Analysere" og velg "Tiltak" for å generere en tabell med målte verdier. Lagre tabell i som en csv-fil.
- Åpne csv-filen i et regnearkprogram og beregne den nøyaktige avstanden klatret av hvert fly ved å trekke y-verdiene poeng 2-11 fra punkt 1 i tabellen måleverdiene.
- Gjenta trinn 4.3.1 gjennom 4.3.6 for hvert bilde.
5. triglyceride lagring analysen
Merk: Den prøver, standarder, glyserol standard løsning og triglycerol arbeidsoppløsning brukes i hele analysen bør holdes på is for varigheten av protokollen og skal lagres i kjøleskapet når den ikke er i bruk.
-
Klargjør standarder med glyserol Standard løsningen.
- Gjøre den tomme (B) ved å legge 1000 µL homogenisering bufferen slik microcentrifuge merket B.
- Gjøre Standard 1 (S1), 2,5 mg/mL per brønn, ved å legge 1000 µL av glyserol standard løsningen slik microcentrifuge merket S1.
- Kontroller Standard 2 (S2), 1,25 mg/mL per brønn, ved å legge 500 µL av glyserol standard løsningen til 500 µL av di2O i et microcentrifuge rør merket S2.
- Kontroller Standard 3 (S3), 0.625 mg/mL per brønn, ved å legge til 250 µL av glyserol standard løsningen 750 µL av di2O i et microcentrifuge rør merket S3.
- Kontroller Standard 4 (S4), 0.3125 mg/mL per brønn, ved å legge til 125 µL av glyserol standard løsningen 875 µL av diH20 i et microcentrifuge rør merket S4.
-
Forberede triglycerol fungerende løsning fra Serum Triglyceride besluttsomhet Kit.
- Legge til 40 mL di2O gratis glyserol reagensen fra kit og bland ved å snu flaske.
- Tilsett 10 mL di2O triglyserider løsningen fra kit og bland ved å snu flaske.
- Kombiner glyserol reagens og triglyserider løsning og bland ved å snu for å forberede triglycerol fungerende løsning.
Merk: Triglycerol arbeider løsningen er bra for 60 dager og kan fullføre fire 96-brønns plate analyser per kit med protokollen nedenfor. Volumene brukes skaleres proporsjonalt fra offisielle Serum Triglyceride besluttsomhet kit for bruk i 96-brønnen plate format.
-
Bekrefte tom og standarder ved nøye pipettering 5 µL av hver standard i en 96-brønns flat bunn, klart microplate i tre eksemplarer (eller quadruplicate for tomt).
- Legge til nøyaktig 125 µL Triglycerol arbeider løsning hver også inneholder et standard. Tillate løsninger å reagere i 30 min.
- Plasser en 96-brønns plate i et spektrofotometer og lese absorbans ved 540 nm. Bruk absorbansen målene til å opprette en standard kurve og bekrefte riktigheten av standarder ved å evaluere R2 -verdien. Hvis de R2 for standarder er mindre enn 0,98, nytt klargjør standarder mer forsiktig.
-
Starte dag 1 av analysen for triglyserider lagring14 bruker microcentrifuge rør som inneholder 10 frosset flyr hver.
Merk: En gjenta eller multikanaler pipette bør aldri brukes i dette trinnet fordi beløpene for hver reagens som brukes i analysen må være svært nøyaktig og konsekvent å få reproduserbar resultater. I vår erfaring har gjenta og flerkanals Pipetter ikke denne graden av nøyaktighet og konsistens. Hver aliquot fra en enkelt kanal pipette visuelt kan bekreftes av eksperimentator for kvalitetskontroll og noen enkeltkanals pipette-spesifikke biases skal oppleves av alle prøver til samme grad.- Forberede en 200 mL lager homogenisering bufferen ved å kombinere 0.272 g KH2PO4, 400 µL av 0,5 M EDTA, og 199.6 mL av di2O i ett glassflaske.
- Legge til nøyaktig 100 µL homogenisering bufferen til hver av de 40 microcentrifuge rør som inneholder 10 voksne frosne etter klatring analysen. Deretter sentrifuge prøver for 30 s 18.000 g.
- Grind flyr en motorisert jeksel og pistil (eller en annen form for vev homogenisering) for å forberede en melkeaktig løsning. Kontroller at en fersk støter brukes for hvert utvalg. Deretter sentrifuge prøver for 2 min 18.000 g.
- Pipetter bare toppen 75 µL supernatant væske fra hver rør i nye microcentrifuge rør. Kontroller at ingen fly biter fra pellet overføres. Plasser nye rør i kjøleskapet over natten.
-
Starte dag 2 av triglyserider-protokollen ved å fjerne dag 1 prøver fra kjøleskapet.
Merk: Trinn 5.5 kan utføres samme dag som 5.4, men vi har funnet signalet for triglyserider konsentrasjon å være mer robust etter en natt i kjøleskapet. Men bør tiden mellom trinnene 5.4 og 5.5 ikke overstige 36 h.- (Valgfritt) Vortex første røret med supernatant væske for 10 s og pipette 5 µL inn i et rent microcentrifuge rør. Legge til 95 µL av 0,15 M NaCl i det nye microcentrifuge røret. Lagre disse underutvalg på 20 ° C fryseren for en senere analyse av protein hvis ønskelig.
Merk: Disse prøvene av nedbryting med ekstra NaCl løsningen kan brukes til å bestemme proteininnhold med forskerens foretrukne analysen. Vi bruker Bradford metoden24. Proteininnholdet er en måte å standardisere mål av triglyserider innhold, men forskeren bør også være forsiktig med å tolke disse forholdene siden trening og kosthold kan også påvirke protein lagring. - For de opprinnelige supernatant ampullene replikerer vortex første røret med supernatant væske for 10 s og pipette 5 µL i to separate brønner for en 96-brønnen microplate å produsere tekniske. Vær sikker på note som brønner brukes for hvert utvalg. Gjenta dette trinnet for 39 andre rør.
- Pipetter nøyaktig 5 µL av tomt i fire brønner i microplate, og de resterende brønner, Pipetter nøyaktig 5 µL av hver standard i tre eksemplarer.
- Legg akkurat 125 µL triglycerol fungerende løsning i hver brønn, og tillate løsning å reagere i 30 min.
- Plasser platen 96-brønnen i et spektrofotometer og lese absorbans ved 540 nm.
- Konvertere absorbansen verdier i konsentrasjon (mg/mL) ved hjelp av standardkurven beregnet fra standardene.
- (Valgfritt) Vortex første røret med supernatant væske for 10 s og pipette 5 µL inn i et rent microcentrifuge rør. Legge til 95 µL av 0,15 M NaCl i det nye microcentrifuge røret. Lagre disse underutvalg på 20 ° C fryseren for en senere analyse av protein hvis ønskelig.
Representative Results
Vi er spesielt interessert i å identifisere hvilke faktorer som bidrar til en individuell samlet metabolske helse. Tidligere ble det funnet at genotype av kosthold interaksjoner bidrar vesentlig til befolkningen nivå variasjon i metabolske egenskaper14. Dette betyr at hver genotype reagerer på miljømessige forskjeller i en unik og komplisert måte. For å utvide vårt arbeid på genotype av miljøeffekter med fysisk trening, utviklet vi TreadWheel, som er i stand til å utsette stort antall genotyper å aerobic intervalltrening (AIT) på en måte som høy gjennomstrømming.
For å etablere om trening på TW påvirket metabolske trekk, vi målt triglyserider lagring i Oregon-R (OreR) og y1m1 flyr, felles wildtype fluer (figur 2B-C), og normalisert verdiene mot fluene protein konsentrasjon, som opprinnelig rapportert i Mendez et al. 11. vi analyserte data av multivariabel analyse av varians (MANOVA) regnskap for genotype, sex, utøve behandling (og deres samspill), og eksperimentelle blokk effekter som tid gjentak og mat medisinglass og fant at det var en betydelig genotype-av-øvelse interaksjon (p = 0.0017) påvirker triglyserider lagring. Det var en betydelig seksuell dekket av hvit effekt mellom menn og kvinner, med hanner lagrer mer triglyserider enn kvinner (p < 0,0001). Vi så at kvinner, utøves fluer hadde betydelig lavere triglyseridnivåer enn sine unexercised kolleger (figur 2B, p < 0,0001). Menn, mens nedgangen i triglyserider lagring i Oregon-R utøves fluer (sammenlignet med kontroller) var ikke statistisk signifikant, en betydelig forskjell i triglyserider lagring ble observert mellom de to separate linjene (figur 2C, p < 0,0001). Merk at mens standardisere triglyserider konsentrasjon mot protein konsentrasjonen gir innsikt på samlet fly kroppen sammensetning prosenter, sammenligning av direkte triglyserider eller protein konsentrasjon blant forskjellige grupper av fluer kan også gi informasjon om effekten av trening på disse fenotyper individuelt.
Siden variabler som voksen trening, sex, og genotype er vist å påvirke triglyserider lagring, var det ventet at disse faktorene også påvirke andre fenotyper og samhandle med kosthold. Vi hevet larver fra en representant wildtype Drosophila genetisk referanse panelet linje (DGRP 153)25 på enten en høy fett eller normale kosthold og indusert øvelse i voksen fluer i en uke (figur 2A). Senere utført vi en RING som negative geotaxis analysen for å måle klatring evne. Klatring analysen brukt forskjellig fra en standard RING analysen; i stedet for en RING apparater, ampuller med parafin film dekker åpningene ble brukt til å huse fluene under analysen. Andre aspekter av opprinnelige RING analysen, for eksempel trykke fluene til bunnen av ampullen og tar bildet, ble beholdt22.
Alle behandlingene ble gjentatt tre separate ganger med et minimum av 59 personlige fluer per gang replikere og behandling. Dataene ble analysert av MANOVA regnskap for kosthold, genotype, sex, behandling (og deres samspill), samt eksperimentelle blokkere effekten av tid replikere analysen medisinglass og medisinglass analysen replikere. Vi fant at utøves kvinner klatret betydelig høyere (p < 0.005) når bakside på høy fett diett enn noen av de andre kvinnelige behandlingene (figur 2D). For menn, ble det sett at øvelsen bare forbedret klatring når menn ble reist på normal diett, og de reiste på høy fett diett viste ingen betydelig endring (figur 2E). Vi fant også betydelige dekket av hvit effekter (p < 0,0001) i klatring med menn klatre høyere enn kvinner. Overraskende resultatet av en nedgang i klatring ytelse etter trening for kvinner fra DGRP 153 linje (figur 2D) for kvinner bruker et normalt kosthold (p < 0,0001) er et eksempel på hvordan denne type trening kan ikke være en jevnt positiv intervensjon for alle genotyper og kan være betinget av andre miljøfaktorer. I Mendez et al. 11, kvinner fra fire andre genetisk linjer testet for deres klatring ytelse etter å ha blitt reist på en normal diett alle viste forbedret klatring evne med trening. Dette tyder på at svaret i DGRP 153 er genotype-spesifikke og ikke en generell egenskap i TW trening behandling. Variasjon svar sex, kosthold og mosjon behandlingsgrupper viser at det er betydelig sex-av-diett-av-trening interaksjoner som påvirker klatring evnen til linjen (p < 0,0001).
Sammen indikerer resultatene at effekten av trening på en voksen fly metabolske helse kan være en funksjon av sex, undersøke, og larver kosthold. Fenotypiske variasjonen observert svar genotype, miljøvariabler (f.eks, kosthold og mosjon) og sex har også blitt observert i andre studier11,12,14,15. Dermed kan TW og Drosophila være en kraftig strategi for å belyse de genetiske og miljømessige faktorene forme metabolske helse.
Figur 1 : The TreadWheel øvelse machine. (A) maskinen har 48 ampuller og har en justerbar hastighet-funksjonen. Her ble eksperimenter utført på 4 rpm. (B) personlige mat ampuller med eksperimentelle fluene ble snappet i parentes knyttet til en roterende aksel. (C) avstanden mellom medisinglass plug og mat var 6 cm for trening ampuller og 1 cm for kontroll hetteglassene. Ampullene ble så plassert på maskinen for trening. (D) 5 dagers omvendte pyramide øvelsen regimet ble brukt til å utøve voksen fluer. Hver dag, ytterligere fem minutter ble lagt til en av de trening kampene å rampen opp treningsintensiteten trinnvis, som modeller utholdenhet, intervalltrening. Dette tallet har blitt endret fra Mendez et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Visual metoder og representant resultater. (A) metoder for testing larver kosthold og voksen øvelse samhandling effekter. Larvene ble reist på høy fett eller vanlig laboratoriet kosthold og byttet til vanlig mat på eclosion. Voksne fluene var atskilt med sex, plassert i eksperimentell grupper og utøves i fem påfølgende dager. Etterpå en RING som negative geotaxis klatring analysen var gjennomført, og flyr var frosset for triglyserider målinger. Representant triglyserider data vises to genetisk linjer, Oregon R og y1m1 for kvinner (B) og (C) menn. Alle fluer ble oppdratt i et normalt kosthold og utøves i voksen alder. Med forskjellige bokstaver er signifikant forskjellig (p < 0.05) ved hjelp av en post hoc Student t-test. Dette tallet inneholder et delsett av dataene i Mendez et al. 11. representant klatring data vises for linje DGRP 153 for (D) kvinner og menn (E). Hvert punkt representerer gjennomsnitt klatring ytelsen 232 eller flere individer over tre uavhengige tidspunkt. Feilfelt viser standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: en detaljert skjematisk av TreadWheel. (A) Diagram av dobbelt medisinglass klemme legges ampuller til maskinen. (B) interiør visning av maskinens roterende drivsystem. (C) parallelle projeksjon av maskinens forsiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra filen: TreadWheel.skp Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Trening protokollen finnesher har vist seg å kunne stimulere mild øvelse i Drosophila og kan brukes til å simulere utholdenhet trening i et kontrollert laboratorium sette11. Det bør bemerkes at når først utvikle TreadWheel konseptet, vi betraktet som kan endres for å utføre tilsvarende (f.eks, en laboratorium drikke). Men, vi til slutt avvist denne velge spesialbygde design fordi kommersielle utstyret ikke har en tilstrekkelig lav rotasjonshastighet (4 rpm) og manglet medisinglass kapasitet for høy gjennomstrømming eksempel generasjon.
TW protokollen kan justeres for å omfatte en rekke forskningstema. For eksempel kan justere hyppighet og varighet av fluene trening regimer endre intensitet arbeid-outs de mottar. Ved å utvide protokollen lenger enn en uke eller andre aldersgrupper, ville det være mulig å studere virkningene av trening på aldring og ulike alder-relaterte sykdommer. Det anbefales at hvis en utvidet øvelse tilnærming er implementert, deretter minst en hviledag per uke skal legges slik at utvinning. Ytelse og forbedring viste seg å være større i regimer som inkludert gjenoppretting dag enn de regimer som brukes fortløpende daglig mosjon12. Også ville vi forsiktig mot utvide øvelse bout lengder siste 30 min siden habituering til roterende bevegelse kan forekomme etter lange perioder med kontinuerlig utøve11. Vi har også observert genetisk variasjoner i fluer motivasjon til å opprettholde deres aktivitetsnivå TW11. Hvis lengre perioder er ønskelig, vurderes overvåking fluene aktivitetsnivå, som presenteres av Watanabe og gåten15,21 beskriver endringen av TW konseptet. Andre faktorer som kan varieres inkluderer temperatur og sove-våkne mønstre, som er vist å påvirke fly bevegelser26,27.
Det er en mengde tilgjengelig analyser under og etter protokollen å håndtere virkningene av trening på fysiologiske, atferdsmessige og molekylære nivået, samt potensial til å rakne epigenetic effekten av trening. Flere metabolske analyser (f.eks glukose, glykogen og protein), hjertestans ytelse og betennelsesreaksjon tiltak kan brukes å utforske mer effekt øvelsen har på fly fysiologi og kropp komposisjon12,14 ,24,28. Ulike opptreden endre forbundet med trening induksjon, for eksempel endringer i fôring atferd, locomotor aktivitet og søvn kan også måles ved hjelp av verktøy som CAFE analysen29 eller aktivitet overvåking enheter12,15 ,30. Endringer i genuttrykk og cellular respirasjon tilskrives trening kan også kvantifiseres bruker metoder som qRT PCR11 og respirometry31. Endelig har Drosophila verdifull plantegenetiske ressurser tilgjengelig, som Drosophila genetikk referanse panelet 2 og Drosophila syntetiske befolkningen ressursen som gir forskere plattformen utføre kvantitative genetiske studier25,32. Disse verktøyene gjør kartlegging eksperimenter, som genomet hele Association studier og kvantitative egenskap Loci kartlegging, identifisere kandidat loci forbundet med trening og kosthold.
Studiene fullført i TreadWheel viste at gjennomsnittlig øvelse reduserer kroppsvekt, totalt triglyserider lagring og glykogen, mens øke proteininnhold og klatring ytelse11. I tillegg var det variabel Svar å utøve over kjønn og genotyper for kroppsvekt, samt triglyserider, protein, glykogen, glukose og aktivitet nivåer11,15. Mens variasjon av respons trening og kosthold over genotyper og sex kan være utfordrende å tolke og, til tider counterintuitive, det gjenspeiler kildene til ekte biologiske variasjon i naturlige populasjoner. Som vi streber etter å forstå mangfoldet av underliggende faktorer som bidrar til høye priser på MetS, vil verktøy som letter disentangling relative rollen ulike medvirkende faktorer ved å teste disse faktorene i modellen organismer være avgjørende for vår evne til utvikle personlig forebygging og behandling intervensjoner. Å fullt ut vurdere effektiviteten av trening, må hver av disse faktorene og hvordan de samhandler vurderes når gjennomfører eksperimenter og formulere konklusjoner.
TW, som de fleste andre fly treningsapparater, er begrenset i sin evne å kvantifisere fly bevegelse. Nylig utviklet Watanabe og gåten den roterende øvelse kvantifisering System (REQS), en TW ryggrad endret med en aktivitet overvåking enhet (LAM25H) fra Drosophila Monitoring System serien15,21. Som TW, dette systemet bruker roterende bevegelse for å indusere forsiktig trening mens du bruker LAM25H armen spore og kvantifisere fly aktivitet, men den har et mindre antall ampuller (32 flasker) enn TW15. Hvis aktivitet kvantifisering ikke er nødvendig eller ønsket, kan TW for høy gjennomstrømming Øvelse studier, for eksempel flere. TW design kan også endres fra sin nåværende form til et større antall hetteglass. Dette systemet, sammen med andre eksisterende øvelses metoder, bidro til å etablere at trening er ikke bare oppnåelig i Drosophila men også kan studeres for å fastslå effekten av fysisk aktivitet på en rekke fysiologiske og molekylære svar 11,12,15. Dermed kan TW, som en velprøvd metode for å indusere mild øvelse i fluer, brukes å undersøke en rekke biologiske spørsmål.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish og resten av Reed laboratoriet for deres hjelp med fly husbandry og bildebehandling. Sean Mendez bygget den opprinnelige TreadWheel med assistanse fra UAB maskin butikk. Finansiering for denne studien ble levert av NIH-R01 GM 098856 til LKR og lavere kreativitet og forskning Academy ved University of Alabama KEL og BJW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for TreadWheel Construction: | |||
| Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount | McMaster-Carr | 60855K71 | Quantity: 4 |
| Stainless Steel Ball Bearing | McMaster-Carr | 57155K306 | Quantity: 8 |
| Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) | McMaster-Carr | 70235K16 | Quantity: 1 |
| Compact Square-Face DC Gear motor | McMaster-Carr | 6409K23 | Quantity: 1 |
| Tool Holder (clamps) | McMaster-Carr | 1723A22 | Quantity: 5 (10x) |
| 12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod | McMaster-Carr | 5227T24 | Quantity: 1 |
| Set Screw Shaft Collar | McMaster-Carr | 6432K13 | Quantity: 8 |
| Round-Belt Pulley | McMaster-Carr | 6284K51 | Quantity: 5 |
| Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor | McMaster-Carr | 13DV 1A | Quantity: 1 |
| Materials for Fly Maintenace and Husbandry | |||
| 6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) | Genesee Scientific | 32-130 | Quantity: 1 |
| 35x10mm Petri Dishes | VWR | 82050-536 | Quantity: 1 |
| Narrow Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-116 | Quantity: 1 |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | Quantity: 1 |
| Blowgun, Mini | Genesee Scientific | 54-104 | Quantity: 1 |
| Materials for RING-like Assay: | |||
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Quantity: 1 |
| 1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) | various | Quantity: 1 | |
| digital camera with timer or smart phone with camera timer app | various | Quantity: 1 | |
| Materials for Triglyceride Assay: | |||
| Dewar Flask | VWR | 14200-960 | Quantity: 1 |
| Serum Triglyceride Determination Kit | Sigma Aldrich | TRO100 | Quantity: 1 |
| Cordless Pestle Motor | VWR | 47747-370 | Quantity: 1 |
| Pestles | VWR | 47747-358 | Quantity: 1 |
References
- Yanovski, J. A. Pediatric obesity. An introduction. Appetite. 93, 3-12 (2015).
- Alberti, K. G. M. M., Zimmet, P., Shaw, J. Metabolic syndrome-a new world-wide definition. A Consensus Statement from the International Diabetes Federation. Diabetic Medicine. 23, 469-480 (2006).
- American Diabetes Association. 6. Obesity Management for the Treatment of Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 39, Suppl 1 47-51 (2016).
- Bliddal, H., Leeds, A. R., Christensen, R. Osteoarthritis, obesity and weight loss: evidence, hypotheses and horizons - a scoping review. Obesity Reviews. 15, 578-586 (2014).
- Bray, G. A. The epidemic of obesity and changes in food intake: the Fluoride Hypothesis. Physiol. Behav. 82, 115-121 (2004).
- O'Rahilly, S., Farooqi, I. S. Genetics of obesity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 361, 1095-1105 (2006).
- Kenkre, J., Tan, T., Bloom, S.
- Fiuza-Luces, C., Garatachea, N., Berger, N. A., Lucia, A. Exercise is the Real Polypill. Physiology. 28, 330-358 (2013).
- Matos, A., et al. Acute exercise reverses TRB3 expression in the skeletal muscle and ameliorates whole body insulin sensitivity in diabetic mice. Acta Physiologica. 198, 61-69 (2010).
- Mercken, E. M., Carboneau, B. A., Krzysik-Walker, S. M., de Cabo, R. Of mice and men: The benefits of caloric restriction, exercise, and mimetics. Ageing Research Reviews. 11, 390-398 (2012).
- Mendez, S., et al. The TreadWheel: A Novel Apparatus to Measure Genetic Variation in Response to Gently Induced Exercise for Drosophila. PLoS ONE. 11, 0164706 (2016).
- Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance. PLoS ONE. 4, 5886-5911 (2009).
- Graham, P., Pick, L. Drosophila as a Model for Diabetes and Diseases of Insulin Resistance. Fly Models of Human Diseases. 121, 397-419 (2017).
- Reed, L. K., et al. Genotype-by-Diet Interactions Drive Metabolic Phenotype Variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185, 1009-1019 (2010).
- Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS ONE. 12, 0185090 (2017).
- Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. , (2012).
- Tinkerhess, M. J., et al. The Drosophila PGC-1α Homolog spargel Modulates the Physiological Effects of Endurance Exercise. PLoS ONE. 7, 31633 (2012).
- Sujkowski, A., Bazzell, B., Carpenter, K., Arking, R., Wessells, R. J. Endurance exercise and selective breeding for longevity extend Drosophila healthspan by overlapping mechanisms. Aging. 7, 535-552 (2015).
- Tjønna, A. E., et al. Aerobic Interval Training Versus Continuous Moderate Exercise as a Treatment for the Metabolic Syndrome: A Pilot Study. Circulation. 118, 346-354 (2008).
- Ciolac, E. G., et al. Effects of high-intensity aerobic interval training vs. moderate exercise on hemodynamic, metabolic and neuro-humoral abnormalities of young normotensive women at high familial risk for hypertension. Hypertension Research 2010 33:8. 33, 836-843 (2010).
- Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Measuring exercise levels in Drosophila melanogaster using the Rotating Exercise Quantification System (REQS). J Vis Exp. , (2018).
- Gargano, J., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods 2012 9:7. 9, 671-675 (2012).
- Hammond, J. B. W., Kruger, N. J. New Protein Techniques. 3, 25-32 (1988).
- Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1975).
- Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and Recording Locomotor Activity in a Drosophila melanogaster Model of Alzheimer's Disease. Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).
- Leng, S. X., et al. ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 63, 879-884 (2008).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 8253-8256 (2007).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. , (2010).
- MÖlich, A. B., FÖrster, T. D., Lighton, J. R. B. Hyperthermic Overdrive: Oxygen Delivery does Not Limit Thermal Tolerance in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Science. 12, 1-7 (2012).
- Long, A. D., Macdonald, S. J., King, E. G. Dissecting complex traits using the Drosophila Synthetic Population Resource. Trends in Genetics. 30, 488-495 (2014).
