Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Decellularization и Recellularization методика для человека подкожной вены

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57803

Summary

Здесь мы описываем протокол для подкожной вены decellularization помощью перфузии периферической крови и эндотелиальных среднего моющих и recellularization.

Abstract

Сосудистой трубопроводы, используемые во время большинство сосудистых операций являются аллогенной или синтетических графтов, которые часто приводят к осложнений, вызванных иммуносупрессии и плохой проходимости. Тканевая инженерия предлагает новое решение для создания персонализированных графтов с естественным внеклеточного матрикса, содержащий получателя ячейки с помощью метода decellularization и recellularization. Мы показываем подробный метод для выполнения decellularization человека подкожной вены и recellularization от кровоснабжения периферической крови. Вену был decellularized perfusing 1% X-100 Тритон, 1% tri-n бутил фосфат (TnBP) и 2000 единиц Кунитц дезоксирибонуклеаза (DNase). Тритон X-100 и TnBP были увлажненную на 35 мл/мин в течение 4 ч, хотя DNase был увлажненную 10 мл/мин при 37 ° C в течение 4 ч. Вену был промывают в ультрачистая вода и PBS и затем стерилизовать в 0,1% надуксусной кислоты. Он был снова промывают в PBS и выдержано в эндотелиальных среде. Вену был подключен к биореактора и увлажненную с эндотелиальной среде, содержащей 50 МЕ/мл гепарина для 1 ч. Recellularization была выполнена путем заполнения биореактор с свежей крови, разбавленных 1:1 в растворе Стин и добавление, желез внутренней секреции производный сосудистой эндотелиальный фактор роста (80 нг/мл), факторы роста фибробластов основные (4 мкл/мл) и ацетил салициловая кислота (5 мкг/мл). Биореактор была затем переехали в инкубаторе и увлажненную за 48 ч в 2 мл/мин при сохранении глюкозы между 3-9 ммоль/л Позже Вену был промывают с PBS, заполнены с эндотелиальной среднего и увлажненную за 96 ч в инкубаторе. Лечение с X-100 Тритон, TnBP и DNase decellularized подкожной вены в 5 циклах. Decellularized вен посмотрел белый в отличие от обычных и recellularized вен (светло-красный). Гематоксилином и эозином (H & E) показало наличие ядер только в обычном режиме, но не в decellularized вен. В recellularized ключе H & E-окрашивание показали наличие клеток на поверхности Люминал Вены.

Introduction

Сосудистые трубопроводов необходимы для нескольких клинических условий как аневризм, стеноз сонной артерии и атеросклероза, ведущих к серьезным сосудистых проблем. Хирурги используют аутологичной, аллогенной или синтетических сосудистых трубопроводы для восстановления функциональных крови. Хотя использование аутологических кровеносных сосудов до сих пор считается идеальным подходом, наличие у больных majorly ограничен. Альтернативы, такие как аллогенной или синтетических графтов имеют глубокие проблемы с иммуносупрессивной лечения и плохой проходимости, ведущих к повторная операция1,2, что привело к серьезной экономического бремени стран. Тканевая инженерия кровеносных сосудов стремится обеспечить графтов с естественным гомологии и аутологичных клеток. Таким образом иммунной системе получателя признается self пересаженных трансплантата и поскольку такой трансплантата содержит натуральные протеины и клетки в первоначальной конфигурации, она может функционировать лучше по сравнению с текущей альтернатив. Ткани инженерии органы, такие, как мочевого пузыря3, мочеиспускательного канала4, трахею5и вен6,7, были успешно использованы в клинике.

Ткани инженерных произвести персональные имплантатов требует трансплантата от донора, а затем decellularization и recellularization. Decellularization — это многообещающая технология для удаления клеток тканей и органов8,9,10. Decellularization может выполняться конкретные физические, химические и ферментативные методы11 или комбинируя их. На оптимальное использование этих методов decellularized тканей может иметь аналогичные структурных и функциональных белков внеклеточного матрикса, похож на собственные ткани. Такие органы обладают внутреннего потенциала для повышения степени привязанности, миграция, распространение и дифференцирования стволовых клеток, входящих.

Recellularization представляет собой динамический процесс посев клеток трансплантата, и получателей стволовых клеток могут быть использованы для клинических трансплантации. Стволовые клетки в настоящее время используется для таких целей включают костного мозга, мезенхимы и орган жителей3,5,6. Животных и научно ориентированных исследований использовали стволовые клетки из мезенхимы происхождения, которые являются плода и индуцированных плюрипотентных12,,1314. Этот процесс требует биореактора (палата, которая держит Вену и обеспечивает необходимые условия как температуры, газы, рН и давление), клетки и культуры средств массовой информации. В recellularization задача получить необходимое количество клеток определенного типа и посева стратегия, в которой клетки может достигать цельной ткани или органа. Даже несмотря на то, что не полный ткань или орган структурно и функционально был создан и оценены до сих пор, несколько достижений в этой области и первые результаты показывают в будущем возможность15. Основная функция Вены находится в Люминал эндотелия, который контролирует проникновение воспалительных клеток в тканях и слой среднего гладких мышц, который помогает в сужения и также обеспечивает силу держать артериальное давление16. Исследования показали, что во время повреждения, endothelialization происходит от анастомоза либо от циркулирующих эндотелиальные прародитель клеток (ПЭК) в крови17,18,19. Наша стратегия для recellularization вен опирается на Пэк в циркулирующей крови.

Тканевая инженерия вен и артерий была выполнена несколькими группами, после различных decellularization и recellularization стратегии20,21. Наша группа также выполняется и разработали стратегии decellularization и recellularization для молочной и подвздошных вен6,7. Decellularization была выполнена путем перемешивания Вены в Тритон X-100, tri н бутил-фосфат (TnBP) и фермент дезоксирибонуклеаза (DNase). Recellularization была выполнена с использованием костного мозга, полученных эндотелия и гладкой мышечной клетки6 или7периферической крови. Вен recellularized либо протоколом, показали клинических обещание в обеспечении функциональной кровоснабжение в трансплантации педиатрических больных с дополнительной печеночной воротной вены непроходимость6,7.

В настоящее время мы разработали модифицированную версию тот же протокол для улучшения и легко производительности обработки decellularization, recellularization и биореактор вен малого диаметра. Текущий decellularization протокол требует перфузии моющих средств через Вену, вместо давления агитации с моющими средствами. Recellularization протокол включает в себя дополнительный шаг по предварительной подготовки для улучшения клеточной адгезии и добавление факторов роста в циркулирующей крови для улучшения клеточной адгезии, выживания и распространения. Мы также улучшили дизайн биореактора, использование коммерчески доступных продуктов. В этой статье мы представляем подробное описание измененного Протокола для выполнения decellularization и recellularization человека подкожной вен.

Protocol

Используемые ткани, и протокол этого документа следует этические принципы Гётеборгского университета.

1. ткань подготовка и хранение

  1. Вырежьте окружающие ткани от проверено подкожной вены, используя Щипцы хирургические и ножницы.
    Примечание: Подкожной вены рассечена от нижней конечности людей сосудистых хирургов. Подкожной вены, используемые в этой бумаге ООН используются входит после операции шунтирования.
  2. Для предотвращения утечки во время перфузии, перевязать все боковые ветви на их концах с швы и пинцет.
  3. Держите Вену в Тюбик 50 мл, содержащие 40 мл фосфатный буфер (PBS). Вымойте Вену, изменив PBS 2 - 3 раза, чтобы удалить избыток крови. Хранить вен путем замораживания при температуре-80 ° C.

2. Подготовка Decellularization установок и Recellularization биореактор

Примечание: Использование ножницами, вырезать силиконовой трубки, как показано в таблице 1.

  1. Decellularization Настройка 1 (Тритон X-100 перфузии и стирка)
    1. До 2 Л палаты (пластиковое корыто), ленты все три части трубки A, как показано на рисунке 1A.
      Примечание: Ленты одной трубки к одной стене, где край касается нижней палаты (моющее средство на входе) и другие две трубы на противоположной стене на расстоянии 5-10 см между ними в зависимости от длины Вену. По крайней мере 5 см этих труб должны быть скреплены клейкой лентой, Пол камеры (вен на входе и выходе).
    2. Используя соединители Luer мужского и женского пола, подключить в серии входе моющего средства, чтобы труба B следуют трубки F, труба C и наконец на входе в Вену. Место трубку F в кассету Перистальтический насос я.
    3. Возьмите другой трубки C и подключите один конец к розетке вен. Поместите другой конец в стеклянную банку с нижней шланг розетки, которая помещается 45 см выше камеры (моющие средства розетки) и ленту его обеспечить. Возьмите трубку G и вставьте один конец шланга выходе стеклянную банку и поместите другой конец в зале Вены.
      Примечание: Фотографии полной установки (красные стрелки), камеры и направление потока (белые стрелки) показаны на рисунке 1A.
  2. Decellularization установка 2 (для TnBP перфузии)
    1. Возьмите стеклянный кувшин емкостью 1 Л и поместите один конец трубки C (стиральный порошок вход) в банку до тех пор, пока трубка касается нижней банку.
    2. Подключите другой конец трубки F следуют трубки C. место другой конец трубки C в банку до половины глубины (Вены в входе). Место трубки F в кассету Перистальтический насос я.
    3. Возьмите трубу D и поместите один конец в банку (Вены в розетке) до половины глубины и другой конец в стеклянную банку с Нижний шланг, помещены на высоте 45 см от Вены в входе (моющие средства розетки). Для обеспечения безопасности, лента моющее впускных и выпускных труб.
    4. Стеклянный кувшин емкостью 1 Л на магнитную мешалку и удержание магнита внутри бутылки.
    5. Возьмите трубку G и вставьте один конец на выходе шланга стеклянную банку и поместите другой конец в стеклянный кувшин емкостью 1 Л.
      Примечание: Изображение полной установки (красные стрелки), камеры и потока направление (белые стрелки) показан на рисунке 1B.
  3. Decellularization установка 3 (для DNase перфузии)
    1. Возьмите стеклянная бутылка 250 мл и место оба конца трубки C. место средней области трубки в кассету перистальтического насоса II.
      Примечание: Один конец трубки входе решения и другой конец трубки соединен с Вены в входе. Вены в выходе остается свободной в растворе.
    2. Поместите все установки, включая насос при 37 ° C. Изображение полной установки и направление потока показан на рисунке 1 c.
  4. Recellularization реактор
    1. Как показано на рисунке 2Адержите наготове всех частей.
    2. Как показано на рисунке 2B, Возьмите крышку 4-портовый и вставьте в каждый порт, трубы H (Вены в розетке), Труба I (СМИ на входе) и труба J (Вены в входе). Вставьте другой конец трубки H 4th (СМИ).
      Примечание: По мнению 4-портовый колпачок от верхней показано в рисунке 2 c. Для легко вставки труб сократить края острым концом с ножницами.
    3. Бенд на другом конце трубки J в форме U и связать его с швом. Подсоедините сокращение внутренней концы трубы H & Дж.
    4. Уложите стеклянная бутылка 250 мл тюбик 60 мл с плоским дном и затем поместите выше сделанные установки в трубу, как показано на рисунке 2D. Как показано на рисунке 2E, подключение труб K, E и K в серии. Подключите один трубки K на входе вен и другой трубки K СМИ к входу.
      Примечание: Схема установки, и направление потока рассматривается в рисунке 2F.
    5. Стерилизация автоклавированием биореактор.

3. Приготовление растворов

  1. Решение 1 (10 x воды): до 1 Л сверхчистой воды, добавить 2 g азид натрия и 18,6 г Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Размешайте до растворения соли.
  2. Решение 2 (1 x воды): 100 мл раствора 1 и добавить 900 мл ультрачистая вода.
  3. Решение 3 (5 x X-100 Тритон): 950 мл сверхчистой воды, добавить 50 мл X-100 Тритон, 1 g азид натрия и 9,3 г ЭДТА. Размешайте до растворения.
  4. Решение 4 (1 x X-100 Тритон): 200 мл раствора 3 и добавить 800 мл ультрачистая вода.
  5. Решение 5 (1 x TnBP): добавить 10 мл с пипеткой 10 мл TnBP 990 мл раствора 2.
  6. Решение 6 (40 Кунитц единиц/мл DNase): добавить Кунитц 2000 единиц DNaseI в 50 мл Дульбекко фосфат буфер солевой содержащие CaCl2 и MgCl2. Подготовьте свежие и немедленно использовать.
  7. Решение 7 (PBS): Добавьте 24 г натрия хлорида, 0,6 г хлористого калия, 4.32 г натрия фосфата и 0,72 g фосфат калия 3 Л сверхчистой воды. Размешайте до растворения. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4. Стерилизовать 1л PBS в автоклаве и хранить отдельно.
  8. Решение 8 (0,1% надуксусной кислоты): до 50 мл стерильного раствора 7, 50 мкл надуксусной кислоты. Подготовьте свежие и немедленно использовать.

4. Подготовка эндотелиальной среднего

  1. Добавьте 5 мл L-глютамином, 5 мл анти анти, 50 мл сыворотки человека AB и все компоненты комплекта ЭГМ-2 фактора роста за исключением плода бычьим сывороточным до 500 мл MCDB131 среды под капотом стерильные.

5. decellularization подкожной вены

  1. Оттепель человека подкожной вены от-80 ° C при комнатной температуре. Снова заморозить при температуре-80 ° C и снова разморозить при комнатной температуре.
  2. Биопсия длиной 2 мм с помощью ножниц вырежьте и исправить в формальдегиде за 24-48 ч при комнатной температуре. Галстук каждый конец вен для барбусов мужского и женского пола Luer соединитель с швом.
  3. Подключите Вену к decellularization установки 1 и заполнить 1 Л раствора 2. Perfuse за 15 мин на 35 мл/мин Вылейте содержимое установки.
  4. Добавить 1 Л раствора 4 и perfuse для 4 h на 35 мл/мин Вылейте содержимое установки.
  5. Добавьте 500 мл раствора 2 и perfuse за 5 минут Вылейте содержимое установки. Повторите этот шаг. Отключите Вену от перфузии установки 1 и подключитесь к перфузии установки 2.
  6. Добавить 1 Л раствора 5, включите мешалки и perfuse для 4 h 35 мл/мин.
    Примечание: Решение 5 выглядит ясно после поворота на мешалку и во всей перфузии.
  7. Отключите Вену от перфузии установки 2 и мыть Вены в снаружи и внутри шприца или пипетки 10 мл 4 изменения ультрачистая вода для 5-10 мин.
  8. Подключите Вену к перфузии установки 3, добавить 50 мл раствора 6 и perfuse в 10 мл/мин в камере 37 ° C, 4 ч. Вылейте содержимое установки и отключения Вену от установки.
  9. Подключите Вену к перфузии установки 1, заполните 1 Л раствора 2 и perfuse всю ночь на 35 мл/мин повторите шаг 5.4 к шагу 5.9 4 раза (для в общей сложности 5 циклов). Взять биопсию снова, как указано в шаге 5.2.
    Примечание: Пропустить шаг 5.8 второй части в циклах 1 и 3.
  10. Вылейте содержимое установки. Заполните 1 Л раствора 2 и perfuse за 24 ч составляет 35 мл/мин изменения решение 2 после 12 h. Вылейте содержимое установки. Заполните 1 Л ультрачистая вода и perfuse за 24 ч составляет 35 мл/мин изменения ультрачистая вода после 12 h.Empty содержание установки. Заполните 1 Л раствора 7 и perfuse за 24 ч составляет 35 мл/мин изменения решения 7 после 12 ч.

6. Проверка Decellularization

  1. Вымойте формалин фиксированной биопсий в ультрачистая вода для 15 минут процесс в ткани процессора, следующие стандартные протоколы и внедрить в парафин22.
  2. Вырезать 5 мкм разделы, используя микротом и пятно с Мейер гематоксилином и 0,2% алкогольных эозином (H & E) после22стандартных протоколов.
  3. Вид под микроскопом для проверки потери ядер в decellularized ткани, по сравнению с нормальной ткани.

7. recellularization

  1. Стерилизуйте Вену, поместив его в Тюбик 50 мл, содержащие 50 мл раствора 8. Агитировать на 80 оборотов в минуту (об/мин) в шейкер для 1 ч при 37 ° C.
  2. Обработайте Вены под ламинарным потоком (ЛВС) кабинета теперь для поддержания стерильности. Передача вен с помощью стерильных щипцы для новый Тюбик 50 мл, содержащие 50 мл стерильного раствора 7 и 500 мкл анти анти. Агитируйте как указано выше для 12 h. изменение решения 7 по крайней мере дважды в между.
  3. С помощью стерильный пинцет, передать новый Тюбик 50 мл Вену и добавьте 50 мл эндотелиальной средств массовой информации. Агитируйте как указано выше для 11 h.
  4. Соберите биореакторе с использованием стерильных перчаток под ЛВС кабинета. Галстук вен в биореакторе вен входе и выходе с шовный материал стерильный и щипцы.
  5. Подключите Вену для биореактора и заполнить с той же среде. Добавление гепарина на 50 МЕ/мл и perfuse за 1 час на 2 мл/мин в 37 ° C.
  6. Сбор 15-25 мл свежей крови (в зависимости от длины вен) от донора в гепарина с покрытием vacutainer трубы и разбавить 1:1 с решения Стин. Позже добавьте желез внутренней секреции производные Сосудистый эндотелиальный фактор роста (EG VEGF, 80 нг/мл), основные фибробластический фактор роста (b ФБП, 4 мкл/мл) и ацетил салициловая кислота (5 мкг/мл).
  7. Переместить биореактор инкубатора 37 ° C с 5% CO2 и perfuse в течение 48 часов в 2 мл/мин.
  8. Примерно через 12 ч, переместите биореактор ЛАФ кабинета, принимать капли крови и измерения с помощью устройства контроля уровня глюкозы в крови глюкозы. Если уровень менее 3 ммоль/Л, добавить глюкозы принести в диапазоне 7-9 ммоль/л. повторить этот шаг каждые 8-12 ч.
  9. После 48 ч переместить биореактор в ЛВС кабинета и слива крови от биореактор. Добавьте 30 мл стерильного раствора 7 и perfuse на 5 мин слива раствора. Добавьте 30 мл стерильного раствора 7 и perfuse на 5 мин повторить дважды, или до тех пор, пока кровь красный цвет теряется.
    Примечание: Биопсии могут быть приняты для проверки ячейки вложения. Отключите Вену, вырезать 5 мм края Вены с ножницами и отбросить их. Взять биопсию, как указано в шаге 5.2 и снова подключите Вену для биореактора (необязательный шаг).
  10. Добавить 30-45 мл эндотелиальной средне и perfuse за 96 ч в инкубаторе в 2 мл/мин.
    Примечание: Добавьте эндотелиальной среднего до Вены погружен.
  11. Переместить биореактор в кабинет, ЛВС, отключите recellularized вен, вырезать 5 мм края вен с помощью ножниц и отбросить. Как указано в шаге 5.2 взять биопсию.

8. Проверка Recellularization

  1. Следуйте инструкциям в разделе 6 и выполнять H & E окрашивания. Просмотрите слайды под микроскопом на наличие клеток.

Representative Results

Валового морфология нормальные Вены это свет красного (рис. 3A). Красный цвет теряется в прогрессивной decellularization циклов (цикл 2, рисунок 3B; цикл 3, рис. 3 c) и 5й циклом, он выглядит бледно и белый (рис. 3D). Recellularized вен после перфузии крови (Рисунок 3E) и эндотелиальных СМИ перфузии (Рисунок 3F) выглядит ярко-красного цвета. 5 циклов лечения decellularization успешно удален клетки из Вены как не синий ядер в H & E окрашивание (рис. 4B) были замечены. В отличие от несколько ядер были замечены в нормальной ключе (рис. 4A). Наличие вложенных клеток на стороне Люминал рассматривается в H & E пятнать в recellularized ключе с кровью за 48 ч (рис. 4 c, черные стрелки) и после перфузии с эндотелиальной средой для 96 h (рис. 3D, черные стрелки).

Figure 1
Рисунок 1 : Монтаж установок перфузии для decellularization. A) изображения показаны собранные decellularization установки 1 для X-100 Тритон и стирки. Белые стрелки показывают пути потока для решения и красные стрелки показывают впуски и выпуски для вен и решений. B) картина собрал decellularization установки 2 для TnBP перфузии. Точно так же как и decellularization установки 1, белые стрелки указывают пути потока для решения и красные стрелки показывают впуски и выпуски для вен и решений. C) картина собрал decellularization установки 3 для дезоксирибонуклеаза перфузии. Белые стрелки показывают пути потока для решения и красные стрелки показывают вводов для вен и решений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 2
Рисунок 2 : Подготовка и монтаж биореактора для recellularization. A) изображения показаны материалы, необходимые для сборки биореактор. B) картина внутри 4-Порт Кап показаны размещение сокращения разъемы (красные стрелки), указывает на подключения вен входе и выходе (белые стрелки) и расположения трубы H, I и Дж. Свободный конец трубки H помещается в биореактор для возврата средств массовой информации. C) можно увидеть соответствующие трубы, и происходит от верхней части 4 Порт Кап. D) картинка, показывающая собрал биореактора. E) картинка, показывающая весь биореактор установки с перистальтического насоса. Трубы K расширить соединения от биореактор перистальтического насоса. F) схематическое представление всего биореактор перфузии системы. Оранжевые стрелки показывают направление потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 3
Рисунок 3 : Общая морфология вен во время decellularization и recellularization. A) валовой морфология нормальные Вены выглядит ярко-красного цвета. С увеличением числа циклов decellularization теряется цвет B) цикл 2 и C) цикл 3. D) по 5 циклов, вен выглядит бледно и белый. Вен после perfusing с E) кровь для 48 h и F) с эндотелиальной среднего за 96 ч выглядит еще раз ярко-красного цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Характеристика вен decellularized и recellularized. Гематоксилином и эозином, окрашивание образ A) нормальной ключе содержит много синий ядра, но они отсутствуют в B) decellularized вен. В том духе, recellularized с C) кровь за 48 ч и с D) заметил эндотелиальной среднего за 96 ч, вложение клеток (черные стрелки) на просвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Discussion

Техника, представленные здесь для decellularization подкожной вены это легкий, простой и экономичный метод, который также может быть применен для всех вен малого диаметра как молочной и пупочную Вены. От наших предыдущих результатов6,7decellularization решения и их концентрации, используемые в этом методе. Несмотря на то, что мы рекомендуем 5 циклов decellularization, в некоторых венах мы также заметили, полный decellularization в 3 циклов. Однако воспроизводимые результаты были получены с помощью 5 циклов. Применяя этот протокол, мы decellularized вен различной длины до 30 см успешно (неопубликованные результат). Отмена решения decellularization розетки 45 см создаст давление 33 мм рт.ст, внутри Вены. В нашем опыте мы заметили это как ключевой шаг в decellularizing весь вен равномерно и можно воспроизвести в 5 циклах. Выбранной давление 3 раза выше, чем давление нормальное подкожной вены (5-10 мм рт.ст.), но что же, как и некомпетентных вен (варикозное расширение вен)23. Кроме того мы предположить, что это высокое давление создаст значительные силы на ключе стен и может таким образом, помочь в эффективной и быстрой клеток удаления.

Так как TnBP нерастворимые в воде и органических растворителей, помешивая моющего средства до тех пор, пока она становится мутным имеет важное значение; в противном случае будет плавать моющего средства. По той же причине чтобы держать TnBP смешанные в растворе, моющее отводной трубки был помещен в верхней части стеклянной банке с шланг розетки. Эффективное удаление TnBP из Вены после ее использования в ходе каждого цикла можно увидеть отсутствие плавающей TnBP капельки в промывают водой. Мы также заметили, что пропуск DNase шаг также производятся decellularized ткани, но в некоторых случаях, было замечено сравнительно высокое содержание ДНК в decellularized ткани. Как высокого давления и высокого расхода не требуются для эффективной деятельности DNase, может использоваться низкой перфузии курс (10 мл/мин). Различные Перистальтический насос был использован как его меньшего размера помогает в управляемость установки. Поскольку мы заметили что повреждение большинства клеток во время decellularization результаты в цикле 2, мы предлагаем пропуск DNase лечения во время циклов 1 и 3 (неопубликованные результат). Даже несмотря на то, что квалификация и количественная оценка белков внеклеточного матрикса, не были выполнены в этой рукописи, наш предыдущий опыт с аналогичными decellularization протоколы показали сохранение биомеханических свойств, внеклеточная матрица структуры и белки7. Хотя наши предварительные количественной эксперименты с этих вен подготовила аналогичный результат (Неизданное), наши уже опубликованные результаты будут укреплять эту уверенность.

Recellularization с помощью крови является удобный и простой процесс над клеток костного мозга расширен как можно избежать долго раз расширения ячейки, спонтанной мутации в расширенной клетки, хирургические вторжения и дискомфорт для пациента. Поскольку известно, что endothelialization может также произойти от циркулирующих Пэк, мы предположили, что перфузии с кровью, следуют перфузии с эндотелиальной среднего будет достаточно для recellularization. Безопасность Вену тканей, разработанные с помощью аналогичного метода видно из успешные результаты трансплантации, когда два таких Вены были имплантированы в детей с дополнительной печеночной воротной вены непроходимость7. Мы предположить, что факторов роста в decellularized внеклеточного матрикса позволят вложение циркулирующих Пэк от крови24. Recellularization вен после аналогичного протокола показал положительный для рецепторов VEGF-2 и Кластер дифференцировки (CD) 14 на просвет при CD45, выражая клетки были замечены в адвентиции7клетки. Мы также представить, что непрерывное эндотелиального слоя не могут наблюдаться во всех случаях, особенно при использовании крови от старых и больных пациентов, как известно, что таких лиц сократилось количество циркулирующих прогениторных клеток25. Однако, мы утверждать, что перфузии с получателя крови может скрыть многие антигены, которые подвергаются из-за decellularization и таким образом может уменьшить вероятность неблагоприятных воспалительных реакций, когда пересаженные в отличие от пересадки только decellularized кровеносных сосудов. Кроме того перфузии крови могут депонировать повышение уровня факторов роста на просвет и адвентиции, который в свою очередь может набирать рост числа циркулирующих клеток-предшественников в результате быстрого процесса recellularization в естественных условиях.

Преимущества конструкции биореактора, используемые в данном исследовании являются полным автоклавирования, легкий монтаж, рентабельность, управляемость и наименее возможность повреждения. По нашему опыту используя текущий дизайн, Вены были recellularized до 10 см в длину. Даже если Вены до 25 см в длину также может быть recellularized, сохраняя Вену в форме «U» внутри биореактора, это должны быть проверены. Дизайн реактор показывает, что направление потока в духе против силы тяжести и предназначен как таковой, потому что это нормальное направление потока для этих вен в организме человека. 12 h перфузии эндотелиальной средний шаг является предпосылкой Вену и увеличить сродство для вложений входящих ПЭК. Добавление дополнительных гепарин и перфузии для 1 h снизит риск формирования сгустков крови в пробирках во время перфузии крови.

Объем крови требуется зависит от длины Вену. Основной принцип, который мы следуем за объем крови является, что Вены должен быть погружен в крови. Во время перевалки крови больше, чем 45 мл, время от времени перемешивания может потребоваться для предотвращения накопления клеток в нижней части биореактор. Мы добавили решение Стин в крови, поскольку он содержит большое количество белков и компоненты, необходимые для поддержания здоровых тканей во время трансплантации органа26,27. Добавление VEGF и b ФБП выгодно, поскольку они являются мощным ангиогенных факторов роста28 , и их присутствие вызывает миграция, пролиферации и дифференцирования Пэк29,,3031,32 . Количество VEGF добавил основано на наших предыдущих неопубликованным результатам, где распространение Пэк был замечен на 80 нг/мл. Добавление аспирин подавляет активации тромбоцитов33 таким образом уменьшая вероятность их привязанность к эндотелиального слоя. Непрерывный мониторинг и добавлением глюкозы также будет полезным для пролиферации клеток и предотвращения гемолиза эритроцитов.

Поскольку от получателя требуется только простое крови, он может рассматриваться как легко и практически осуществимые процедуры, требующие меньше технического опыта. Несмотря на то, вся процедура показано здесь от начала до конца занимает 20 дней, хранение decellularized вен как полки продукт будет сократить процедуру до 8 дней для пациентов. Хотя технически хранения decellularized вен не должно сказаться на эффективности recellularization, должны быть оценены. Ткани инженерии вен генерируется после этой процедуры может использоваться в клинике для обхода кабинетов, заменив затрудненные вен, венозная недостаточность приводит к варикозного расширения вен без необходимости иммуносупрессия и таким образом обеспечивая лучшее качество жизнь для пациента.

Disclosures

SSH проводит акции в Verigraft, компания, которая владеет лицензией на технологию ткани инженерных кровеносных сосудов. Другие авторы имеют ничего не разглашать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить профессор Anders Джепсона за помощь в предоставлении кровеносных сосудов, используемых в экспериментах. Это исследование финансируется грантом LUA ALF для SSH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Port Cap CPLabSafety WF-GL45-4Kit
Acetyl salicylic acid Sigma Aldrich A5376
Anti-Anti Life Technologies 15240-062
B-FGF Lonza cc-4113B
Blood Glucose monitoring system - Free style Lite Abbott 70808-70
D-Glucose Sigma Aldrich G8769
DNase-I Worthington LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
EDTA disodium salt dihydrate AlfaAesar A15161.OB
EGM-2 Growth Factors Kit Lonza CC-4176
EG-VEGF Peprotech 100-44
Glass bottle 250ml VWR 2151593 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass bottle 1L VWR 2151595 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass jar 500ml with bottom hose outlet Kimble Chase Life Science 14607
Heparin Leo 387107
Heparin Coated Vacutainer Tubes Becton Dickinson 368480
Human AB Serum Sigma Aldrich H3667
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Luer Female with 1/8" ID Barb Oina LF-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Female with 3/32" ID Barb Oina LF-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 3/32" ID Barb Oina LM-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 1/8" ID Barb Oina LM-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Male with 5/32" ID Barb Cole Parmer EW-45518-06 For 5X8mm silicon tube
MCDB 131 Life Technologies 10372-019
Per acetic acid Sigma Aldrich 433241
Peristaltic pump I Masterflex 7524-45 For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75
Peristaltic pump II Ismatec ISM941 For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Potassium hydrogen phosphate Sigma Aldrich P9791
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm Biotech ISM569A
Shaker Ika KS4000 i  control
Sodium Azide Sigma Aldrich 71290
Sodium chloride Sigma Aldrich 13423
Sodium hydrogen phosphate Merck 71640-M
Steen solution Xvivo 19004
Suture Agnthos 14817
Tri-n-butyl Phosphate AlfaAesar A16084.AU
Triton-X-100 AlfaAesar A16046.OF
Tube 60ml with flat base Sarstedt 60596
Tube A VWR 2280706 Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube B VWR 2280706 Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup
Tube C VWR 2280706 Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3
Tube D VWR 2280706 Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2
Tube E VWR 2280706 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube F VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube G VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube H VWR 2280703 Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup
Tube I VWR 2280703 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube J VWR 2280703 Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup
Tube K VWR 2280703 Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31, (1), 71-81 (1994).
  2. O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1, (1), 136-148 (1984).
  3. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367, (9518), 1241-1246 (2006).
  4. Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377, (9772), 1175-1182 (2011).
  5. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372, (9655), 2023-2030 (2008).
  6. Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380, (9838), 230-237 (2012).
  7. Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1, (1), 72-79 (2014).
  8. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16, (8), 927-933 (2010).
  9. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, (7), 814-820 (2010).
  10. Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18, (6), 727-734 (2005).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, (19), 3675-3683 (2006).
  12. Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33, (9), 2656-2672 (2012).
  13. Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
  14. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
  15. Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22, (3), 208-219 (2016).
  16. Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61, (10), 1609-1616 (2012).
  17. Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115, (8), 929-933 (1980).
  18. Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11, (2), 141-148 (1997).
  19. Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123, (2), 220-230 (1986).
  20. L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12, (3), 361-365 (2006).
  21. Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20, (11-12), 1726-1734 (2014).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014, (6), 655-658 (2014).
  23. Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28, (3), 559-563 (1949).
  24. Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11, (3-4), 199-206 (2004).
  25. van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55, (9), 2501-2512 (2012).
  26. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357, (9259), 825-829 (2001).
  27. Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28, (6), 643-656 (2015).
  28. Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22, (4), 201-207 (2001).
  29. Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9, (15), 1425-1429 (2014).
  30. Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17, (2), BR35-BR41 (2011).
  31. Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29, (11), 1898-1907 (2011).
  32. Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37, (4), 688-693 (2014).
  33. Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142, (1), 41-47 (1985).
Decellularization и Recellularization методика для человека подкожной вены
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).More

Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter