生体内で肝細胞癌の開発の間葉系幹細胞シートの可能性を探る
Summary
ここでは、細胞シート技術を用いた生体内で癌モデルを開発するためのプロトコルを提案する.このようなモデルは、抗癌剤治療の評価のため非常に役に立つかもしれない。
Abstract
ひと癌を模倣した生体内で動物モデルは、重要な臨床情報を提供するさまざまなアプリケーション可能性があります。生体内で癌モデルの開発に現在使用されている技法には、かなり制限があります。したがって、本研究では生体内で癌モデルを開発する細胞シート技術の実装を目指します。肝細胞癌 (HCC) は肝細胞から作成した細胞シートを用いた裸のラットの開発に成功。細胞接着、細胞外マトリックスによって制御される、層状構造の形成を介して癌細胞シートが生成されます。HCC シート移植肝臓に月内担癌動物モデルの作成が可能になります。さらに、この癌モデルの開発の間葉系幹細胞 (MSC) の役割を検討しました。肝細胞癌細胞ライン シートに加えて別の 2 つの細胞シートを作成: 肝細胞癌細胞、骨髄 MSCs (BMMSCs)、肝細胞と臍帯 MSCs (UCMSCs) のシートのシート。肝細胞癌細胞と MSCs の両方の組み合わせを持つシートは、担癌動物を作り出すことができます。MSCs を追加形成された腫瘍のサイズが減少し、この腫瘍の開発に悪影響を与える使用の MSCs のソースによって異なります。これは腫瘍の管理とコントロールの特定の MSC のサブタイプの細胞シートを利用できることを示します。
Introduction
肝細胞癌は予後に有意関連付けられている肝臓の癌です。毎年、ほぼ 50万人新規患者は、肝細胞癌、肝細胞癌患者世界1の 85% を表すと診断されます。発癌ではない単一フォーム病気;むしろ、それはコレクションに加え別の病理組織学的特徴と遺伝子およびゲノム変動している病気の予後の結果1を様々 なです。したがって、肝細胞癌に対する有効な治療戦略の開発の主な課題は、肝細胞癌の生物学の限られた知識とこの複雑な病気の理解を助けることができる適切な実験動物モデルの欠如です。ひと癌を模倣した生体内で動物モデルは候補者の遺伝子を選択し、関与する癌の応答に影響を及ぼすさまざまな要因を調査するためだけでなく、癌を誘発、予後/予測マーカーを識別するために必要です治療上のエージェント。
In vitro癌研究はまだ主要な制限に関連付けられます。これは、がん細胞は文化で維持されるとき体内の機能の多くを失うためにです。前のヴィヴォ設定全体組織生理学の不在から細胞培養結果に発生する変更。がん細胞間相互作用(上皮間質、免疫、血管系等)内腫瘍微小環境はがん細胞の特性2に大きく反映されます。がん微小環境はがん細胞遺伝子・ タンパク質発現と血管新生に対する抑制と転移ポテンシャルに加えての表現型特性を変えることができます。文化システムの in vitro二次元 (2 D) は、腫瘍の進行を調節するために必要な適切な組織のマトリックスを欠いています。したがって、これらの制限のためは、 in vitroモデルの予備調査結果をサポートする体内モデルを利用する必要がありますは常にあります。この研究では、細胞シート技術を使用して、HCC の基になる完全な生物学的プロセスを解明する生体内で動物モデルを開発します。
10 年以上前、岡野の研究所は、細胞シート技術3に基づく組織工学の手法を設立しました。この手法は、表層の疎水性を制御することにより可逆的な細胞接着/脱着できるように熱応答性培養プラスチックを採用しています。このメソッドでは、手入れの行き届いた細胞外マトリックス (ECM) と細胞間相互作用に、そのまま立体 (3 D) 形式 (i.e.,cell 枚)、培養細胞の穏やかな収穫ができます。細胞シート技術は、商業的に使用可能である (ピパよ)、温度応答性高分子 poly(N-isopropylacrylamide) の培養皿のプレコートを必要があります。20 ° C の下の温度、ピパよポリマー水和し、高い温度 (37 ° C) でポリマーが脱水状態になるし、濁水沈殿物に変換に対し、水溶液に溶解します。ポリマーは親水性のアミド チェーンと疎水性側鎖 (イソプロピル グループ) に含まれます。一方、水和構造の内訳のイソプロピル グループと疎水性イソプロピルのグループを囲む水の分子を集約低温で高温で水の分子のブラウン運動が激化は疎水性相互作用のためしたがって、ポリマーの全体の鎖は集計し、4を析出します。
本研究では 3 つの異なる細胞シートを用いた肝細胞癌の動物モデルの開発にこの手法を採用します。採用されている最初のシートから成って肝細胞のみ、他の 2 つのシートから成っている肝細胞と 2 種類のソースからの MSCs の組み合わせに対し: 骨髄 MSCs (BMMSCs) と臍帯 MSCs (UCMSCs)。MSCs は、非造血細胞脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋5を含む、間葉系の系統の intocell 誘導体を区別することができます。これらの細胞を用いてがん細胞シートを作成するときの理由は、癌に及ぼす MSCs 矛盾したレポートです。MSCs が 2 つの異なる表現型を持つことが示唆されている:”MSC1″、炎症性表現型と「MSC2」、免疫表現型6。MSCs は、toll 様受容体 (Tlr) を表現します。MSCs の TLR4 プライミングは、TLR3 プライミング6免疫抑制因子の分泌を増加させるに対し、炎症性因子の分泌を増加します。これらの 2 つの表現型の体外研究報告 MSC2 共同文化があった反対の効果7MSC1 の癌細胞との共培養減衰、がん細胞の成長であること。これは、MSCs はプロがんや抗がん剤、その表現型によってできることを関係づけます。したがって、細胞シート技術を用いた肝細胞癌の動物モデルの開発に加えたい MSC 移植の腫瘍の開発に及ぼす影響を探索するかどうかこれらの細胞を使用して高めるか、または減らすこのモデルの開発と。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究の豊富な量は、モデルの開発生体内で十分な前臨床動物人間癌のように取り組んでいます。現在、癌の動物モデルを作成するために使用の主要なアプローチは、遺伝子工学や細胞移植11を含みます。遺伝子組み換え動物モデルは、同定と薬剤誘発性毒性発現の分子機構を理解することと同様、ターゲット遺伝子の検証のための良いツールです。しかし、このモデ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼らの協力とサポート特にフセイン Almukhayzim と Hisham Aloudah 実験的手術と動物キング サウド大学医学研究所のスタッフに感謝したいと思います。著者はまた視覚を準備するためキング サウド bin Abdul-Aziz 大学でメディア チームを認めるたいと思います特に素材 Muath ビンガーンナムと Abdulwahab Alsulami。
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- . Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats – ULAM Guidelines and SOPs – Michigan Medicine Confluence Available from: https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017)
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?. Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
