Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Motionsredskap: Intervall träning protokoll för försiktigt inducerad övning i Drosophila melanogaster

Published: June 8, 2018 doi: 10.3791/57788
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

Summary

Motionsredskap använder roterande rörelse försiktigt inducera övning i vuxen Drosophila melanogaster genom att utnyttja flugor medfödda, negativa geotaxis. Det möjliggör analys av samspelet mellan träning och faktorer såsom genotyp, kön, och kost och deras inverkan på fysiologiska och molekylära analyser att bedöma metabol hälsa.

Abstract

Incidensen av komplexa metabola sjukdomar har ökat till följd av en omfattande övergång till livsstilar ökade kaloriintaget och sänkt aktivitetsnivå. Dessa multifaktoriella sjukdomar uppkommer en kombination av genetiska, miljömässiga och beteendemässiga faktorer. En sådan komplex sjukdom är metabola syndromet (MetS), vilket är ett kluster av metabola sjukdomar, inklusive högt blodtryck, hyperglykemi och bukfetma. Motion och kost intervention är de primära behandlingar som rekommenderas av läkare för att minska fetma och dess efterföljande metabola sjukdomar. Motion ingripande, i synnerhet aerob intervallträning, stimulerar gynnsamma förändringar i de gemensamma riskfaktorerna för typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), kardiovaskulär sjukdom (CVD) och andra villkor. Med tillströmningen av bevis har som beskriver terapeutisk effekt träningen på metabola hälsa, om inrättande av ett system som modeller utöva i en kontrollerad miljö ger ett värdefullt verktyg för att bedöma effekterna av motion i experimentella sammanhang. Drosophila melanogaster är ett bra verktyg för att undersöka de fysiologiska och molekylära förändringar som leder från motion intervention. Flugorna har kort livslängd och liknande mekanismer av metaboliserande näringsämnen jämfört med människor. För att inducera övning i Drosophila, utvecklat vi en maskin som kallas den motionsredskap, som utnyttjar flugans medfödda, negativ geotaxis tendens att inducera försiktigt klättring. Detta gör det möjligt för forskare att utföra experiment på stora kohorter av genetiskt olika flugor att bättre förstå de genotyp-av-miljö interaktioner underliggande hälsoeffekter av motion metaboliska.

Introduction

Barndom och Vuxenfetma växer epidemier i kulturer som konsumerar hög kalori dieter och förblir inaktiv under en längre tid, vilket kan leda till allvarliga långsiktiga konsekvenser, inklusive insulinresistens, kronisk inflammation och artros 1 , 2 , 3 , 4. prevalensen av dessa sjukdomar fortsätter att stiga på grund av den växande obalansen i kaloriintaget och utgifter som tillskrivs förhöjd konsumtion av fett och socker och en primärt stillasittande livsstil5. På motsvarande sätt har denna energi obalans lett till en ökning av fall av typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) och kardiovaskulär sjukdom (CVD)5. Individer löper en högre risk att utveckla både sjukdomar om de har diagnostiserats med sjukdomen metabola syndromet (MetS), vars symtom är bukfetma och dyslipidemi2. MetS är formad av de komplexa interaktioner mellan genotyp och olika miljöfaktorer, såsom kost och motion6. Således, för att få full förståelse för de bakomliggande mekanismerna för denna komplexa sjukdomar, alla dessa faktorer bör övervägas.

När det gäller att bekämpa MetS, rekommenderar läkare först genomgå livsstilsförändringar som är att äta en hälsosam, välbalanserad kost och fysisk aktivitet2,7,8. Eftersom effektiva läkemedel är begränsat och gastric bypassoperation är kostsamma och kräver livslång medicinsk övervakning, rekommenderas farmakologiska och kirurgiska ingrepp endast för svåra fall och endast i kombination med dessa livsstilsförändringar3 ,7,8. Medan livsstil insatser, såsom motion och bantning, kan producera och upprätthålla långsiktiga mål viktminskning, behöver om huruvida dessa korrigerande åtgärder fullt kan lindra de negativa effekterna som är associerad med MetS studeras vidare7, 8.

Musmodeller har använts för att undersöka effekterna av träning på metabola sjukdomar i år; införandet av motion att flyga forskning på MetS är dock en relativt senaste endeavor9,10,11,12. Flugor ge det perfekta fordonet för att studera övning i kontrollerad laboratoriemiljö, eftersom de är lättmanipulerade, har en kort livslängd, är billigt att underhålla, och energirelaterade metabolismvägarna bevaras mycket mellan Drosophila och människor13. D. melanogaster genomen är väl karakteriserade, och det finns en uppsjö av genetik verktyg tillgängliga för användning i Drosophila som kan ge insikt i olika genotyper och genotyp-av-miljö interaktioner som kan modulera den effekten av motion på organismers hälsa14.

Nuvarande metoder att utöva Drosophila åberopa flugans medfödda, negativ geotaxis tendens, beteendemässiga instinkten att klättra uppåt, att stimulera klättring i vuxna inom deras höljen11,12,15 . Den Power Tower, en metod att stimulera övning i flugor, höjer systematiskt flyga kapslingarna vertikalt och sedan droppar dem tillbaka till bänken ytan, effektivt knackar flugorna till botten av injektionsflaskan, således förmå sin instinktiva negativa geotaxis 12 , 16. experiment som utförs med hjälp av denna maskin visade att träning är en kraftfull skyddande faktor mot många åldersrelaterade sjukdomar, inklusive CVD och T2DM, och främjar friskt åldrande12,17,18 . Specifikt, visade de att motion kan minska uppkomsten av åldersrelaterad rörlighet nedgång i flugor och förbättra flera åldersrelaterade symtom, såsom hjärtfunktionen och stress svar17,18. Kontroll flyger dock aldrig placeras på tornet visade högre klättring poäng än de upplever maskinen, vilket tyder på styrkan av repetitiva dropparna kan ha vållat skada flugorna och påverkar rörlighet12. Detta tyder på att en alternativ metod för att inducera motion som är mindre kraftfullt och undviker orsakar fysiskt trauma skulle vara en användbar kompletterande metod till Power Tower protokoll16.

Inducera försiktigt övning i Drosophila, utvecklade vi en träningsmaskin som kallas motionsredskap (figur 1),. Den motionsredskap som är (hädanefter förkortat TW) roterande rörelse utlöser flugorna medfödda, negativ geotaxis tendens genom att ständigt omdefiniera gravitationella toppen av skålarna, som i sin tur stimulerar klättring i flugor. Till skillnad från andra metoder är TW roterande rörelse till sin natur mild, vilket minimerar antalet ytterligare stressfaktorer som kan uppstå och påverka resultaten. Maskinen ger således medel för att inducera övning i stort antal flugor utan förmå stress, vilket kommer att göra det möjligt för forskare att studera effekterna av träning på metabola hälsa (figur 2), åldrande, sömn och många andra ämnen11.

Vår metod följer en invers pyramidal, intervall träning protokollet, som i hög grad omfattar aspekter av aerob intervallträning (AIT) med några uthållighet motion träning. Standard AIT regimen ändras i detta protokoll att gradvis öka varaktigheten av varje intervall över en fem-dagars period att främja uthållighet. AIT har varit särskilt användbara för att förebygga MetS i förhållande till andra metoder för intervention och var mer effektivt motverka metabola syndromets gemensamma riskfaktorer än kontinuerlig måttlig motion19,20. En nackdel med TW i förhållande till den Power Tower är dock att flugor snabbare habituerar till rotera vinkar, således variation i medfödd tendens att habituerar bland flugor kan försvåra tolkningen av fördelarna med motion. 11 en elegant lösning till denna begränsning beskrivs av Watanabe och gåtan15 och deras kompletterande artikel21.

Protocol

1. motionsredskap installation och drift

Obs: Se kompletterande Figur1 för scheman på TW utöva maskinkonstruktion. De delar som krävs anges i Tabell för material. De fraser som ”TW”, ”motionsredskap”, ”öva maskin” och ”maskin” används omväxlande i hela protokollet.

  1. Kalibrera motor med strömbrytare så att en fullständig rotationstid är 15 s (4 rpm). Kalibrera maskinen rotationshastighet innan placera flyga injektionsflaskor i säkrade klämmor bifogas roterande armar.
    1. Justera hastigheten med hjälp av ett standard stoppur och ett orörliga objekt tillfälligt anslutna till maskinen, till exempel en liten pensel som tejpade motorkåpan med penseln bara röra vid en av roterande fästena. Tid numrera av rotationer i en minut med orörliga objektet som en referenspunkt och justera hastigheten för att uppnå en 15 s rotationstid (4 rpm).

2. flyga insamling och underhåll

Obs: Alla flugor underhålls i en 25 ° C inkubator med 50% luftfuktighet och en 12 h ljus/mörk cykel mellan bänkmonterade manipulationer beskrivs nedan. Flugor matas en standard majsmjöl-melass lab kost om inget annat anges.

  1. Inför varje genotyp av intresse använda äppeljuice agarplattor äggläggande chambers, en droppe av jäst klistra per platta, och 6 oz. plastflaskor att samla ägg som kläcks till larver.
    1. Att förbereda äppeljuice agarplattor, fylla 35 x 10 mm petriskålar ¾-full med 3% agar upplöses i färdigköpta äppeljuice. Lagra stelnat plattor i kylskåp fram till användning.
    2. I en 50 mL konisk centrifugrör, kombinera färdigköpta aktiv torrjäst med destillerat vatten vid ett förhållande av 2 mL vatten för varje gram jäst. Blanda jästen med vatten för att skapa en pasta med konsekvens av ketchup med ett glas omrörning rod. Justera jäst och vatten proportioner som behövs för att uppnå önskad konsistens.
    3. Lagra jäst pasta i kylskåp mellan användningar. Hålla röret locket löst att tillåta de gasa.
    4. Använd en vass nål eller kniv för att stansa små hål i den 6 oz. square-botten flaskor (polypropen) som ventilationshål för äggläggande kamrarna.
    5. Badda en liten fläck av jäst pasta (~ 3 mm i diameter) på varje äppeljuice agarplattan.
  2. Placera vuxna flugor av önskad genotyp 6 oz. flaska och cap flaska med äppeljuice agarplattan. Säkra plattan flaskan med gummiband. Invertera och placera i en inkubator för att vuxna att lägga ägg.
  3. Ändra äppeljuice agarplattor på en äggläggande kammare två gånger dagligen (morgon och kväll). Lämna används plattor i inkubatorn för en annan 12 – 24 h så att först instar larver kläcks.
  4. Samla först instar larver med en tunn pensel eller samling plocka (flexibel tunn nål bifogas ett handtag). Plats 50 instar först larver av en specifik genotyp på en mat-injektionsflaska av önskad experimentell mat typ att utveckla och fullständig metamorfos medan inrymt i inkubatorn (figur 2A).
  5. Samla vuxna för motion behandling (figur 2A).
    1. Vid förpuppningen, samla puppor med en liten, fuktig pensel och placera i tomma flaskor innan eclosion att förhindra vuxna flugor från att utsättas för larval kosten.
    2. Överföra vuxna flugor till mat injektionsflaskor med standard lab kost som de eclose. En till fem dagar efter eclosion, separat flugor baserat på kön.
  6. Utse hälften av de insamlade vuxna varje till den experimentella och kontrollgrupper. Upprätthålla flugor i injektionsflaskor av standard lab kost vid en koncentration på 50 flugor per injektionsflaska.
  7. Överföra den vuxna till färska livsmedel injektionsflaskor varannan dag för att förhindra dem från att fastna under träning. Lägga till flera korn av kompletterande levande jäst till den ny mat omedelbart före införandet av flugor.
    Obs: Det är möjligt att behålla flugor utan ett levande jäst tillägg, har vi funnit att de vuxna flugorna utför bäst med tillskott. Levande jäst tillskott är en variabel som kan ändras för att passa forskarens experimentella mål.

3. utövandet protokoll

  1. Den första dagen av motion (dag 1) pluggar push injektionsflaskan för att lämna 1 cm utrymme i kontroll injektionsflaskor och 6 cm utrymme mellan maten och pluggen i motion injektionsflaskor (figur 1 c).
    Obs: Kontrollera injektionsflaskorna kommer har begränsat utrymme för flugor att flytta medan på träningsmaskin och således flugor kommer att delta i mycket mindre rörelse än i motion injektionsflaskor.
  2. Placera injektionsflaskor i klämmorna och sedan ge flugorna 10 min till acclimate på maskinen (figur 1B).
    Obs: En alternativa kontroll är att upprätthålla de outnyttjade flugorna på bänkmonterade intill träningsmaskin med 6 cm utrymme (i injektionsflaska) för att röra sig normalt. Liknande resultat av träning i förhållande till både den ”1 cm på motionsredskap” och ”6 cm på bänkmonterade” kontroller hittats11.
  3. Behandla både kontroll och motion flyger till rotation på maskinen konstant rumstemperatur 5 dagar per vecka med omväxlande anfall av rotation och resten (figur 1D).
    Obs: En konstant temperatur behövs för att undvika de störande effekterna av temperaturen på aktivitetsnivåer. För temperatur manipulation studier, placera TW inuti en inkubator för att ändra temperatur behandlingar under träning.
    1. Kör maskinen för fyra 15 min anfall av motion på dag 1. Alternativa dessa anfall med 5 min viloperioder.
    2. Var och en av de följande dagarna, lägga till 5 min motion i en av de redan existerande motion skjutningarna. Exempelvis på dag 2, göra den första övningen skjutningen 20 min lång, men behålla resten av skjutningarna på 15 min lång.
    3. På dag 3, utöva flugor i 20 min under de första två skjutningarna och 15 min för de följande två skjutningarna.
    4. På dag 4, Använd 20 min motion anfall för alla utom den sista skjutningen, som bör endast 15 min lång.
    5. Dag 5, hålla alla motion skjutningarna 20 min lång.
      Obs: Under viloperioder, skålarna innehållande flugorna bör vara ordentligt fastspänd på TW. Injektionsflaskorna orientering under dessa perioder är inte relevant eftersom gravitationskraften upplevs av alla flugor kommer från samma håll.
  4. Efter avslutad övning behandling för en viss dag, returnera mat injektionsflaska pluggarna till sin normala position och återgå flugor till deras inkubatorer förrän nästa dag.
  5. Efter slutförandet av den fullständiga motionsprogram, söva flugor med standard fly CO2 anestesi metoder. Sedan överför flugor till ny mat injektionsflaskor eller mikrocentrifugrör för bedömning av fenotypiska egenskaper av intresse.
    Anmärkning: Exempel fenotyper inkluderar klättring förmåga (mat flaska), triglycerider lagring (mikrocentrifug rör) eller genuttryck (mikrocentrifug rör). Protokollet kan pausas här med prover lagras på lämpligt sätt beroende på bedömningarna som ska utföras. Analyser som rör levande flugor kommer att behöva genomföras utan dröjsmål enligt specifika målen i den fenotypiska test.

4. klättring bedömning

  1. Efter en vilodag efter avslutad motion protokollet, testa allmänna fluga klättring prestanda med en snabb iterativ negativa geotaxis (RING)-som negativa geotaxis klättring assay22.
    1. Placera grupper av 10 flugor i tomma flaskor använder CO2 anestesi (eller trycka direkt från mat injektionsflaskor om redan sorterade) och försegla med paraffin filma att förhindra flugor från att fly. Ge de flugor minst 10 min anpassa sig till nya injektionsflaskan. För att förhindra injektionsflaskor från att välta, tejpa en ~ 5 cm diameter cardstock cirkeln längst ned i injektionsflaskan för att ge extra yta.
      Obs: Injektionsflaska pluggar ska inte användas eftersom de hindrar en del av injektionsflaskan används för att bestämma höjd klättrade.
    2. Placera injektionsflaskor 20 cm framför ett 1 x 1 cm rutnät i fullständig vy av en monterad, stillastående kamera med en inbyggd timer (en smart telefon med en timer kamera ansökan fungerar bra).
    3. Tryck på injektionsflaskor försiktigt på counter tre gånger att slå alla flugor ner till botten av injektionsflaskan. Efter att knacka injektionsflaskan ner tredje gången, starta omedelbart timern 4 s kamera för att fånga en bild för att bestämma höjden klättrade av varje fluga.
      Obs: Avlyssning bör göras på ett konsekvent intensitet och av samma forskaren i varje motion-control kontrast att minimera variationen i flugorna svaren på grund av att trycka.
    4. Upprepa steg 4.1.3 två gånger, med minst 1 min vila mellan prövningar, för att producera totalt tre studier per injektionsflaska.
  2. För att bevara flugor för andra analyser, omedelbart efter klättring analysen har slutförts, frysa flash flugor genom nedsänkning i flytande kväve.
    1. Använd en grunt, öppna-toppad dewar kolv fylld på ~ 5 cm djup med flytande kväve.
    2. Överföra flugor till små mikrocentrifugrör använder CO2 anestesi och sedan placera rören i dewarflaskan eller termosen fylld med flytande kväve. Alternativt, om framtida analyser kräver undvikande av CO2, frysa snapin flugor direkt i sin klättring injektionsflaskor genom att försiktigt knacka flugor till botten av deras injektionsflaska medan botten är nedsänkt i flytande kväve, och sedan överföra de frysta flyger till mikrocentrifugrör använda pincett.
      Obs: Flytande kväve är kryogen och bör endast användas med lämplig skyddande utrustning och rum ventilation.
  3. Bearbeta bilder med ImageJ23 flerpunkts markeringsverktyget.
    1. Öppna upp en bild för behandling inom ImageJ.
    2. Ange en 1 cm skala baserat på rutnätet bakgrundspappret att beräkna avståndet klättrade av varje enskild fluga. Verktyget ”Line” från verktygsfältet att spåra ena sidan av en 1 cm2 kvadrat från rutnätet bakgrundspappret. Klicka på fliken ”analysera” och välj ”Ange skala”. ”Känd avståndet” som '1,00' och ”enhet för längd” som 'cm', kontrollera ”Global” är avmarkerad och klicka på ”OK”.
    3. Välj ikonen ”Multi-punkt urval” från verktygsfältet och zooma in på botten av injektionsflaskan med i bilden. Ange den första punkten som botten av injektionsflaskan genom att klicka på den lägsta delen av injektionsflaskan.
    4. Klicka på mitten av varje fluga i injektionsflaskan med att markera den som en datapunkt. Notera att det finns totalt 11 Poäng per injektionsflaska, en märkning på botten av injektionsflaskan och en för varje fluga.
    5. Klicka på fliken ”analysera” och välj ”åtgärd” för att generera en tabell med uppmätta värden. Spara tabellen i som en CSV-fil.
    6. Öppna CSV-filen i ett kalkylprogram och beräkna det exakta avståndet klättrade av varje fluga genom att subtrahera y-värdena i punkterna 2-11 från punkt 1 i tabellen uppmätta värden.
    7. Upprepa steg 4.3.1 genom 4.3.6 för varje bild.

5. triglycerid lagring Assay

Obs: De prover, standarder, glycerol standardlösning och triglycerol fungerande lösning används i hela analysen bör hållas på is för varaktigheten av protokollet och bör förvaras i kylskåp när inte i använda.

  1. Förbereda standarder med Glycerol standardlösningen.
    1. Göra på tomt (B) genom att lägga 1000 µL av homogenisering buffert i en mikrocentrifug rör märkt B.
    2. Gör Standard 1 (S1), 2,5 mg/mL per brunn, genom att lägga till 1000 µL standardlösning glycerol i en mikrocentrifug rör märkt S1.
    3. Gör Standard 2 (S2), 1,25 mg/mL per brunn, genom att lägga till 500 µL standardlösning glycerol 500 µL för Dihs2O i en mikrocentrifug rör märkt S2.
    4. Gör Standard 3 (S3), 0,625 mg/mL per brunn, genom att lägga till 250 µL standardlösning glycerol 750 µL för Dihs2O i en mikrocentrifug rör märkt S3.
    5. Gör Standard 4 (S4), 0.3125 mg/mL per brunn, genom att lägga till 125 µL standardlösning glycerol 875 µL av diH20 i en mikrocentrifug rör märkt S4.
  2. Förbereda triglycerol fungerande lösning från Serum triglycerider fastställande Kit.
    1. Tillsätt 40 mL Dihs2O till fri glycerol reagensen från kit och blanda genom att vända flaskan.
    2. Tillsätt 10 mL av Dihs2O till triglycerid lösningen från kit och blanda genom att vända flaskan.
    3. Kombinera glycerol reagens och triglycerider lösning och blanda genom att vända för att förbereda triglycerol arbetslösning.
      Obs: Triglycerol arbetslösning är bra för 60 dagar och kan slutföra fyra plattan med 96 brunnar analyser per kit använda protokollet nedan. De volymer som används skalas proportionellt från officiella Serum triglycerider fastställande kit för användning i formatet plattan med 96 brunnar.
  3. Verifiera Blank och standarder genom noggrant pipett 5 µL av varje standard till en 96 brunnar platt botten, tydlig mikroplattan i tre exemplar (eller fyra exemplar för blindtestet).
    1. Tillsätt exakt 125 µL av Triglycerol arbetar lösning till varje brunn innehållande en standard. Tillåt lösningar att reagera i 30 min.
    2. Placera en plattan med 96 brunnar i en spektrofotometer och Läs av absorbansen vid 540 nm. Använda absorbansen mätningarna och skapa en standardkurva som du kan kontrollera riktigheten av standarder genom att utvärdera värdet R2 . Om den R2 för normerna är mindre än 0,98, åter förbereda standarder mer noggrant.
  4. Börja dag 1 av analysen för triglycerid lagring14 använda mikrocentrifugrör innehållande 10 frysta flyger varje.
    Obs: Upprepa eller flerkanalig pipett ska aldrig användas i det här steget eftersom beloppen för varje reagens som används i analysen måste vara mycket noggrann och konsekvent att få reproducerbara resultat. Vår erfarenhet har upprepa och flerkanalig pipetter inte denna grad av noggrannhet och konsekvens. Varje delprov från en enda kanal pipett kan bekräftas visuellt genom experimenter för kvalitetskontroll och någon enda kanal pipett-specifika fördomar kommer att upplevas av alla prover i samma grad.
    1. Förbereda ett 200 mL lager av homogenisering buffert genom att kombinera 0.272 g KH2PO4, 400 µL 0,5 M EDTA och 199.6 mL Dihs2O i en glasflaska.
    2. Tillsätt exakt 100 µL av homogenisering buffert till var och en av de 40 mikrocentrifugrör innehållande 10 vuxna frysas efter klättring analysen. Sedan Centrifugera proverna för 30 s vid 18.000 g.
    3. Grind flyger med en motordriven kvarn och mortel (eller en annan form av vävnad homogenisering) för att förbereda en mjölkaktig lösning. Kontrollera en färsk mortelstöt används för varje prov. Sedan Centrifugera proverna för 2 min på 18.000 g.
    4. Pipettera över endast de top 75 µL av supernatanten vätska från varje rör till nya mikrocentrifugrör. Se till att inga flyga bitar från pelleten överförs över. Placera nya rör i kylskåpet över natten.
  5. Börja dag 2 av triglycerid-protokollet genom att ta bort dag 1 prover ur kylskåpet.
    Obs: Steg 5,5 kan utföras samma dag som 5,4 men vi har hittat signalen för triglycerid koncentration är mer robust efter en natt i kylskåp. Tiden mellan stegen 5.4 och 5.5 bör dock inte överskrida 36 h.
    1. (Valfritt) Vortex första röret med supernatanta vätskan för 10 s och pipett 5 µL till en ren mikrocentrifug rör. Tillsätt 95 µL av 0,15 M NaCl i nya mikrocentrifug röret. Förvara dessa delprover i-20 ° C frysen för en senare analys av protein om så önskas.
      Obs: Dessa prover av supernatanten med tillsats NaCl lösning kan användas för att bestämma proteinhalt med forskarens Rekommenderad analys. Vi använder de Bradford metoden24. Proteinhalten är ett sätt att standardisera mäta av triglycerid innehåll, men forskaren bör också vara försiktig vid tolkningen av dessa nyckeltal sedan träning och kost kan också påverka protein lagring.
    2. För de ursprungliga supernatant injektionsflaskorna replikerar vortex första röret med supernatanta vätskan för 10 s, sedan pipetten 5 µL i två separata brunnar i en 96 brunnar mikroplattan att producera tekniska. Var noga med att notera vilka brunnar används för varje prov. Upprepa detta steg för 39 andra rören.
    3. Överför med pipett exakt 5 µL av Tom till fyra brunnar i mikroplattan och för återstående brunnarna, Pipettera exakt 5 µL av varje standard i tre exemplar.
    4. Tillsätt exakt 125 µL triglycerol fungerande lösning till varje brunn och låt lösningen att reagera i 30 min.
    5. Placera plattan med 96 brunnar i en spektrofotometer och Läs av absorbansen vid 540 nm.
    6. Konvertera absorbansvärden i koncentration (mg/mL) med hjälp av standardkurvan beräknas från standarderna.

Representative Results

Vi är särskilt intresserade av att identifiera de faktorer som bidrar till den övergripande metabola hälsan hos en individ. Tidigare konstaterades att genotyp-av-diet interaktioner bidra avsevärt till befolkningen nivå variation i metabola egenskaper14. Detta innebär att varje genotyp svarar på miljömässiga skillnader på ett unikt och komplext sätt. För att förlänga vårt arbete på genotyp-av-miljö effekter att inkludera fysisk träning, utvecklat vi motionsredskap, som är kapabel till att exponera ett stort antal genotyper till aerob intervallträning (AIT) på ett sätt som hög genomströmning.

För att fastställa om motion på TW påverkat metabola egenskaper, Vi mätte triglycerid lagring i Oregon-R (OreR) och y1w1 flyger, gemensamma vildtyp flugor (figur 2B – C), och normaliserade värdena mot flugorna proteinkoncentration, som ursprungligen rapporterade i Mendez m.fl. 11. Vi analyserade data av multivariat variansanalys (MANOVA) redovisning för genotyp, kön, utöva behandling (och deras interaktioner), och experimentella block effekter såsom tid replikat och mat injektionsflaska och fann att det fanns en betydande genotyp-av-övning interaktion (p = 0.0017) som påverkar triglycerid lagring. Det fanns en betydande sexuella dimorfa effekt mellan hanar och honor, med hanar lagra mer triglycerider än honorna (p < 0,0001). Vi såg att utövas flugor i kvinnor, hade betydligt lägre triglyceridnivåer än sina outnyttjade motsvarigheter (figur 2B, p < 0,0001). I män, medan minskningen i triglycerid lagring observerats i Oregon-R utövas flugor (jämfört med kontroller) inte var statistiskt signifikant, observerades en signifikant skillnad i triglycerid lagring mellan de två separata linjerna (figur 2C, p < 0,0001). Observera att medan standardisera triglycerid koncentration mot protein koncentrationen ger insikt om övergripande flyga kroppen sammansättning nyckeltal, jämförelse av direkta triglycerid eller protein koncentration bland olika grupper av flugor kan också ge specifik information om effekten av motion på dessa fenotyper individuellt.

Eftersom variabler som vuxen motion, kön, och genotyp visas att påverka triglycerid lagring, var det väntat att dessa faktorer också påverkar andra fenotyper och interagera med kost. Vi tog upp larver från en representativ vildtyp Drosophila genetiska referenspanelen linje (DGRP 153)25 på antingen en hög fett eller normal kost och inducerad motion i vuxna flugor för en vecka (figur 2A). Därefter har utfört vi en ringliknande negativa geotaxis test för att mäta klättringsförmåga. Klättring analysen används skilde sig från en standard RING analys; i stället för en RING apparatur användes injektionsflaskor med paraffin film som täcker öppningarna till hus flugor under analysen. Andra aspekter av den ursprungliga RING assay, såsom tid mellan att trycka flugorna till botten av flaskan och tar fotot, var balanserade22.

Alla behandlingar upprepades tre separata tillfällen med ett minimum av 59 enskilda flugor per tid replikera och behandling. Data analyserades av MANOVA redovisning för kost, genotyp, sex, motion behandling (och deras interaktioner), samt experimentella blockera effekterna av tid replikera, assay injektionsflaska och injektionsflaska analysen replikera. Vi hittade att utövas honorna klättrade signifikant högre (p < 0,005) när uppfödda på hög fett diet än någon av de andra kvinnliga behandlingarna (figur 2D). För män sågs det att träning endast förbättrats klättring när män togs upp på den normala kosten, och de tog upp på hög fett diet visade ingen signifikant förändring (figur 2E). Vi fann också betydande könsdimorfism effekter (p < 0,0001) i klättring med hanar klättrar högre än honor. Det överraskande resultatet av en minskning av klättring prestanda efter träning för kvinnor från raden DGRP 153 (figur 2D) för kvinnor som konsumerar en normal kost (p < 0,0001) är ett exempel på hur denna typ av träning kan inte vara en enhetligt positiva insatser för alla genotyper och kunde vara beroende av andra miljöfaktorer. I Mendez m.fl. 11, honor från fyra andra genetiska linjer som testas för sin klättring prestanda efter att ha tagits upp på en normal kost alla visade ökad klättringsförmåga med träning. Detta antyder att de svar som observerades i DGRP 153 genotyp-specifik och inte en allmän egendom TW motion behandling. Variabiliteten i svar över kön, kost och motion behandlingsgrupper indikerar att det finns betydande sex-av-diet-av-motion interaktioner som påverkar klättring förmågan av linjen (p < 0,0001).

Sammantaget visar resultaten att effekterna av träning på en vuxen fluga metabol hälsa kan vara en funktion av dess kön, genotyp och larver kost. Den fenotypiska variationen hos svar på genotyp, miljövariabler (t.ex., kost och motion) och sex har också observerats i andra studier11,12,14,15. Således, den TW och Drosophila kan vara en kraftfull strategi för att klarlägga de genetiska och miljömässiga faktorer formar metabol hälsa.

Figure 1
Figur 1 : The motionsredskap träningsmaskin. (A) maskinen rymmer 48 flaskor och har en justerbar hastighet funktion. Här utfördes experimenten vid 4 rpm. (B) enskilda livsmedel innehållande experimentell flugorna var brast på parentes bifogas en roterande axel. (C), avståndet mellan injektionsflaska plug och mat var 6 cm för motion injektionsflaskor och 1 cm för kontroll injektionsflaskor. Injektionsflaskorna placerades sedan på maskinen för motion. (D), 5 dag inverterad pyramid utövandet regimen användes att utöva vuxna flugor. Varje dag, ytterligare fem minuter lades till en av de utövande skjutningarna ramp upp träningsintensitet inkrementellt, som modeller uthållighet, intervallträning. Denna siffra har ändrats från Mendez m.fl. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Visuella metoder och representativa resultat. (A) metoder för att testa larval kost och vuxna motion interaktion effekter. Larverna var uppvuxen på hög fett eller normal laboratorium kost och bytte till vanlig mat vid eclosion. Vuxna flugor skildes efter kön, in i experimentella grupper och utövas under fem dagar. Efteråt en ringliknande negativa geotaxis klättring analys genomfördes, och flugor frystes för triglycerid mätningar. Representativa triglycerid data visas för två genetiska linjer, Oregon R och y1w1 för (C) och (B) hondjur. Alla flugor var uppfödda på en normal kost och utövas i vuxen ålder. Nivåer med olika bokstäver skiljer sig avsevärt (p < 0,05) med en post hoc Students t-test. Denna siffra innehåller en delmängd av data rapporteras i Mendez m.fl. 11. representativa klättring uppgifter visas för linje DGRP 153 för (E) och (D) hondjur. Varje punkt representerar 232 eller fler individer i genomsnitt klättring prestanda över tre oberoende tidpunkter. Felstaplar visar ett standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 1
Kompletterande Figur1: en detaljerad Schematisk av motionsredskap. (A) Diagram av två injektionsflaskor klämma struktur används för att fästa injektionsflaskor till maskinen. (B) interiör vy över maskinens roterande drivsystem. (C) parallella projektion av maskinens framsida. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tilläggskod fil: TreadWheel.skp Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Protokollet övning som beskrivs här har visat sig framgångsrikt stimulera skonsam övning i Drosophila och kan användas för att simulera uthållighetsträning i ett kontrollerat laboratorium inställning11. Det bör noteras att när initialt utveckla konceptet motionsredskap, ansåg vi kommersiella produkter som kan ändras för att utföra på samma sätt (t.ex., en laboratorium rotisserie). Dock förkastade vi slutligen detta synsätt, att välja en specialbyggd konstruktion eftersom kommersiella utrustningen inte hade en tillräckligt låg rotationshastighet (4 rpm) och saknade tillräcklig injektionsflaska kapacitet för hög genomströmning prov generation.

Själva TW protokollet kan justeras för att omfatta ett brett spektrum av forskningsområden. Till exempel kan justera frekvens och varaktighet av flugorna motion regimes förändra de träning de får stödnivåerna. Genom att utvidga protokollet längre än en vecka eller till andra åldersgrupper, skulle det vara möjligt att studera effekterna av träning på åldrande och olika åldersrelaterade sjukdomar. Vi rekommenderar att om en utökad motion strategi genomförs sedan minst en vilodag per vecka ska läggas för att möjliggöra återhämtning. Prestanda och förbättring visades vara större i regimer som ingår en vilodag än de regimer som används i rad dagliga motion12. Dessutom vill vi varna att utvidga övningen skjutningen längder senaste 30 min sedan tillvänjning till den roterande rörelsen kan uppstå efter långa perioder av kontinuerlig motion11. Vi har också observerat genetiska variationer i flugor motivation att behålla sin aktivitetsnivå på TW11. Således, om längre anfall önskas, överväga övervakning flugorna aktivitetsnivåer, som presenterades av Watanabe och gåtan15,21 som beskriver deras ändring av begreppet TW. Andra faktorer som kunde vara omväxlande inkluderar temperatur och sömn-vakna mönster som visas också påverka flyga rörelser26,27.

Det finns en uppsjö av tillgängliga analyser under och efter protokollet slutförandet att ta itu med effekterna av träning på den fysiologiska, beteendemässiga och molekylär nivån, liksom potential att nysta epigenetiska effekter av motion. Ytterligare metabola analyser (t.ex. glukos, glykogen och protein), hjärtfunktionen och inflammatoriskt svar åtgärder kan användas för att ytterligare utforska effekt träningen har på flyga fysiologi och kroppen sammansättning12,14 ,24,28. Olika beteendeförändringar som är associerad med motion induktion, såsom förändringar i utfodring beteende, rörelseaktivitet och sömn, kan också mätas med hjälp av verktyg som CAFE assay29 eller aktivitetsövervakning enheter12,15 ,30. Förändringar i genuttryck och cellandningen tillskrivas för att utöva kan också kvantifieras med hjälp av metoder som qRT-PCR11 och respiration31. Slutligen, Drosophila har värdefulla genetiska resurser tillgängliga, såsom Drosophila genetik referenspanelen 2 och Drosophila syntetiska befolkningen resursen som ger forskare plattformen för att utföra kvantitativ genetiska studier25,32. Dessa verktyg möjliggör kartläggning experiment, såsom Genome-Wide Association Studies och kvantitativa drag Loci kartläggning, att identifiera kandidat loci associerade med motion och kost.

Studier som utförts av motionsredskap visade att i genomsnitt motion minskar kroppsvikt, totala triglycerid lagring och glykogen, samtidigt ökar proteinhalten och klättring prestanda11. Dessutom fanns det varierande svaren att utöva över könen och genotyper för kroppsvikt, samt triglycerider, protein, glykogen, glukos och aktivitet nivåer11,15. Medan variationen av svar på motion och kost över genotyper och sex kan vara utmanande att tolka och, ibland, bakvända, återspeglar källorna till verkliga biologisk variation observerats i naturliga populationer. Eftersom vi strävar efter att förstå mångfalden av underliggande faktorer som bidrar till den höga andelen MetS, kommer att verktyg som underlättar förgrymmat relativa betydelsen av olika bidragande faktorer genom att testa dessa faktorer i modellorganismer vara avgörande för vår förmåga att utveckla personliga insatser för förebyggande och behandling. För att fullt ut bedöma effekten av motion, måste var och en av dessa faktorer och hur de interagerar beaktas när genomför experiment och formulera slutsatser.

TW, som de flesta andra flyga träningsmaskiner, är begränsad i sin förmåga att kvantifiera flyga rörelse. Nyligen, Watanabe och Riddle utvecklade den roterande motion kvantifiering systemet (REQS), en TW ryggrad modifierad med en aktivitet som centralenhet (LAM25H) från Drosophila Monitoring System serie15,21. Liksom TW, detta system använder roterande rörelse försiktigt inducera motion medan du använder LAM25H armen att spåra och kvantifiera flyga aktivitet, men den rymmer ett mindre antal injektionsflaskor (32 flaskor) än TW15. För hög genomströmning motion studier, om aktivitet kvantifiering inte behövs eller önskas, möjliggör TW en större antalet stickprov. TW design kan också ändras från dess nuvarande form att rymma ett större antal injektionsflaskor. Detta system, tillsammans med andra befintliga motion metoder, bidragit till att fastställa att motion är inte bara kan uppnås i Drosophila men kan också studeras för att avgöra effekten av fysisk aktivitet på en mängd olika fysiologiska och molekylära svar 11,12,15. Således kan TW, som en beprövad metod för att inducera skonsam övning i flugor, användas till en stor mängd biologiska frågor.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish och resten av Reed Lab för deras hjälp med flyga djurhållning och bildbehandling. Sean Mendez byggt den ursprungliga motionsredskap med stöd från UAB maskinverkstaden. Finansiering för denna studie lämnades av NIH-R01 GM 098856 till LKR och grundutbildning kreativitet och forskning akademin vid University of Alabama till KEL och BJW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for TreadWheel Construction:
Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount McMaster-Carr 60855K71 Quantity: 4
Stainless Steel Ball Bearing McMaster-Carr 57155K306 Quantity: 8
Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) McMaster-Carr 70235K16 Quantity: 1
Compact Square-Face DC Gear motor McMaster-Carr 6409K23 Quantity: 1
Tool Holder (clamps) McMaster-Carr 1723A22 Quantity: 5 (10x)
12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod McMaster-Carr 5227T24 Quantity: 1
Set Screw Shaft Collar McMaster-Carr 6432K13 Quantity: 8
Round-Belt Pulley McMaster-Carr 6284K51 Quantity: 5
Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor McMaster-Carr 13DV 1A Quantity: 1
Materials for Fly Maintenace and Husbandry
6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) Genesee Scientific 32-130 Quantity: 1
35x10mm Petri Dishes VWR 82050-536 Quantity: 1
Narrow Drosophila vials Genesee Scientific 32-116 Quantity: 1
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 Quantity: 1
Blowgun, Mini Genesee Scientific 54-104 Quantity: 1
Materials for RING-like Assay:
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/ Quantity: 1
1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) various Quantity: 1
digital camera with timer or smart phone with camera timer app various Quantity: 1
Materials for Triglyceride Assay:
Dewar Flask VWR 14200-960 Quantity: 1
Serum Triglyceride Determination Kit Sigma Aldrich TRO100 Quantity: 1
Cordless Pestle Motor VWR 47747-370 Quantity: 1
Pestles VWR 47747-358 Quantity: 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yanovski, J. A. Pediatric obesity. An introduction. Appetite. 93, 3-12 (2015).
  2. Alberti, K. G. M. M., Zimmet, P., Shaw, J. Metabolic syndrome-a new world-wide definition. A Consensus Statement from the International Diabetes Federation. Diabetic Medicine. 23, 469-480 (2006).
  3. American Diabetes Association. 6. Obesity Management for the Treatment of Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 39, Suppl 1 47-51 (2016).
  4. Bliddal, H., Leeds, A. R., Christensen, R. Osteoarthritis, obesity and weight loss: evidence, hypotheses and horizons - a scoping review. Obesity Reviews. 15, 578-586 (2014).
  5. Bray, G. A. The epidemic of obesity and changes in food intake: the Fluoride Hypothesis. Physiol. Behav. 82, 115-121 (2004).
  6. O'Rahilly, S., Farooqi, I. S. Genetics of obesity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 361, 1095-1105 (2006).
  7. Kenkre, J., Tan, T., Bloom, S. Treating the obese diabetic. Expert Rev Clin Pharmacol. 6, 171-183 (2013).
  8. Fiuza-Luces, C., Garatachea, N., Berger, N. A., Lucia, A. Exercise is the Real Polypill. Physiology. 28, 330-358 (2013).
  9. Matos, A., et al. Acute exercise reverses TRB3 expression in the skeletal muscle and ameliorates whole body insulin sensitivity in diabetic mice. Acta Physiologica. 198, 61-69 (2010).
  10. Mercken, E. M., Carboneau, B. A., Krzysik-Walker, S. M., de Cabo, R. Of mice and men: The benefits of caloric restriction, exercise, and mimetics. Ageing Research Reviews. 11, 390-398 (2012).
  11. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A Novel Apparatus to Measure Genetic Variation in Response to Gently Induced Exercise for Drosophila. PLoS ONE. 11, 0164706 (2016).
  12. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance. PLoS ONE. 4, 5886-5911 (2009).
  13. Graham, P., Pick, L. Drosophila as a Model for Diabetes and Diseases of Insulin Resistance. Fly Models of Human Diseases. 121, 397-419 (2017).
  14. Reed, L. K., et al. Genotype-by-Diet Interactions Drive Metabolic Phenotype Variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185, 1009-1019 (2010).
  15. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS ONE. 12, 0185090 (2017).
  16. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. , (2012).
  17. Tinkerhess, M. J., et al. The Drosophila PGC-1α Homolog spargel Modulates the Physiological Effects of Endurance Exercise. PLoS ONE. 7, 31633 (2012).
  18. Sujkowski, A., Bazzell, B., Carpenter, K., Arking, R., Wessells, R. J. Endurance exercise and selective breeding for longevity extend Drosophila healthspan by overlapping mechanisms. Aging. 7, 535-552 (2015).
  19. Tjønna, A. E., et al. Aerobic Interval Training Versus Continuous Moderate Exercise as a Treatment for the Metabolic Syndrome: A Pilot Study. Circulation. 118, 346-354 (2008).
  20. Ciolac, E. G., et al. Effects of high-intensity aerobic interval training vs. moderate exercise on hemodynamic, metabolic and neuro-humoral abnormalities of young normotensive women at high familial risk for hypertension. Hypertension Research 2010 33:8. 33, 836-843 (2010).
  21. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Measuring exercise levels in Drosophila melanogaster using the Rotating Exercise Quantification System (REQS). J Vis Exp. , (2018).
  22. Gargano, J., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40, 386-395 (2005).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods 2012 9:7. 9, 671-675 (2012).
  24. Hammond, J. B. W., Kruger, N. J. New Protein Techniques. 3, 25-32 (1988).
  25. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).
  26. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1975).
  27. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and Recording Locomotor Activity in a Drosophila melanogaster Model of Alzheimer's Disease. Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).
  28. Leng, S. X., et al. ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 63, 879-884 (2008).
  29. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 8253-8256 (2007).
  30. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. , (2010).
  31. MÖlich, A. B., FÖrster, T. D., Lighton, J. R. B. Hyperthermic Overdrive: Oxygen Delivery does Not Limit Thermal Tolerance in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Science. 12, 1-7 (2012).
  32. Long, A. D., Macdonald, S. J., King, E. G. Dissecting complex traits using the Drosophila Synthetic Population Resource. Trends in Genetics. 30, 488-495 (2014).

Tags

Genetik fråga 136 övning Drosophila aerob intervallträning (AIT) metabola syndromet fetma triglycerid lagring negativa geotaxis genotyp-av-miljö interaktioner
Motionsredskap: Intervall träning protokoll för försiktigt inducerad övning i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lowman, K. E., Wyatt, B. J.,… More

Lowman, K. E., Wyatt, B. J., Cunneely, O. P., Reed, L. K. The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (136), e57788, doi:10.3791/57788 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter