Summary
Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare un modello in vivo del cancro utilizzando tecnologia dello strato delle cellule. Tale modello potrebbe essere molto utile per la valutazione delle terapie anticancro.
Abstract
Un in vivo modello animale che imita cancro umano potrebbe avere varie applicazioni che forniscono le informazioni cliniche significative. Le tecniche attualmente utilizzate per lo sviluppo di modelli di cancro in vivo hanno notevoli limitazioni. Pertanto, in questo studio, miriamo a implementare la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un modello di cancro in vivo . Carcinoma epatocellulare (HCC) è sviluppato con successo in nudi ratti utilizzando fogli di cella create da cellule di HCC cella linea. I fogli di cellule di cancro sono generati tramite adesione intracellulare e la formazione di una struttura stratificata, controllata dalla matrice extracellulare. Ciò consente il trapianto di foglio HCC in fegato e la creazione di un modello animale del tumore-cuscinetto entro un mese. Inoltre, il ruolo delle cellule staminali mesenchimali (MSC) nello sviluppo di questo modello di cancro è studiato. Oltre il foglio di linea delle cellule HCC, un'altra cella due fogli vengono creati: un foglio delle cellule HCC e midollo osseo MSCs (BMMSCs) e un foglio di cellule di HCC e cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). Fogli che hanno una combinazione di entrambe le cellule HCC e MSCs sono anche in grado di produrre un animale del tumore-cuscinetto. Tuttavia, l'aggiunta di MSCs riduce le dimensioni del formato di tumore, e questo effetto negativo sullo sviluppo del tumore varia a seconda origine dei MSCs usate. Questo indica che una lastra cella determinati sottotipi MSC poteva essere utilizzata nel controllo e gestione di tumore.
Introduction
HCC è un cancro primario del fegato che è significativamente associato con una prognosi difficile. Ogni anno, quasi mezzo milione nuovi pazienti sono diagnosticati con HCC, che rappresenta 85% dei pazienti di cancro del fegato nel mondo1. Hepatocarcinogenesis non è una malattia di form singolo; piuttosto, è una collezione di malattie che hanno differenti caratteristiche istopatologiche e variabilità genetica e genomica, oltre alla varia prognostici risultati1. Di conseguenza, le principali sfide nello sviluppo di un'efficace strategia terapeutica per HCC sono la limitata conoscenza della biologia HCC e la mancanza di un modello animale sperimentale adatto che può aiutare a capire questa complessa malattia. Un in vivo modello animale che imita cancro umano è necessario per la selezione di geni candidati e identificazione di marcatori prognostici/predittivi implicati nell'induzione del cancro, così come per lo studio di diversi fattori che possono influenzare le risposte del cancro agli agenti terapeutici.
Gli studi in vitro del cancro sono ancora associati con grossi limiti. Questo è dovuto al fatto che le cellule tumorali perdono molte delle loro caratteristiche in vivo quando mantenute in coltura. I cambiamenti che si verificano a cellule in vitro risultato dall'assenza della fisiologia del tessuto intero in un ambiente ex vivo . Interazione cellula--cellula di cancro (stromal, immunitario, sistema vascolare, epiteliali, ecc.) all'interno del microambiente tumorale riflette notevolmente il cancro delle cellule caratteristiche2. Il microambiente tumorale potrebbe alterare l'espressione proteina/del gene del cancro delle cellule e delle caratteristiche fenotipiche, oltre angiogenetici e potenzialità metastatica. Il sistema di cultura bidimensionale (2D) in vitro manca anche una matrice di tessuto adatto, che è necessaria regolare la progressione del tumore. Così, a causa di queste limitazioni, in vivo modelli dovrebbero sempre essere utilizzati per supportare i risultati preliminari di modelli in vitro . In questo studio, usiamo la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un in vivo modello animale che delucida il completo processo biologico sottostante HCC.
Più di un decennio fa, laboratorio di Okano stabilito un metodo novello di ingegneria tissutale basata sulla cella foglio tecnologia3. Questa tecnica utilizza una plastica termo-sensibile cultura per consentire l'adesione/distacco cellulare reversibile controllando l'idrofobicità di superficie. Questo metodo consente una delicata raccolta di cellule coltivate nel formato di un intatto tridimensionale (3D) (foglio i.e.,cell), con una curatissima matrice extracellulare (ECM) e le interazioni cellula--cellula. La tecnica di strato delle cellule richiede la spre-spalmatura di piastre di coltura con un polimero termosensibile PNIPPA (PIPA Am), che è commercialmente disponibile e pronto per l'uso. Ad una temperatura inferiore a 20 ° C, PIPA sono polimeri diventano idratati e si dissolvono in soluzioni acquose, considerando che, ad una temperatura superiore (37 ° C), i polimeri diventano disidratati e trasformano in un precipitato torbido. Il polimero contiene catene ammide idrofila e catene laterali idrofobe (gruppi isopropilico). Alle alte temperature, si intensifica il movimento browniano delle molecole d'acqua, considerando che, a bassa temperatura, le molecole dell'acqua che circonda i gruppi isopropilico della ripartizione struttura idratata e i gruppi di isopropile idrofobo aggregare a causa di interazioni idrofobiche. Di conseguenza, l'intera catena del polimero aggrega e precipitati4.
Nello studio presentato, questa tecnica è impiegata per sviluppare un modello animale di HCC con tre fogli differenti delle cellule. Il primo foglio impiegato è costituito da cellule di HCC cella linea solo, mentre gli altri due fogli sono costituiti da una combinazione di cellule della linea cellulare HCC e MSCs da due origini diverse: midollo osseo MSCs (BMMSCs) e del cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). MSCs sono non-emopoietici cellule stromale che sono capaci di differenziazione intocell derivati del lignaggio mesenchymal, inclusi adipociti, osteociti, condrociti e miociti5. La ragione che ci avvaliamo di queste cellule, durante la creazione di strato di cellule di cancro è la segnalazione incoerente sull'effetto di MSCs sui cancri. È stato suggerito che MSCs può avere due fenotipi distinti: "MSC1", un fenotipo proinfiammatorio e "MSC2", un fenotipo immunosoppressivo6. MSCs esprimono recettori toll-like (TLR). TLR4 adescamento di MSCs aumenta la secrezione di fattori proinfiammatori, mentre TLR3 innesco aumenta la loro secrezione di fattori immunosoppressivi6. Uno studio in vitro di questi due fenotipi ha riferito che una co-coltura di MSC1 con linee cellulari del cancro attenuata la crescita della cellula tumorale, mentre MSC2 co-coltura ha avuto l' effetto opposto7. Ciò implica che MSCs può essere Pro-cancro o anticancro, a seconda del loro fenotipo. Così, oltre a sviluppare il modello animale di HCC utilizzando tecnologia dello strato delle cellule, vogliamo esplorare l'effetto del trapianto di MSC sullo sviluppo del tumore, e se utilizzando queste cellule sarà aumentare o ridurre lo sviluppo di questo modello.
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Protocol
Il protocollo segue le indicazioni di cura degli animali del comitato etico di King Saud University. Le procedure chirurgiche, anestetici e altri farmaci usati sugli animali sono approvati dal comitato etico di King Saud University. Tutto il lavoro sperimentale è eseguito da personale opportunamente addestrato.
1. cella foglio costruzione
- Spalmate le piastre di coltura (piastre di coltura termosensibile 3.5 cm) non diluito siero bovino fetale (FBS) e garantire per coprire tutta la superficie del piatto.
Nota: Questo passaggio è importante per il distacco dello strato di cellule dal momento che supporta la crescita delle cellule in un monostrato e impedisce l'aggregazione delle cellule. - Incubare i piatti per 24 h a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO2 e il 95% di aria.
- Rimuovere i FB in eccesso dai piatti rivestiti e consentire i piatti ad asciugare a temperatura ambiente (TA) per almeno 1 h.
- Preparare le sospensioni tre cellulari: 1 x 106 HepG2 cellule, cellule di 1 x 106 HepG2 con BMMSCs e 1 x 106 HepG2 cellule con UCMSCs (in un rapporto di 4:1 per BMMSCs e UCMSCs).
- La sospensione di cella appropriata ad ogni piatto con etichetta del seme.
- Sospendere tutte le cellule in coltura DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina.
- Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO2 e il 95% di aria.
2. cella foglio distacco
- Alla confluenza delle cellule di 100%, prendere i piatti fuori l'incubatore a 37 ° C.
- Incubare il piatto di strato delle cellule HepG2 per 1h a RT, mentre incubando il HepG2/BMMSC e piatti di strato delle cellule HepG2/UCMSC per 30-40 min a 20 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO2 e il 95% di aria.
Nota: Strato di cellule fatta da solo HepG2 è fragile; riducendo la temperatura a 20 ° C provoca danni alla struttura del foglio.
3. le prestazioni della procedura chirurgica
Nota: Durante il periodo di incubazione per il distacco del foglio cellulare, avviare la procedura di animale.
-
Istruzioni per la preparazione della zona di chirurgia
- Effettuare tutte le procedure chirurgiche in un'area sterile separata all'interno del laboratorio, come un cappuccio, a flusso laminare o una sala di chirurgia asettica. Garantire che tutte le superfici dell'area chirurgia sono non-poroso, sigillato, resistente e sanitizzabile.
- Indossare equipaggiamento protettivo adeguato, compreso testa e copriscarpe, guanti, maschere e scrub.
- Uso chirurgico strumenti che sono pulita e sterilizzata (tramite autoclave; staminali saturo ad alta pressione) all'inizio dell'ambulatorio.
- Cambiare i guanti fra i ratti.
-
Preparazione dell'animale per chirurgia
- Utilizzare per 12-week-old 8 nudi ratti.
- Creare l'anestesia iniettabile per ratti.
- Per preparare la soluzione di anestesia, ketamina-xilazina, mescolare 1 mL di soluzione fisiologica sterile (ad es., cloruro di sodio 0,9%) in una fiala di raccolta sterile 10 mL siero, 1 mL di xilazina (ad una concentrazione di 20 mg/mL) e 2 mL di ketamina e agitare bene prima utilizzare.
- Per applicare l'anestesia, iniettare 0,2 mL di soluzione di ketamina-xilazina per 100 g di peso corporeo del ratto per via intraperitoneale.
Nota: La dose totale della soluzione è di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina.
- Rimuovere lo sporco/detriti visibili dal sito chirurgico.
- Controllare la profondità dell'anestesia testando il riflesso di ritiro pedale (piede pad pizzico su entrambi i piedi posteriori).
Nota: Se il pizzico di rilievo del piede provoca una risposta, ripetere ad una dose di 0,05 mL/100 g (circa ogni 30 min), quindi controllare nuovamente la profondità anestetica. - Disinfettare l'area operata con una macchia di due stadi di povidone-iodio/isopropanolo.
- Coprire il topo con un telino sterile per evitare la contaminazione dell'incisione.
- Iniettare per via sottocutanea i ratti con buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg)8 prima di effettuare l'incisione.
- Usando un bisturi sterile, fare un 7 - a 10 cm di taglio tra le bucce e i muscoli sottostanti per esporre il fegato.
- Separare il muscolo addominale dalla pelle con il bordo posteriore piatta del bisturi.
- Attentamente pugnalare il linea alba usando un bisturi ed estendere il taglio con forbici affilate.
4. foglio di trapianto
Nota: Trapianto di cellule foglio viene eseguito sul fegato.
- Raccogliere il foglio delle cellule dalla piastra di coltura.
- Picchiettare delicatamente la piastra di coltura sopra il banco per staccare il foglio dalla sua superficie.
- Separare strato di cellule dalla superficie del piatto da raschiare il bordo del foglio in un semicerchio utilizzando una pipetta sterile.
- Rimuovere delicatamente il mezzo intero dalla piastra di coltura.
- Assicurarsi che il foglio è intatto senza alcun danno; in caso contrario, non può essere utilizzato (Figura 1).
Nota: I fogli risultanti possono essere rilevati direttamente dall'occhio.
- Preparare una membrana sterile (carta da filtro) per la raccolta di strato di cellule dal piatto.
- In primo luogo, mettere a bagno la membrana con soluzione salina. Quindi, rimuovere la soluzione salina in eccesso con un batuffolo di cotone sterile.
- Posizionare la membrana umida sopra strato di cellule, evitando pieghe e bolle d'aria tra la membrana e strato di cellule.
- Aggiungere alcune gocce di soluzione fisiologica normale sopra la membrana e strato di cellule per raccoglierli più facile.
Nota: Per evitare di rompere la strato di cellule, non utilizzare la soluzione salina fredda e sollevare la membrana e strato di cellule con il forcipe. - Lasciare la membrana per pochi secondi per assicurarsi che strato di cellule sia correttamente collegato alla membrana e poi raccoglierlo.
- Preparare il fegato per trapianto di cellule foglio.
- Assicurarsi che la superficie del fegato sia asciutta toccando delicatamente con un batuffolo di cotone sterile.
- Utilizzando pinze sterili, collocare la membrana con strato di cellule sopra un singolo lobo del fegato del ratto.
- Aggiungere poche gocce di soluzione fisiologica sterile e applicare una leggera pressione sulla membrana per staccare il foglio di cella da esso.
- Attendere 5 minuti prima di rimuovere con cura la membrana.
Nota: Questo viene fatto per garantire che strato di cellule sia collegato correttamente al fegato. - Infine, chiudere i muscoli sottostanti e incisioni con suture in nylon 5-0 la pelle.
- Disinfettare la zona di chirurgia con povidone-iodio.
Nota: La figura 2 Mostra un diagramma della procedura di trapianto di cellule foglio sul fegato di ratto nudo.
5. cura post-operatoria di
- Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, il ratto singolarmente per evitare cannibalismo o soffocamento della casa e monitorarlo regolarmente (almeno ogni 15 min) fino a quando non è cosciente e completamente ambulanti.
- Quindi, valutare i ratti al giorno per 5-14 d, almeno 5 d postoperatorio, per garantire che non ci sono complicazioni. Durante la valutazione giornaliera, assicurarsi di quanto segue.
- La ferita è chiusa, e le suture sono intatte, senza essere eccessivamente stretto.
- Non ci sono nessun segno dell'infezione del sito di incisione, come il calore, eccessivo scarico purulento o gonfiore.
- Non ci sono segni associati con dolore, come il consumo di cibo e acqua in diminuzione, perdita di peso, disidratazione, pelle tenting o respirazione con la bocca aperta e rapida. Al controllo da moderata a grave dolore post-operatorio, se del caso, iniettare i ratti per via sottocutanea con buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg) ogni 6-8 h9 per un minimo di 48-72 h postoperatorio.
6. analisi dell'Area trapiantato
- Un mese dopo il trapianto, il sacrificio del ratto e raccogliere l'area trapiantata per istologico e l'analisi di immunohistochemical.
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Representative Results
Carcinogenicità di strati delle cellule trapiantate in ratti:
Un mese dopo il trapianto, tutti i fogli delle cellule trapiantate in fegati di ratti hanno sviluppato tumori (Figura 3). La dimensione media dei tumori sviluppati da HepG2, HepG2/BMMSC e strati delle cellule HepG2/UCMSC erano 4,5 cm, 4 cm e 2,5 cm, rispettivamente10.
Analisi istologica dei tessuti del fegato:
Ematossilina ed eosina (H & E) di ratti trapiantati non hanno mostrato fegati con epatociti disposti in piastre che anastomotizzare uno con l'altro, e i nuclei erano in tondo, con uno o due nucleoli prominenti. Al contrario, le sezioni del tumore raccolte ha mostrato i bordi degli epatociti sottocutanei infiammati e necrotici praticabili, con i profili nucleari irregolari e deselezionare degenerazione (Figura 4).
Figura 1: fabbricazione di un foglio di cella utilizzando una piastra di coltura termosensibile 3,5-cm. (A), questo pannello mostra un foglio delle cellule danneggiate non adatto per il trapianto. (B), questo pannello mostra un foglio delle cellule intatte, pronto per il trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Cell procedura di trapianto di foglio in nudi ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Tumore si è sviluppato sul fegato del ratto dopo un mese del trapianto di cellule foglio. Il tumore è stato generato da strato di cellule (A) un HepG2 (dimensioni: 4,5 cm), (B), delle cellule HepG2 e BMMSC fogli (dimensioni: 4 cm) e (C), delle cellule HepG2 e UCMSC foglio (dimensione: 2,5 cm). I cerchi blu indicano la zona del tumore. Questa figura è stata modificata da lavoro precedentemente pubblicato10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi istologica del fegato del ratto. H & E macchiatura del fegato del ratto, quattro settimane dopo il trapianto di cellule foglio. Cellule di fegato di ratto (A) la normale spettacoli di questo pannello. (B), questo pannello mostra la morfologia del fegato dopo trapianto di cellule di cancro. La freccia nera indica cancro epatico, le frecce verdi indicano gli epatociti normali, la freccia blu indica cellule infiammate e la freccia arancione indica cellule necrotiche di HCC. Le barre di scala indicano 20 ingrandimenti. Questa figura è stata modificata da lavoro precedentemente pubblicato10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Una vasta quantità di ricerca è dedicata allo sviluppo di un'adeguata in vivo animale modello preclinico analogo cancri umani. Attualmente, gli approcci principali utilizzati per creare modelli animali di cancro coinvolgono ingegneria genetica e delle cellule trapianto11. Modelli animali geneticamente modificati sono buoni strumenti per l'identificazione e la validazione dei geni bersaglio, come pure la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di tossicità indotta da farmaci. Tuttavia, questo modello è associato con alcune limitazioni; per esempio, la modifica di un dato gene non comporta sempre il fenotipo atteso12. L'approccio di trapianto delle cellule è più comunemente usato per indurre il cancro negli animali, e coinvolge l'iniezione della sospensione di cellule di cancro. Eppure, questo approccio semplice e conveniente ha i suoi propri svantaggi. Per generare una sospensione cellulare, un passo di digestione enzimatica utilizzerà per raccogliere le cellule tumorali. Questo comporta la perdita di alcune delle proteine di adesione, che ridurranno l'efficienza di attecchimento delle cellule trapiantate. Di conseguenza, non esiste alcuna garanzia che le cellule tumorali trapiantate formerà tessuti cancerogeni, per non parlare della difficoltà di controllo delle dimensioni del tumore indotto. Inoltre, questo approccio ha un altro grave inconveniente, che è la transizione rapida delle cellule tumorali trapiantate nella circolazione sanguigna o engraftment delle cellule in organi non mirati13.
La tecnologia del foglio novelli della cellula è stata sviluppata per ovviare a questi svantaggi. Suzuki et al. 14 sono stati creati due punti, fegato e pancreas del tumore-cuscinetto animali utilizzando il metodo di trapianto di cancro cellule foglio. Quando confrontato con i tumori generati tramite il metodo di trapianto delle cellule di cancro, questi tumori erano più grandi e più stabili. L'impianto di un tessuto di piccolo tumore in un animale per indurre un tumore è altamente dipendente dall'uso di un metodo di trapianto che non richiedono un passaggio di digestione enzimatica. Enzimi proteolitici danneggiano matrici extracellulari, che colpisce l'interazione cellula--cellula. Tecnologia dello strato cellulare supera questa limitazione dell'utilizzo di un metodo di raccolta invasivo, che consente la raccolta di un strato di cellule monostrato intatto, insieme al suo associato di matrice e fattori di crescita extracellulari15. Tecnologia dello strato delle cellule permette anche a lungo termine attecchimento16,17. Questo è di grande valore negli studi in vivo , dove le cellule devono essere in grado di attecchire nel tessuto dell'ospite per l'intero periodo di vita17 del tessuto. Inoltre, questa tecnica ha permesso lo sviluppo di un metodo novello di ingegneria dei tessuti, senza l'uso di scaffolds biodegradabili3,15. Eppure, questo approccio ha ancora alcune limitazioni. Quando si utilizza la tecnica del foglio di cella, è possibile che la porzione centrale del tessuto innestato possibilmente diventare necrotica se l'innesto è troppo grande. Al contrario, la possibilità di successo del trapianto può essere ridotto se l'innesto è troppo piccolo. Inoltre, al fine di controllare la successiva crescita del tumore, la dimensione del tessuto trapiantato deve essere uniforme in tutti gli esperimenti. La dimensione del tessuto trapiantabile è limitata a 2 mm,3 , a seguito dell'induzione di necrosi dovuto l' ambiente povero di ossigeno18.
In questo studio, un modello animale di HCC è stato creato utilizzando il trapianto senza impalcatura di strati delle cellule. Tre tipi di strati delle cellule sono stati trapiantati in fegati dei ratti: un strato di cellule di HCC cellulari cellule della linea, un strato di cellule di HCC cellulare cellule della linea e BMSCs e un strato di cellule di HCC in cellule della linea e UCMSCs delle cellule. Il trapianto di tutti i fogli di tre cellule era sufficiente per indurre tumori in ratti destinatari. Tuttavia, è stato notato che aggiungendo MSCs al foglio ridotto la dimensione dei tumori formati. Questo indica che i MSCs utilizzato, soprattutto UCMSCs, hanno un effetto negativo sullo sviluppo del tumore. Per concludere, cancro cella foglio trapianto offre un metodo efficace per creare un modello animale con i tumori solidi. Avendo tali modelli in vivo potrebbe comportare informazioni cliniche critiche con notevoli applicazioni. Inoltre, come evidente dalla riduzione delle dimensioni del tumore, UCMSCs limitare la propagazione e lo sviluppo del tumore. Questo indica che alcuni sottotipi MSC potrebbero essere utilizzati in un approccio basato su cellulare per il trattamento del cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il personale della chirurgia sperimentale e laboratorio animale presso il College of Medicine, re Saud University, per la loro cooperazione e assistenza-soprattutto Hussain Almukhayzim e Hisham Aloudah. Gli autori inoltre desidera ringraziare il team di media King Saud bin Abdul-Aziz University per la preparazione di visual materiale-soprattutto Muath bin Ghannam e Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river |
References
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