Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

חקר את הפוטנציאל של תא גזע Mesenchymal גיליון על הפיתוח של קרצינומה Hepatocellular In Vivo

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/57805
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2
1Stem Cell and Regenerative Medicine Department, King Abdullah International Medical Research Centre, King Abdulaziz Medical City, Ministry of National Guard Health Affairs, 2College of Medicine, Experimental Surgery and Animal Laboratory, King Saud University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח ויוו סרטן מודל של שימוש בטכנולוגיית תאי גליון. מודל כזה יכול להיות מאוד שימושי עבור הערכת הרפוי נגד סרטן.

Abstract

אין ויוו במודל חיה המחקה סרטן אנושי יכול להיות יישומים שונים המספקים מידע קליני משמעותי. משמש כיום הטכניקות לפיתוח ויוו סרטן דגמים יש מגבלות ניכר. לפיכך, במחקר זה, אנו שואפים לממש בטכנולוגיית תאי גליון לפתח מודל סרטן ויוו . קרצינומה Hepatocellular (HCC) מפותחת בהצלחה בחולדות עירום באמצעות גליונות התא שנוצר מתאי השורה תא HCC. הסדינים התא סרטן שנוצרו באמצעות אדהזיה תאיים ויצירת מבנה מרובדת, נשלט על ידי מטריצות. דבר זה מאפשר השתלת גיליון HCC לתוך הכבד ויצירת מודל בעלי חיים נושאות תוך חודש. בנוסף, חקר את התפקיד של גזע mesenchymal (MSC) בפיתוח של מודל זה סרטן. בנוסף הגיליון קו תא HCC, נוצרים עוד תא שני גיליונות: גיליון HCC תאי מח עצם MSCs (BMMSCs) ואת גיליון של תאים HCC, חבל הטבור MSCs (UCMSCs). הגליונות אשר יש שילוב של תאים HCC והן MSCs הם גם מסוגלים לייצר חיה נושאות. עם זאת, התוספת של MSCs מקטין את גודל הגידול בנוי, זו השפעה שלילית על התפתחות גידולים משתנה בהתאם למקור של MSCs בשימוש. אפשרות זו מציינת כי גיליון תא העשוי מסוימת יחוברו MSC יכול להיות מנוצל שליטה וניהול של הגידול.

Introduction

HCC הוא סרטן ראשוני של הכבד, קשורה באופן משמעותי עם פרוגנוזה גרועה. מדי שנה, כמעט חצי מיליון חולים חדשים מאובחנים עם HCC, המייצג 85% של סרטן הכבד בחולים ברחבי העולם1. Hepatocarcinogenesis אינה מחלה אחת-טופס; ליתר דיוק, זה אוסף של מחלות בעלי תכונות שונות histopathological ולשינויים גנטיים ולא גנומית, בנוסף מגוון תוצאות prognostic1. לכן, האתגרים העיקריים בהתפתחות של אסטרטגיית טיפולית יעילה עבור HCC הן את הידע מוגבל לביולוגיה HCC וחוסר מודל ניסיוני מתאימים בעלי חיים שיכולים לעזור להבין זו מחלה מורכבת. אין ויוו במודל חיה המחקה סרטן אנושי הוא הכרחי עבור בחירת המועמד גנים וזיהוי סמנים prognostic/ניבוי ערבו אינדוקציה סרטן, כמו גם על חקירת גורמים שונים שעשויים להשפיע על סרטן תגובות לסוכנים טיפולית.

מחקרים במבחנה סרטן משויכות עדיין מגבלות הגדולות. זה בשל העובדה כי התאים הסרטניים לאבד תכונות רבות שלהם ויוו כאשר נשמר בתרבות. השינויים שמתרחשים תאי במבחנה תוצאה של העדר רקמות כל הפיזיולוגיה באווירה ex-vivo . סרטן-לתא אינטראקציה (סטרומה, המערכת החיסונית, להערכת, אפיתל, וכו ') בתוך microenvironment הגידול משקף במידה רבה על סרטן התא מאפיינים2. Microenvironment הגידול יכול לשנות ביטוי גנים/חלבון התא סרטן ומאפיינים פנוטיפי, בנוסף angiogenetic ואת פוטנציאל גרורתי. מערכת התרבות דו-ממדית (2-D) במבחנה חסרה גם מטריצה רקמות מתאים, אשר הכרחי לווסת את התקדמות הגידול. לפיכך, בשל מגבלות אלו, מודלים ויוו צריך תמיד להיות מנוצל כדי לתמוך ממצאים ראשוניים של מודלים במבחנה . במחקר זה, אנו משתמשים בטכנולוגיית תאי גליון לפתח ויוו במודל חיה זה elucidates את התהליך הביולוגי המלא שבבסיס HCC.

לפני יותר מעשור מעבדה של Okano הוקמה שיטה של הנדסת רקמות, המבוסס על טכנולוגיית תא גליון3. שיטה זו משתמשת פלסטיק תרבות מגיבים תרמו כדי לאפשר הפיכה תא אדהזיה/ניתוק על ידי שליטה על פני השטח hydrophobicity. שיטה זו מאפשרת קציר עדין של תאים בתרבית בתבנית ללא פגע תלת-ממדיים (3-D) (גיליון i.e.,cell), עם מטריצה חוץ-תאית מטופחים (ECM) ואינטראקציות מתא לתא. הטכניקה גיליון תא מחייב את precoating של תרבות מנות עם poly(N-isopropylacrylamide) טמפרטורה-מגיבה פולימר (אני פיפה), וזו מסחרית זמינים ומוכנים לשימוש. בטמפרטורה מתחת 20 ° C, פולימרים פיפה אני להפוך להתייבש, להמיס פתרונות מימית, ואילו, בטמפרטורה גבוהה (37 מעלות צלזיוס), פולימרים להתייבש, להפוך התמיסה עכורים. הפולימר מכיל אמיד הידרופילית שרשראות הידרופוביות לצד רשתות (איזופרופיל קבוצות). בטמפרטורות גבוהות, תנועה בראונית של מולקולות מים מתעצמת, הואיל בטמפרטורה נמוכה, מולקולות המים המקיפים את קבוצות איזופרופיל של פירוק מבנה רטוב וקבוצות איזופרופיל הידרופובי צבירה בגלל אינטראקציות הידרופוביות. לכן, כל שרשרת הפולימר אגרגטים, ארגונייט שוקע4.

במסגרת המחקר הציג, בטכניקה זו משתמשים לפתח מודל חיה HCC באמצעות שלושה גליונות תאים שונים. הגיליון הראשון מועסקים מורכב HCC תא שורת תאים בלבד, בעוד ששני הדפים האחרים מורכבים של שילוב של HCC תא שורת תאים MSCs משני מקורות שונים: MSCs במח העצם (BMMSCs) ו- MSCs הטבור (UCMSCs). MSCs הם הלא-hematopoietic סטרומה תאים המסוגלים המבדילים intocell נגזרות של השושלת mesenchymal, כולל adipocytes, osteocytes, chondrocytes ונייטרלים5. הסיבה שאנו מעסיקים תאים אלה בעת יצירת גליון התא סרטן היא תפוקתב לא עקבית על ההשפעה של MSCs על סרטן. הוצע כי MSCs יכולים להיות שני פנוטיפים שונים: "MSC1", הפנוטיפ proinflammatory, ו- "MSC2", פנוטיפ לדיכוי המערכת החיסונית6. MSCs מבטאים קולטנים כמו אגרה (TLRs). TLR4 לקרקע של MSCs מגביר את הפרשת גורמים proinflammatory, ואילו לקרקע TLR3 מגביר את הפרשת גורמים לדיכוי המערכת החיסונית6. המחקר במבחנה של פנוטיפים שני אלה דיווחו כי תרבות משותפת של MSC1 עם שורות תאים סרטן הקלוש צמיחת תאים של סרטן, בעוד תרבות משותפת MSC2 היה את האפקט ההפוך7. זה מרמז כי MSCs יכול להיות סרטן בעד או נגד סרטן, בהתאם פנוטיפ שלהם. לכן, בנוסף פיתוח המודל בעלי חיים HCC בטכנולוגיה גיליון תא, אנחנו רוצים לחקור את ההשפעה של השתלות MSC על התפתחות גידולים, ואם באמצעות תאים אלה להגביר או להפחית את התפתחות מודל זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים של הוועדה האתית של אוניברסיטת המלך סעוד. ניתוחים, הרדמה, תרופות אחרות בשימוש בבעלי חיים המאושרים על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת המלך סעוד. כל עבודה ניסויית מתבצע על ידי צוות מיומן כראוי.

1. תא גליון בנייה

  1. מעיל המנות תרבות (מנות תרבות טמפרטורה מגיב 3.5 ס מ) עם סרום שור עוברית (FBS) מדולל ולהבטיח כדי לכסות את כל השטח של המנה.
    הערה: שלב זה הוא חשוב עבור הניתוק של הגיליון תא מאז זה תומך את הצמיחה של התאים טפט ומונע צבירת התא.
  2. דגירה הכלים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2 ו- 95% אוויר.
  3. להסיר את עודף FBS כלים מצופים ולאפשר את הכלים לייבוש בטמפרטורת החדר (RT) במשך לפחות שעה.
  4. להכין את המתלים שלושה תאים: תאים6 HepG2 עונה 1 פרק 10 עונה 1 פרק 106 HepG2 תאים עם BMMSCs, עונה 1 פרק 106 HepG2 תאים עם UCMSCs (ביחס של 4:1 גם BMMSCs וגם UCMSCs).
  5. זרע ההשעיה תאים מתאים על כל מנה עם תוויות.
  6. להשעות כל התאים במדיום תרבות DMEM, בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  7. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2 ו- 95% אוויר.

2. תא גליון התנתקות

  1. ב- 100% תא הנהרות, לקחת את הכלים מתוך החממה 37 º C.
  2. דגירה המנה גיליון תא HepG2 עבור h 1-RT, בעוד המקננת על HepG2/BMMSC ומנות HepG2/UCMSC תא גיליון 30-40 דקות ב- 20 ° C באווירה humidified, המכילה 5% CO2 ו- 95% אוויר.
    הערה: הגיליון תא זני רק HepG2 שברירי; להקטין את הטמפרטורה עד 20 ° C גורם נזקים למבנה של הגיליון.

3. ביצוע הליך כירורגי

הערה: במהלך זמן הדגירה עבור הניתוק גיליון תא, תתחילי בטיפול בבעלי חיים.

  1. הוראות הכנה של אזור הניתוח
    1. לנהל את כל הניתוחים באזור נפרד סטרילי בתוך המעבדה, כגון ברדס, זרימה שכבתית ארון או חדר ניתוח אספטי. להבטיח כי כל המשטחים של אזור הניתוח שאינו נקבובי, אטום, עמידה sanitizable.
    2. ללבוש ציוד מגן מתאים, כולל חלוק, כפפות, מסכות של כיסויי הראש ואת הנעל.
    3. שימוש כירורגית כלי זה הם סטיריליים ונקייה (via autoclaving; גזע רווי בלחצים גבוהים) בתחילתו של הניתוח.
    4. לשנות כפפות בין חולדות.
  2. הכנה של החיה לניתוח
    1. השתמש חולדות עירום 8 ל 12-בת.
    2. צור בזריקות הרדמה על חולדות.
      1. כדי להכין את הפתרון הרדמה, חריגות קטמין-השירותים הווטרינריים, לערבב 2 מ"ל של קטמין, 1 מ"ל של חריגות השירותים הווטרינריים (על ריכוז של 20 מ"ג/מ"ל) ו- 1 מ ל תמיסת סטרילית הפיזיולוגיות (למשל, 0.9% נתרן כלורי) בבקבוקון אוסף סרום 10-mL סטרילי, לנער היטב לפני השתמש.
      2. כדי להחיל הרדמה, להזריק 0.2 מ"ל של הפתרון קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים לכל 100 גרם של משקל הגוף של העכברוש intraperitoneally.
        הערה: המינון הכולל של הפתרון הוא 100 מ ג/ק ג של קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים.
    3. הסר העפר גלוי/פסולת באתר כירורגית.
    4. בדוק את עומק הרדמה על ידי בוחן את רפלקס הנסיגה פדלים (צביטה כרית כף הרגל בשתי הרגליים האחוריות).
      הערה: אם בלחץ כרית כף הרגל גורם לתגובה, חזור במינון של 0.05 גרם/100 גרם (כ כל 30 דקות) ולאחר מכן בדוק את עומק הרדמה.
    5. לחטא באזור הניתוח עם שיפשופים בשני שלבים מאת povidone-יוד/אלכוהול איזופרופיל.
    6. מכסים את העכברוש עם תלוי סטרילי כדי למנוע זיהום של החתך.
    7. להחדיר את החולדות subcutaneously הבופרנורפין (0.01 - 0.05 מ"ג/ק"ג)8 לפני קבלת את החתך.
    8. באמצעות אזמל סטרילי, להפוך 7 - ל ס מ-10 לחתוך בין פריטי מעטפת השרירים שמתחת כדי לחשוף את הכבד.
      1. הפרד את שריר הבטן מן העור עם הקצה האחורי השטוח של האזמל.
      2. בזהירות לדקור לינאה אלבה באמצעות אזמל ולהרחיב גזירה במספריים חדים.

4. השתלת גיליון תא

הערה: השתלת גיליון תא מתבצע על הכבד.

  1. לאסוף את הגיליון תא המנה תרבות.
    1. טפח בעדינות את המנה תרבות מעל הספסל כדי לנתק את הסדין מפני-השטח.
    2. הפרד את הגיליון תא ממשטח של המנה על ידי גירוד קצה הסדין במעגל חצי באמצעות טיפ פיפטה סטרילי.
    3. הסר בעדינות את המדיום כולו מתוך קערה תרבות.
    4. להבטיח הגיליון שלם ללא נזק; אחרת, זה לא יכול להיות בשימוש (איור 1).
      הערה: ניתן להבחין הסדינים שנוצר ישירות באמצעות העין.
  2. להכין את קרום סטרילי (נייר סינון) כדי לקצור את הגיליון תא מתוך קערה.
    1. ראשית, משרים את הקרום עם תמיסת מלח. לאחר מכן, הסר את תמיסת המלח עודף עם כרית כותנה סטרילי.
    2. הצב קרום רטובה מעל הסדין התא, תוך הימנעות רוחביים בועות אוויר בין הקרום ואת הסדין תא.
    3. הוסף מספר טיפות של תמיסת מלח מעל הקרום ואת הסדין תא כדי לאסוף אותם יותר קל.
      הערה: כדי למנוע את שבירת הגיליון תא, לא להשתמש תמיסת מלח קר והרם את הקרום ואת הסדין תא עם מלקחיים.
    4. השאר הקרום לכמה שניות להבטיח כי הגיליון תא מחובר כראוי למוח ולאחר מכן לאסוף אותו.
  3. היכונו הכבד השתלת גיליון תא.
    1. ודא כי השטח הכבד הוא יבש על ידי בעדינות טפיחות עם כרית כותנה סטרילי.
    2. בעזרת מלקחיים סטרילי, הצב את הקרום עם הסדין תא מעל אונת הכבד של החולדה יחיד.
    3. הוסף מספר טיפות של תמיסת מלח סטרילית ולהחיל לחץ עדין על קרום כדי לנתק את הגיליון תא ממנו.
    4. המתן 5 דקות לפני הסרת בזהירות את הקרום.
      הערה: פעולה זו מתבצעת על מנת להבטיח שהגיליון תא מחובר כראוי אל הכבד.
    5. לבסוף סוגרים את השרירים המשמשים כבסיס, העור החתכים בתפרים ניילון 5-0.
    6. לחטא את האזור ניתוח עם povidone יוד.
      הערה: איור 2 מציג תרשים של ההליך השתלת תאי גליון על הכבד של עכברוש עירום.

5. לאחר הניתוח טיפול

  1. מיד לאחר הניתוח, בית העכברוש בנפרד כדי להימנע קניבליזם או חנק, ולנטר אותה באופן קבוע (לפחות כל 15 דקות) עד שזה המודעים והבלתי מודעים, מהיותו באופן מלא.
  2. לאחר מכן, להעריך את החולדות מדי יום עבור 5-14 d, לפחות 5 d וכאב לאחר הניתוח, כדי להבטיח שלא יהיו שום סיבוכים. במהלך המבדק יומי, ודא מהפעולות הבאות.
    1. הפצע סגור, התפרים שלמים, בלי להיות הדוקה יתר על המידה.
    2. ישנם סימנים של זיהום באזור הניתוח, כגון חום, עודף הפרשות נפיחות או מוגלתי.
    3. ישנם סימנים הקשורים לכאב, כגון ירידה בצריכת מזון ומים, ירידה במשקל, התייבשות, העור להקים אוהל או נשימה מהירה, פתח את הפה. כדי לשלוט מתון עד חמור כאב לאחר הניתוח, אם בכלל, להזריק החולדות subcutaneously הבופרנורפין (0.01 - 0.05 מ"ג/ק"ג) כל 6-8 h9 מינימום של 48-72 h במשככי.

6. ניתוח של האזור המושתלים

  1. חודש אחד לאחר ההשתלה, scarifice החולדה ולאסוף את האזור המושתלים היסטולוגית וניתוח immunohistochemical.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tumorigenicity של התאים המושתלים גיליונות בחולדות:

חודש אחד לאחר ההשתלה, כל גיליונות התאים המושתלים כבדי של חולדות פיתחו גידולים (איור 3). הגודל הממוצע של גידולים מפותחים של HepG2, HepG2/BMMSC HepG2/UCMSC תא הסדינים היו 4.5 ס מ 4 ס מ, 2.5 ס מ, בהתאמה10.

ניתוח היסטולוגית של רקמות הכבד:

Hematoxylin, אאוזין (H & E) צביעת של חולדות ללא מושתלים הראה כבדים עם hepatocytes מסודרים שהפלטות anastomose אחד עם השני, הגרעינים היו עגולים, עם nucleoli אחד או שניים. לעומת זאת, הסעיפים הגידול שנאספו הראו הקצוות של קיימא מודלק, נמק תת עורי hepatocytes, עם קווי מתאר גרעינית לא סדיר ונקה ניוון (איור 4).

Figure 1
איור 1: ייצור של גליון תא שימוש לצלחת תרבות טמפרטורה מגיב 3.5 ס מ. (א) לוח זה מציג גליון תא פגום אינו מתאים השתלת. (B) לוח זה מציג גיליון שלם תא, מוכן עבור השתלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תא גליון הליך השתלת בחולדות עירום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : גידול שפותחה על הכבד של עכברוש לאחר חודש אחד של השתלת גיליון תא. הגידול נוצר מגליון תא (A) HepG2 (גודל: 4.5 ס מ), גיליון (B) תא HepG2 ו- BMMSC (גודל: 4 ס מ), וגליון (C) תא HepG2 ו- UCMSC (גודל: 2.5 ס מ). העיגולים הכחולים מראים את אזור הגידול. איור זה השתנה בין העבודה שפורסמו בעבר10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : ניתוח היסטולוגית של הכבד של עכברוש. H & E כתמים הכבד של חולדה, ארבעה שבועות לאחר השתלת גיליון תא. (א) זה נורמלי מראה החלונית עכברוש בכבד תאים. (B) לוח זה מראה המורפולוגיה הכבד לאחר השתלת תאי סרטן. החץ השחור מציין סרטן הכבד החצים הירוקים מציינים hepatocytes נורמלי, החץ הכחול מציין תאים מודלק, החץ הכתום מציין תאים HCC נמק. פסי סולם עולה 20 X הגדלה. איור זה השתנה בין העבודה שפורסמו בעבר10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כמות נרחבת של המחקר מוקדש להתפתחות נאותה ויוו פרה במודל חיה הדומה סרטן אנושיים. כיום, הגישות העיקריים המשמשים ליצירת מודלים בעלי חיים סרטן כרוך השתלת הנדסה גנטית ותא11. מודלים מהונדס גנטית הם כלים טובים עבור זיהוי ואימות של גנים היעד, כמו גם להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס רעילות תחת השפעת סמים. לעומת זאת, מודל זה מזוהה עם כמה מגבלות; למשל, השינוי של גן מסוים לא תמיד התוצאה הצפויה פנוטיפ12. הגישה השתלת תאים נפוץ יותר כדי לגרום לסרטן בבעלי חיים, זה כרוך ההזרקה של סרטן תאים ההשעיה. ובכל זאת, גישה זו פשוטה ונוחה יש חסרונות משלה. כדי להפיק השעיה תא, צעד עיכול אנזימטי ישמש כדי לקצור את התאים הסרטניים. התוצאה היא האובדן של חלק החלבונים אדהזיה, אשר תפחית את היעילות engraftment של התאים המושתלים. לכן, אין שום ערובה כי התאים הסרטניים המושתלים יהוו רקמות סרטניות, שלא לדבר על הקושי של בקרה על גודלו של הגידול המושרה. בנוסף, גישה זו יש חיסרון רציני נוסף, אשר הוא המעבר מהיר של תאים סרטניים מושתל לתוך מחזור הדם או תא engraftment לתוך איברים שאינם במיקוד13.

הטכנולוגיה גיליון תא הרומן פותחה כדי להתגבר על החסרונות. סוזוקי. et al. 14 יצרו בהצלחה המעי הגס הכבד, הלבלב נושאות חיות באמצעות שיטת השתלת גיליון התא סרטן. כאשר לעומת גידולים שנוצר באמצעות שיטת השתלת תאי סרטן, גידולים אלה היו גדולים יותר ויציב יותר. ההשתלה של רקמת גידול קטן לחיה לזירוז גידול תלויה מאוד השימוש בשיטה השתלת שלא דורש שלב עיכול אנזימטי. אנזימים הפרוטאוליטי לגרום נזק מטריצה חוץ-תאית, אשר משפיע על האינטראקציה מתא לתא. תא גליון טכנולוגיה מתגבר על מגבלה זו של שימוש בשיטת האיסוף פולשני, המאפשר את האוסף של גיליון תא חד שכבתי ללא פגע, יחד עם שלה המשויך חוץ-תאית מטריקס ו פקטורי גדילה15. תא גליון הטכנולוגיה מאפשרת גם עבור16,engraftment17לטווח ארוך. זהו ערך רב ויוו מחקרים, שבו תאים חייב להיות מסוגל engraft לתוך הרקמות של המחשב המארח עבור כל תקופת החיים של הרקמה17. בנוסף, טכניקה זו אפשרה פיתוח שיטה של הנדסת רקמות, ללא שימוש מתכלה פיגומים3,15. ובכל זאת, גישה זו עדיין יש מספר מגבלות. בעת שימוש בטכניקה גיליון תא, החלק המרכזי של הרקמה המושתל ואולי עלולים להיות נמק אם השתל גדול מדי. לעומת זאת, הסיכוי להצלחה של השתלת עשוי להצטמצם אם השתל הוא קטן מדי. בנוסף, על מנת לשלוט הגידול עוקבות של הגידול, הגודל של הרקמה מושתל חייב להיות אחיד לאורך כל ניסויים. הגודל של רקמות שיפותחו הוא מוגבל ל- 2 מ מ3 בשל אינדוקציה של נמק עקב הסביבה מסכן חמצן18.

במחקר זה, מודל חיה HCC נוצר בהצלחה באמצעות את השתלת לגרדום ללא תא גיליונות. שלושה סוגי תאים יריעות היו מושתלים לתוך הכבדים של חולדות: גליון תא HCC תא שורת תאים, תא בגיליון של HCC תאים תאים קו BMSCs, גיליון תא HCC התא שורת תאים UCMSCs. ההשתלה של כל תא שלושה הגליונות היה מספיק כדי לגרום גידולים בחולדות הנמען. עם זאת, צוין כי הוספת MSCs גיליון שהקטנת את הגודל של גידולים במבנה תקין. זה מציין MSCs בשימוש, במיוחד UCMSCs, יש השפעה שלילית על התפתחות גידולים. לסיכום, סרטן תאי גליון השתלת מציע שיטה יעילה כדי ליצור מודל חיה עם גידולים מוצקים. יש מודל שכזה אין ויוו יגרום עם מידע קריטי קלינית עם יישומים ניכר. בנוסף, כפי לכאורה על ידי הפחתת גודל הגידול, UCMSCs להגביל את התפתחות גידולים והתפשטות. אפשרות זו מציינת כי כמה סוגי MSC יכול לשמש בגישה מבוססת תא לטיפול בסרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות הצוות של ניתוח ניסיוני, חיות מעבדה המכללה לרפואה, אוניברסיטת המלך סעוד, שיתוף פעולה, תמיכה-במיוחד Almukhayzim חוסיין, הישאם Aloudah. המחברים גם רוצה להכיר את הצוות המדיה באוניברסיטת המלך סעוד סל ישראל אריאל להכנת חזותית את החומר-במיוחד Muath סל ר'נאם, רעות קרן אלינוי קסוטו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents 
FBS  Gibco/Invitrogen 10270106
DMEM high glucose  Sigma D5671-500ML
Penicillin/streptomycin  Life Technology 15070063
Sterile physiologic saline Sigma  S0817-1GA
Human HepG2 cell line ATCC, USA HB-8065
Human bone marrow MSCs cell line PromoCell, USA C-12974
human umbilical cord tissue MSCs PromoCell, USA  C-12971
Ketamine 50% Rompun, Bayer
Xylazine 2% Rompun 23076-35-9
Alphadine® solution. Riyadh Pharma LBL0816
Disposables: 
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube Falcon  352097
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) Sigma 174904-1CS
100-1000 µl  Pipette Tips  Sigma CLS4868-1000EA  
Basic Procedure Drape Thermofisher PMD5293.0
Equipment 
Plus pipette, variable volume Eppendorf® Research® Z683779-1EA
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 Any brand
Biological safety cabinet Any brand
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 Any brand
Sterile surgical tools and nude rats: 
Forceps
Scissors
scalpel 
 Nylon Suture  5-0 Accutome AB-3854S Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes Fisher Scientific 14-826-88
Nude rats  Charles river

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
  2. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  3. Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
  4. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  5. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  6. Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
  7. Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
  8. Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
  9. Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017).
  10. Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
  11. Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
  12. Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
  13. Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
  14. Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
  15. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
  16. Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
  17. Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
  18. Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 139 קרצינומה Hepatocellular ויוו חולדות עירום מנות טמפרטורה מגיב גיליון תא בתאי גזע mesenchymal
חקר את הפוטנציאל של תא גזע Mesenchymal גיליון על הפיתוח של קרצינומה Hepatocellular <em>In Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alshareeda, A. T., Alsowayan, B.,… More

Alshareeda, A. T., Alsowayan, B., Almubarak, A., Alghuwainem, A., Alshawakir, Y., Alahmed, M. Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo. J. Vis. Exp. (139), e57805, doi:10.3791/57805 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter