Summary
Her beskriver vi en protokoll for saphenous åre decellularization bruke vaskemidler og recellularization av perfusjon av perifert blod og endothelial medium.
Abstract
Vaskulær rør brukes under de fleste vaskulær operasjoner er allogene eller syntetiske grafts som ofte fører til komplikasjoner forårsaket av immunsuppresjon og dårlig patency. Tissue engineering tilbyr en ny løsning for å generere personlig grafts med en naturlig ekstracellulær matrix som inneholder mottakerens celler ved hjelp av decellularization og recellularization. Vi viser en detaljert metode for å utføre decellularization av menneskelig saphenous åre og recellularization av perfusjon av perifert blod. Venen var decellularized av perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-fosfat (TnBP) og 2000 Kunitz enheter av deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 og TnBP var parfyme på 35 mL/min 4 h mens DNase var parfyme på 10 mL/min på 37 ° C 4 h. Venen ble vasket i ultrapure vann og PBS og deretter sterilisert i 0,1% peredikksyre. Det var vasket igjen i PBS og preconditioned endothelial medium. Venen var koblet til en bioreactor og parfyme med endotelial medium som inneholder 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization ble utført ved å fylle den bioreactor med friskt blod, fortynnes 1:1 i Steen løsning, og legge til endokrine kjertel-avledet vaskulære endotelial vekstfaktor (80 ng/mL), grunnleggende fibroblast vekstfaktorer (4 µL/mL) og acetyl Salicylsyre (5 µg/mL). Bioreactor ble deretter flyttet inn i en inkubator og parfyme for 48 timer på 2 mL/min samtidig glukose mellom 3-9 mmol/L. Senere ble venen vasket med PBS, fylt med endotelial medium og parfyme 96 h i inkubator. Behandling med Triton X-100, TnBP og DNase decellularized saphenous fotsporene i 5 sykluser. Decellularized åre så hvit i motsetning til normal og recellularized årer (rødt). Hematoxylin & eosin (H & E) flekker viste tilstedeværelse av kjerner bare i normalvisning, men ikke i decellularized årer. I recellularized ånd viste H & E flekker tilstedeværelse av celler på luminal overflaten av venen.
Introduction
Vaskulær rør kreves for flere kliniske forhold som aneurysms, arteria carotis stenose og aterosklerose fører til alvorlige vaskulære problemer. Kirurger bruker autologous, fører allogene eller syntetiske vaskulær rør gjenopprette funksjonelle blodtilførselen. Selv om bruken av autologous blodkar fremdeles den ideelle tilnærmingen, er tilgjengeligheten i pasienter majorly begrenset. Alternativer som allogene eller syntetiske grafts har dype problemer med suppressive behandlinger og dårlig patency fører til reoperation1,2, som resulterer i store helse økonomiske byrder til land. Vev utvikling av blodkar mål å gi grafts med en naturlig homologi og autologous celler. Dermed mottaker immunsystemet gjenkjenner transplantert graftet som selv og siden slik en graft inneholder naturlig proteiner og cellene i den opprinnelige konfigurasjonen, kan det fungere bedre i forhold til gjeldende alternativer. Vev utvikling organer, som blæren3, urinrøret4, spor5og årer6,7, har blitt brukt i klinikken.
Tissue engineering å produsere personlig grafts krever en graft fra en donor etterfulgt av decellularization og recellularization. Decellularization er en lovende teknologi å fjerne celler fra vev og organer8,9,10. Decellularization kan utføres av bestemte fysiske, kjemiske og enzymatiske metoder11 eller ved å kombinere dem. For optimal bruk av disse metodene, kan decellularized vev ha lignende strukturelle og funksjonelle proteiner i en ekstracellulær matrix ligner på eget vev. Slike organer har egenverdi evne til å forbedre vedlegg, migrasjon, spredning og differensiering av innkommende stamceller.
Recellularization er en dynamisk seeding celler til graftet, og mottakeren stamceller kan brukes for klinisk transplantasjon. Stilk celler som brukes til slike formål inkluderer benmargen, mesenchymal og orgel beboere3,5,6. Dyr og forsknings-orienterte studier har brukt stamceller fra mesenchymal opprinnelse som fosterets og indusert pluripotent12,13,14. Denne prosessen krever en bioreactor (et kammer som holder venen og gir de nødvendige forholdene som temperatur, gasser, pH og press), celler og kultur medier. Utfordringen i recellularization er å oppnå nødvendig antall celler som en bestemt type og en seeding strategi som cellene kan nå hele vev eller organ. Selv om ingen fullstendig vev eller organ strukturelt og funksjonelt har blitt generert og evalueres før nå, viser flere fremskritt i feltet og resultatene fremtidig mulighet15. Funksjonen nøkkel i venen ligger i luminal endotelet som styrer infiltrasjon av inflammatoriske celler i vev og den midtre glatte muskulatur laget som hjelper i innsnevring og gir også styrke til å holde blodtrykket16. Studier har vist at skade, endothelialization oppstår fra anastomose eller sirkulerende endoteliale progenitor celler (EPCs) i blodet17,18,19. Vår strategi for recellularization av årer er avhengig av EPCs i sirkulerende blod.
Vev utvikling av vener og arterier ble utført av flere grupper etter ulike strategier20,21-med decellularization og recellularization. Vår gruppe har også utført og utviklet decellularization og recellularization strategier for iliaca og melkekjertlene årer6,7. Decellularization ble utført av uro i Åre i Triton X-100, tri-n-butyl fosfat (TnBP) og enzymet deoxyribonuclease (DNase). Recellularization ble utført benmarg avledet endothelial og glatt muskel celler6 eller perifert blod7. Venene recellularized av begge protokoller viste klinisk lover i å gi funksjonelle blodtilførsel i transplantasjon av pediatriske pasienter med ekstra hepatic portalen blodåre obstruksjon6,7.
Vi har nå utviklet en modifisert versjon av den samme protokollen for forbedret og enkel utførelsen av decellularization, recellularization og bioreactor håndtering av liten diameter årer. Gjeldende decellularization protokollen kreves perfusjon av vaskemidler gjennom åre med press i stedet for omrøring med vaskemidler. Recellularization protokollen innebærer et ekstra trinn i preconditioning for å forbedre celleadhesjon og tillegg av vekstfaktorer i sirkulerende blod for å forbedre celle vedheft, overlevelse og spredning. Vi har også forbedret design av bioreactor bruke kommersielt tilgjengelige produkter. I dette papiret presentere vi en detaljert beskrivelse av endret protokoll for decellularization og recellularization av menneskelig saphenous årer.
Protocol
Vevet brukes, og protokollen for dette dokumentet følger etiske retningslinjer Göteborgs universitet.
1. vev forberedelse og lagring
- Kuttet de omkringliggende vev fra Hentet saphenous fotsporene med kirurgisk tang og saks.
Merk: Saphenous åre er dissekert fra lavere lem av mennesker av vaskulær kirurger. Saphenous åre brukes i dette papiret er en ubrukte delen etter bypass operasjon. - For å forhindre lekkasje under perfusjon, ligate alle sidegreiner i deres ender med suturer og tang.
- Holde venen i et 50 mL rør som inneholder 40 mL fosfat buffer saltoppløsning (PBS). Vask venen ved å endre PBS 2 - 3 ganger å fjerne overflødig blod. Lagre venen ved å fryse på-80 ° C.
2. forberedelse av Decellularization oppsett og Recellularization Bioreactor
Merk: Med saks, kuttet silisium rør som vist i tabell 1.
-
Decellularization oppsett 1 (For Triton X-100 perfusjon og vask)
- Til en 2 L kammer (plast badekar), tape hele settet av A som vist i figur 1A.
Merk: Tape en tube til en vegg der kanten berører bunnen av kammeret (vaskemiddels inntak) og de andre to rør til motsatt vegg med en avstand på 5-10 cm mellomrom avhengig av lengden på venen. Minst 5 cm disse rørene bør også bli tapet til kammeret gulvet (blodåres innløp og utløp). - Ved hjelp av de mannlige og kvinnelige Luer kontaktene, koble i serien vaskemiddels inlet tube til rør B etterfulgt av rør F, rør C og til slutt i blodåre innløpet. Sted røret F i kassetten av den peristaltiske pumpe jeg.
- Ta en annen tube C og koble den ene enden til den venen stikkontakt. Plasser den andre enden i glasskrukke med bunnen slangen uttaket som plasseres 45 cm over kammeret (vaskemiddel utløp) og tape den sikre. Ta tube G og skyv en ende inn i slangen uttaket av glasskrukke og plasser den andre enden inn i venen kammeret.
Merk: Bilder av fullstendig installasjon (røde piler), kammer og flytretningen (hvite piler) er vist i figur 1A.
- Til en 2 L kammer (plast badekar), tape hele settet av A som vist i figur 1A.
-
Decellularization oppsett 2 (For TnBP perfusjon)
- Ta en 1 L glasskanne, og plasser den ene enden av C (vaskemiddel innløp) i glasset til røret berører glasset er bunnen.
- Koble den andre enden til tube F etterfulgt av rør C. sted den andre enden av røret C i glasset til halv dybde (blodåres inlet). Plassere rør F i kassetten peristaltiske Pump jeg.
- Ta tube D og sett ene enden i glasset (blodåres utløp) til halv dybde og den andre enden i glasskrukke med bunnen slangen plassert på en 45 cm høyde fra venens vik (vaskemiddel utløp). For å sikre, tape den vaskemiddel innløp og utløp rør.
- Plasser 1 L glasskanne på en magnetisk rørestang og holde magneten i flasken.
- Ta tube G og skyv en ende på slangen uttaket av glasskrukke og plasser den andre enden i 1 L glasskrukke.
Merk: Bildet av komplett oppsett (røde piler), kammer og flyt retning (hvite piler) er vist i figur 1B.
-
Decellularization oppsett 3 (For DNase perfusjon)
- Ta en 250 mL glassflaske og plassere begge ender av C. sted det midtre området av røret i kassetten peristaltiske Pump II.
Merk: En ende av røret er løsningen innløp og den andre enden av røret er koblet til venens inlet. Venens utløp igjen i løsningen. - Plassere hele oppsettet inkludert pumpen på 37 ° C. Bildet av komplett oppsett og flyt retning er vist i figur 1 c.
- Ta en 250 mL glassflaske og plassere begge ender av C. sted det midtre området av røret i kassetten peristaltiske Pump II.
-
Recellularization Bioreactor
- Hold klar alle delene som vist i figur 2A.
- Som vist i figur 2B, ta 4-port hetten og inn hver port, rør H (blodåres utløp), rør jeg (media inntak) og rør J (blodåres inlet). Sett den andre enden av røret H til 4th porten (media utløp).
Merk: Visningen av 4-port cap fra toppen er vist i figur 2C. For enkel innsetting av rør, klippe kantene til en skarp poeng med en saks. - Bøy den andre enden av røret J i en U-form og knytte det med en Sutur. Koble redusere koblingene til de indre sluttene av tubes H & J.
- Sett 60 mL røret med flat bunn i 250 mL glassflaske og plasser over laget oppsettet inn i røret som vist i figur 2D. Som vist i figur 2E, koble rør K, E og K i serien. Koble en tube K til venens innløp og en annen tube K i media innløpet.
Merk: Skjematisk diagram av oppsett og flyt retning er sett i figur 2F. - Sterilisere bioreactor av autoklavering.
3. forberedelse av løsninger
- Løsning 1 (10 x vann): 1 L ultrapure vann, legge 2 g Natriumazid og 18.6 g ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA). Rør til oppløst salter.
- Løsning 2 (1 x vann): ta 100 mL løsning 1 og legge 900 mL ultrapure vann.
- Løsning 3 (5 x Triton X-100): 950 mL ultrapure vann, legge 50 mL av Triton X-100, 1 g Natriumazid og 9,3 g av EDTA. Rør helt oppløst.
- Løsning 4 (1 x Triton X-100): ta 200 mL løsning 3 og legge 800 mL ultrapure vann.
- Løsning 5 (1 x TnBP): legge til 10 mL av TnBP med en 10 mL pipette 990 mL løsning 2.
- Løsning 6 (40 Kunitz enheter/mL DNase): legge til 2000 Kunitz enheter av DNaseI i 50 mL av Dulbeccos fosfat Buffer Saline inneholder CaCl2 og MgCl2. Forberede frisk og bruke umiddelbart.
- Løsning 7 (PBS): Legge til 24 g natriumklorid, 0,6 g av kalium klorid, 4.32 g av natrium fosfat og 0,72 g av kalium fosfat 3 L ultrapure vann. Rør helt oppløst. Justere pH 7,4. Sterilisere 1 L PBS i autoclave og lagre separat.
- Løsning 8 (0,1% peredikksyre): 50 mL av sterile løsning 7, legge til 50 µL av peredikksyre. Forberede frisk og bruke umiddelbart.
4. forberedelse av Endothelial Medium
- Legge til 5 mL av L-glutamin, 5 mL av anti-anti, 50 mL av humant AB serum og alle komponenter av EGF-2 vekstfaktor kit unntatt fosterets bovin serum til 500 mL MCDB131 mediet under sterilt hette.
5. decellularization av Saphenous vene
- Tine menneskelige saphenous åre fra-80 ° C ved romtemperatur. Fryse igjen ved-80 ° C og tine igjen ved romtemperatur.
- Skjær en biopsi 2 mm lengde med saks og fikse i formaldehyd 24-48 h ved romtemperatur. Knytte hver ende av venen til mothaker av en mannlig og kvinnelig Luer kontakt med en Sutur.
- Koble fotsporene til decellularization oppsett 1 og fyll 1 L løsning 2. Perfuse for 15 min på 35 mL/min. tømme innholdet i oppsettet.
- Legg 1 L løsning 4 og perfuse for 4 h på 35 mL/min. tømme innholdet i oppsettet.
- Legg til 500 mL løsning 2 og perfuse for 5 min. tømme innholdet i oppsettet. Gjenta dette trinnet. Koble venen fra perfusjon oppsett 1 og koble til perfusjon oppsett 2.
- Legg 1 L løsning 5, slå på rørestang og perfuse 4 h på 35 mL/min.
Merk: Løsning 5 ser skyet etter å slå av rørestang og hele perfusjon. - Koble venen fra perfusjon oppsett 2 og vask venens ute og inne med sprøyte eller en 10 mL pipette 4 endringer ultrapure vann i 5-10 min.
- Koble fotsporene til perfusjon oppsett 3, legge til 50 mL løsning 6 og perfuse på 10 mL/min i en 37 ° C kammer for 4 h. tømme innholdet i oppsettet og koble venen fra oppsettet.
- Koble fotsporene til perfusjon oppsett 1, fyll 1 L løsning 2 og perfuse over natten på 35 mL/min. Gjenta trinn 5.4 til trinn 5.9 4 ganger (for en totalt av 5 sykluser). Ta en biopsi igjen som nevnt i trinn 5.2.
Merk: Hopp over trinn 5,8 andre delen i sykluser 1 og 3. - Tømme innholdet i oppsettet. Fyll 1 L løsning 2 og perfuse 24 h på 35 mL/min. Change løsning 2 etter 12 h. tømme innholdet i oppsettet. Fyll 1L ultrapure vann og perfuse 24 h på 35 mL/min. endre ultrapure vannet etter 12 h.Empty innholdet i oppsettet. Fyll 1 L løsning 7 og perfuse 24 h på 35 mL/min. Change løsning 7 etter 12 h.
6. bekreftelse av Decellularization
- Vask formalin fast biopsier i ultrapure vann i 15 min. prosessen i en vevsprosessor etter standardprotokoller og bygge inn i parafin22.
- Kutte 5 µm seksjoner med en mikrotom og beis med Meyer hematoxylin og 0,2% alkoholholdige eosin (H & E) standardprotokoller22.
- Vis under et mikroskop etter tap av kjerner i decellularized vev i forhold til normalt vev.
7. recellularization
- Sterilisere venen ved å plassere den i en 50 mL tube som inneholder 50 mL løsning 8. Rist på 80 rotasjoner per minutt (rpm) i shaker 1t på 37 ° C.
- Håndtere venen under laminær strømning (LEIV) regjering fra nå av å opprettholde sterilitet. Overføre venen bruker sterilt tang til en ny 50 mL tube som inneholder 50 mL av sterile løsning 7 og 500 µL av anti-anti. Agitere som ovenfor for 12 h. endre løsning 7 minst to ganger i mellom.
- Bruker sterilt tang, overføre fotsporene til en ny 50 mL tube og legge 50 mL av endothelial media. Agitere som ovenfor for 11 h.
- Montere bioreactor bruker sterilt hansker under LEIV kabinett. Tie fotsporene til bioreactor blodåre innløp og utløp med sterilt Sutur og tang.
- Koble fotsporene til bioreactor og fyll med samme medium. Legger til heparin 50 IU/mL og perfuse 1t på 2 mL/min med 37 ° C.
- Samle 15-25 mL av frisk blod (avhengig av venens lengde) fra donor i heparin belagt vacutainer rør og fortynne 1:1 med Steen løsning. Senere, legge til endokrine kjertel-avledet vaskulær endotelial vekstfaktor (EG-VEGF, 80 ng/mL), grunnleggende fibroblast vekstfaktor (b-FGF, 4 µL/mL) og acetyl Salicylsyre (5 µg/mL).
- Flytte bioreactor til en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og perfuse for 48 timer på 2 mL/min.
- Lag etter 12 h, flytte bioreactor til en LEIV skap, ta en dråpe blod og måle ved bruk av en blodsukker overvåking enhet. Hvis nivået er mindre enn 3 mmol/L, legge til glukose å bringe i rekken av 7-9 mmol/L. Gjenta dette trinnet hver 8-12 h.
- Etter 48 timer, flytte bioreactor til LEIV skap og avløp blod fra bioreactor. Legg til 30 mL av sterile løsning 7 og perfuse for 5 min. avløp løsningen. Legg til 30 mL av sterile løsning 7 og perfuse for 5 min. Gjenta to ganger eller til blod røde fargen går tapt.
Merk: Biopsy kan tas for bekreftelse av cellen vedlegget. Koble blodåre, kuttet 5 mm kantene i venen med saks og kaste seg. Ta en biopsi som nevnt i trinn 5.2 og koble venen igjen til bioreactor (valgfritt trinn). - Legg til 30-45 mL endothelial medium og perfuse 96 h i kuvøse på 2 mL/min.
Merk: Legge til endotelial medium til venen er neddykket. - Flytte bioreactor til LEIV kabinettet, koble recellularized åre, kuttet 5 mm kantene i venen med saks og kast. Ta en biopsi som nevnt i trinn 5.2.
8. bekreftelse av Recellularization
- Følg instruksjonene i §6 og utføre H & E flekker. Undersøke lysbildene under et mikroskop for tilstedeværelsen av celler.
Representative Results
Brutto morfologi av en normal stemning er lys rød (figur 3A). Den røde fargen går tapt i progressiv decellularization sykluser (syklus 2, figur 3B, sykle 3, Figur 3 c) og av 5th syklusen, det ser blek og hvit (figur 3D). Recellularized åre etter blodperfusjon (figur 3E) og endothelial media perfusjon (figur 3F) ser rød i farge. 5 sykluser av decellularization behandling fjernet er cellene fra venen som ingen blå atomkjerner i den H & E flekker (figur 4B) ble sett. Derimot ble flere atomkjerner sett i normal retning (figur 4A). Tilstedeværelsen av tilknyttede celler på luminal side er sett i H & E flekker i recellularized stemning med blod 48t (figur 4C, svarte piler) og etter perfusjon med endotelial mediet 96 h (figur 3D, svarte piler).
Figur 1 : Montering av perfusjon oppsett for decellularization. A) bildet viser samlet decellularization oppsettet 1 for Triton X-100 og vask. Hvite pilene viser strømningsbane løsninger og røde piler indikerer innganger og utganger for vene og løsninger. B) bildet viser samlet decellularization oppsettet 2 for TnBP perfusjon. På samme måte som decellularization oppsett 1, hvite pilene viser strømningsbane løsninger og røde piler indikerer innganger og utganger for vene og løsninger. C) bildet viser samlet decellularization oppsettet 3 for deoxyribonuclease perfusjon. Hvite pilene viser strømningsbane løsninger og røde piler indikerer viker for vene og løsninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Forberedelser og oppsett av bioreactor for recellularization. A) bilde viser materialer som kreves for montering bioreactor. B) bilde av innsiden av 4-port cap viser plasseringen av redusere kontakter (rød pil) peker for å koble blodåre innløp og utløp (hvite piler) og ordning tubes H, jeg og J. Gratis slutten av rør H plasseres i bioreactor å returnere medier. C) respektive rørene kommer ut kan sees fra oversiden av 4 port cap. D) bildet viser den sammensatte bioreactor. E) bildet viser hele bioreactor oppsettet med peristaltiske pumpen. Rør K utvide tilkoblinger fra bioreactor på peristaltiske pumpen. F) skjematisk representasjon av hele bioreactor perfusjon. De oransje pilene viser flyten retningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Brutto morfologi av årer under decellularization og recellularization. A) brutto morfologi av normal blodåre ser rød i farge. Fargen er tapt med økende antall decellularization sykluser B) syklus 2 og C) syklus 3. D) med 5 sykluser, vene ser blek og hvit. Venen etter perfusing med E) blod for 48 h og F) med endotelial mediet 96 h ser igjen rød i farge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Karakteristikk av decellularized og recellularized årer. Den hematoxylin og eosin flekker bildet av A) normal blodåre inneholder mange blå kjerner, men de er fraværende i B) decellularized blodåre. I blodåre recellularized med C) blod 48t og med D) endothelial medium 96 h, feste cellene (svart piler) på lumen ble lagt merke til. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Teknikken presentert her for decellularization av saphenous vener er en enkel og kostnadseffektiv metode som kan også brukes på alle liten diameter årer som navle og melkekjertlene årer. Decellularization løsninger og konsentrasjonene brukes i denne metoden er fra våre tidligere resultater6,7. Selv om vi anbefaler 5 sykluser av decellularization, i visse årer vi la også merke fullstendig decellularization i 3 sykluser. Imidlertid ble reproduserbar resultater oppnådd ved hjelp av 5 sykluser. Bruk denne protokollen, vi decellularized årer av varierende lengde opptil 30 cm vellykket (upublisert resultatet). Løfte decellularization løsningen stikkontakt med 45 cm vil skape et trykk på 33 mmHg inne i venen. I vår erfaring merke vi dette som et avgjørende skritt i decellularizing hele venen jevnt og reproduserbar 5 sykluser. Valgte trykket er 3 ganger høyere enn normalt saphenous åre presset (5-10 mmHg) men er det samme som inkompetente vener (åreknuter)23. I tillegg spekulere vi at denne høytrykk vil skape en betydelig styrke på åre vegger og kan derfor hjelpe i effektiv og raskere fjerne.
Siden TnBP er en organisk løsemiddel og uløselig i vann, røring vaskemiddel til det blir skyet er viktig. ellers flytende vaskemiddel. Av samme grunn, for å holde TnBP i løsning, ble vaskemiddels utløp røret plassert på toppen av glasskrukke med slangen uttaket. Effektiv fjerning av TnBP fra venen etter bruken i hver syklus kan sees ved fravær av flytende TnBP dråper i vasket vannet. Vi har også lagt merke til at hoppe DNase trinnet også produsert et decellularized vev, men i noen tilfeller, en relativt høy DNA innhold i decellularized vev ble lagt merke til. Som høyt trykk og høy flow priser ikke er nødvendig for effektiv DNase aktivitet, brukes en lav perfusjon rate (10 mL/min). En annen peristaltiske pumpe ble brukt som sin mindre størrelse hjelper enkel håndtering av oppsettet. Siden vi lagt merke til at skade de fleste celler under decellularization resultater i syklus 2, bør hoppe DNase behandling under sykluser 1 og 3 (upubliserte resultat). Selv om karakterisering og måling av ekstracellulær matrix proteiner ikke ble utført i dette manuskriptet, vår tidligere erfaring med lignende decellularization protokoller viste bevaring av biomekaniske egenskaper, ekstracellulær matrix struktur og proteiner7. Selv om våre foreløpige kvantifisering eksperimenter med disse årene produsert et lignende resultat (upublisert), vil allerede publisert resultatene styrke denne tilliten.
Recellularization bruke blood er en praktisk og enkel prosess over benmarg utvidet cellene som man kan unngå lenge cellen ekspansjon ganger, spontane mutasjoner i utvidet celler, kirurgisk invasjonen og ubehag for pasienten. Siden det er kjent at endothelialization kan også oppstå sirkulere EPCs, vi hypotesen at perfusjon med blod etterfulgt av perfusjon med endotelial medium vil være tilstrekkelig for recellularization. Sikkerheten til vene vev konstruert ved hjelp av en lignende metode er sett fra vellykkede resultatene av transplantasjon når to slike årer ble implantert i barn med ekstra hepatic portalen blodåre obstruksjon7. Vi spekulere at vekstfaktorer i decellularized ekstracellulær matrix vil tillate feste sirkulerende EPCs fra blod24. Recellularization av årer etter en lignende protokoll viste celler positivt for VEGF reseptor-2 og cluster for differensiering (CD) 14 på lumen mens CD45 uttrykke celler ble sett i adventitia7. Vi også tenke seg at et kontinuerlig endothelial lag ikke kan være observert i alle tilfeller særlig når benytter blod fra eldre og syke pasienter som det er kjent at slike individer har redusert antall sirkulerende stamfar celler25. Men vi postulere at perfusjon med mottakerens eget blod kan maskere mange av antigener er utsatt på grunn av decellularization og kan dermed redusere sjansene for inflammatorisk bivirkninger når transplantert i motsetning til transplanting bare decellularized blodkar. I tillegg kan blodperfusjon sette inn økte nivåer av vekstfaktorer på lumen og adventitia som i sin tur kan rekruttere økte antall sirkulerende progenitor celler som resulterer i en rask prosess for recellularization vivo.
Fordelene med bioreactor design brukt i denne studien er fullstendig autoklavering, enkel montering, kostnadseffektivitet, enkel håndtering og minst muligheten for skade. I vår erfaring, bruker du gjeldende utforming, årer opp til 10 cm i lengde var recellularized. Selv om vener opptil 25 cm i lengden kan også være recellularized ved å holde venen i "U"-form inni bioreactor, dette skal valideres. Bioreactor design viser at retningen på strømmen i blodåre mot tyngdekraften og utformes slik fordi det er normal retning av flyt for disse årene hos mennesker. 12 h perfusjon av endothelial middels trinnet er å precondition venen og øke affinitet feste innkommende EPCs. Tillegg av ekstra heparin og perfusjon 1t vil redusere risikoen for danner blodpropp i rør under blodperfusjon.
Volumet av blod kreves er avhengig av lengden på venen. Det grunnleggende prinsippet vi følge blodvolum er at venen bør være neddykket i blodet. Under behandling av blod volumer større enn 45 mL, kanskje sporadisk blande må forhindre celle ansamling i bunnen av bioreactor. Vi lagt Steen løsning på blod siden det inneholder en høy mengde proteiner og komponentene som kreves for å opprettholde vev sunn under organ transplantasjon26,27. VEGF og b-FGF er gunstig som de er potente angiogenic vekstfaktorer28 og deres tilstedeværelse induserer migrasjon, spredning og differensiering av EPCs29,30,31,32 . Hvor mye VEGF lagt er basert på tidligere upubliserte resultatene hvor spredning EPCs ble sett på 80 ng/mL. Tillegg av aspirin hemmer aktivering av blodplater33 og dermed redusere sjansene for sin tilknytning til endotelial lag. Kontinuerlig overvåking og tillegg av glukose vil også være fordelaktig for celle spredning og hindre hemolyse av røde blodlegemer.
Siden bare en enkel blodprøve kreves fra mottakeren, kan det betraktes som en lett og mulig prosedyre som krever mindre teknisk ekspertise. Selv om hele prosedyren vist her fra start til slutt tar 20 dager, lagring av decellularized vener som en hyllevare produktet vil forkorte prosedyren til åtte dager for pasienter. Selv om lagring av decellularized vener teknisk ikke bør påvirke recellularization effektivitet, må det bli vurdert. Vev-konstruert årer generert denne fremgangsmåten kan brukes i klinikken til bypass kirurgi, erstatte hindret årer, venøs insuffisiens fører til åreknuter uten behov for uimottakelig undertrykkelse og dermed gi en bedre kvalitet på liv for pasienten.
Disclosures
SSH har aksjer i Verigraft, et selskap som har lisensiert teknologi for tissue engineering blodkar. Andre forfattere ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Professor Anders Jeppsson for hjelp med å gi blod fartøy brukes i forsøkene. Denne studien ble finansiert av LUA ALF stipendet å SSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
References
- Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).
- O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
- Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
- Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).
- Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).
- Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).
- Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).
- Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).
- L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).
- Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).
- van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).
- Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).
- Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).
- Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).
- Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).
- Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).
- Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).
