Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at udvikle en i vivo kræft model ved hjælp af celle ark teknologi. Sådan en model kunne være meget nyttigt for evaluering af anticancer therapeutics.
Abstract
En i vivo dyr model som efterligner humane kræft kunne have forskellige programmer, der leverer væsentlige kliniske oplysninger. De aktuelt anvendte teknikker til udvikling af i vivo kræftmodeller har betydelige begrænsninger. Derfor, i denne undersøgelse, vi sigter mod at gennemføre celle ark teknologi til at udvikle en i vivo kræft model. Hepatocellulært carcinom (HCC) er med succes udviklet i nøgen rotter ved hjælp af celle plader lavet fra HCC celle linje celler. Kræft celle ark genereres gennem intracellulære vedhæftning og dannelsen af et lagdelt struktur, kontrolleret af den ekstracellulære matrix. Dette giver mulighed for HCC ark transplantation i leveren og oprettelsen af en tumor-bærende dyremodel inden for en måned. Derudover er rolle af mesenchymale stamceller (MSC) i udviklingen af denne kræft model undersøgt. Ud over HCC celle linje ark, oprettes der en anden to celle ark: et ark af HCC celler og knoglemarv MSCs (BMMSCs) og et ark af HCC celler og navlestrengen MSCs (UCMSCs). Plader, der har en kombination af både HCC celler og MSCs er også i stand til at producere en tumor-bærende dyr. Men tilsætning af MSCs reducerer størrelsen af den dannede tumor, og denne negative virkning på tumor udvikling varierer afhængigt af den anvendte MSCs kilde. Dette angiver, at en celle ark af visse MSC undertyper kunne udnyttes i tumor forvaltnings- og kontrolsystemer.
Introduction
HCC er en primær kræft i leveren, der er signifikant forbundet med en dårlig prognose. Årligt, næsten en halv million nye patienter diagnosticeret med HCC, svarende til 85% af leverkræft patienter på verdensplan1. Hepatocarcinogenesis er ikke en enkelt-form sygdom; Det er derimod en samling af sygdomme, der har forskellige histopatologiske funktioner og genetiske og genomiske variabilitet, ud over forskellige prognostiske resultater1. De vigtigste udfordringer for udviklingen af en effektiv terapeutisk strategi for HCC er derfor begrænset viden om HCC biologi og manglen på en passende eksperimentelle dyremodel, der kan hjælpe med at forstå denne komplekse sygdom. En i vivo dyr model som efterligner humane kræft er nødvendige for at vælge kandidat gener og identificere prognostiske/intelligent markører impliceret i kræft induktion, samt for at undersøge forskellige faktorer, der kan påvirke kræft svar terapeutiske agenter.
In vitro kræft undersøgelser er stadig forbundet med store begrænsninger. Dette er at kræftceller miste mange af deres i vivo funktioner når vedligeholdes i kultur. De forandringer, der sker til celler in vitro- resultat af mangel på hele væv fysiologi i en ex vivo -indstilling. Kræft celle til celle interaktion (stromale, immune, vaskulatur, epitel, osv.) inden for tumor mikromiljø afspejler meget på kræft celle karakteristika2. Tumor mikromiljø kunne ændre kræft celle gen/protein udtryk og fænotypiske egenskaber, angiogenetic og metastatisk potentialer. Det todimensionale (2D) i vitro kultur system mangler også en egnet væv matrix, som er nødvendige for at regulere tumor progression. Således, på grund af disse begrænsninger, i vivo modeller bør altid udnyttes til at støtte de foreløbige resultater af in vitro- modeller. I denne undersøgelse bruger vi celle ark teknologi til at udvikle en i vivo dyremodel der belyser den fuldstændige biologiske proces underliggende HCC.
Mere end et årti siden, etableret Okanos laboratorium en ny metode til vævsmanipulering baseret på celle ark teknologi3. Denne teknik anvender en thermo-responderende kultur plastik for at tillade reversible celle vedhæftning/detachement ved at kontrollere den overflade hydrophobicity. Denne metode giver en blid høst af dyrkede celler i en intakt tredimensionale (3D) format (i.e.,cell ark), med en velbevaret ekstracellulære matrix (ECM) og celle-til-celle interaktioner. Celle ark teknik kræver precoating af kultur retter med en temperatur-responderende polymer poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA er), som er kommercielt tilgængelige og klar til brug. Ved en temperatur på under 20 ° C, PIPA er polymerer blive hydreret og opløses i vandige opløsninger, der henviser til, at ved en højere temperatur (37 ° C), polymerer blive dehydreret og omdanne til en grumset bundfald. Polymeren indeholder hydrofile akrylamid kæder og hydrofobe sidekæder (isopropyl grupper). Ved høje temperaturer, er den Brownske bevægelse af vandmolekyler intensiveret, mens ved en lav temperatur, molekyler vand omkring de isopropyl hydreret struktur opdeling og grupper af hydrofobe isopropyl aggregere på grund af hydrofobe interaktioner. Derfor hele kæden af polymeren aggregater og udfælder4.
I undersøgelsen der præsenteres, er denne teknik ansat til at udvikle en HCC dyremodel ved hjælp af tre forskellige celle ark. Det første ark ansat består af HCC celle linje celler kun, mens de andre to ark består af en kombination af HCC celle linje celler og MSCs fra to forskellige kilder: knoglemarven MSCs (BMMSCs) og navlestrengen MSCs (UCMSCs). MSC'er er ikke-hæmatopoietisk stromale celler, der er i stand til at differentiere intocell derivater af mesenchymale slægt, herunder adipocytter, osteocytes, chondrocytter og myocytes5. Grunden til at vi anvender disse celler, når du opretter kræft celle ark er inkonsekvent rapportering på MSCs indvirkning på kræftsygdomme. Det er blevet foreslået, at MSC'er kan have to forskellige fænotyper: "MSC1", en proinflammatoriske fænotype, og "MSC2", en immunosuppressive fænotype6. MSC'er express toll-lignende receptorer (TLRs). TLR4 priming af MSCs øger deres sekretion af proinflammatoriske faktorer, hvorimod TLR3 priming øger deres sekretion af immunosuppressive faktorer6. En in vitro- undersøgelse af disse to fænotyper rapporterede, at en fælles kultur af MSC1 med kræft cellelinjer svækket kræft cellevækst, mens MSC2 Co kultur havde den modsatte effekt7. Det er belastende at MSC'er kan være enten Pro kræft eller kræft, afhængigt af deres fænotype. Dermed, ud over at udvikle HCC dyremodel celle ark teknologi, vi ønsker at undersøge effekten af MSC transplantationer på tumor udvikling, og om ved hjælp af disse celler vil forøge eller reducere udviklingen af denne model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne dyrs pleje af King Saud Universitys etiske udvalg. Kirurgiske procedurer, anæstetika og andre medikamenter, der anvendes på dyr, der er godkendt af King Saud Universitys etiske udvalg. Alle eksperimentelle arbejde udføres af passende uddannet personale.
1. celle ark byggeri
- Coat kultur retter (3,5 cm temperatur-responderende kultur retter) med ufortyndet føtal bovint serum (FBS) og sørge for at dække alle overfladen af fadet.
Bemærk: Dette trin er vigtigt for udstationering af arket celle, da det understøtter vækst af celler i en éncellelag og forhindrer celle sammenlægning. - Inkuber retter i 24 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 og 95% luft.
- Fjerne den overskydende FBS fra til belagte retter og lade opvasken tørres ved stuetemperatur (RT) i mindst 1 time.
- Forberede tre celle suspensioner: 1 x 106 HepG2 celler, 1 x 106 HepG2 celler med BMMSCs og 1 x 106 HepG2 celler med UCMSCs (i forholdet 4:1 til både BMMSCs og UCMSCs).
- Frø den passende cellesuspension til hver mærket parabol.
- Suspendere alle celler i DMEM næringssubstratet suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin.
- Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 og 95% luft celler.
2. celle ark udstationering
- På 100% celle confluence, tage retter ud af 37 ° C inkubator.
- Inkuber HepG2 celle ark parabol for 1 h i RT, mens inkubere HepG2/BMMSC og HepG2/UCMSC celle ark retter for 30-40 min. ved 20 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 og 95% luft.
Bemærk: Den celle ark fra kun HepG2 er skrøbelig; reducere temperaturen til 20 ° C forårsager skader på strukturen arkets.
3. ydelse af den kirurgiske Procedure
Bemærk: Under inkubationstiden for celle ark detachement, starte en dyr procedure.
-
Vejledning til forberedelse af området kirurgi
- Gennemføre alle kirurgiske procedurer i en steril særskilt område indenfor laboratoriet, som en hætte, laminar flow kabinet eller en aseptisk kirurgi værelser. Sikre, at alle overflader af området kirurgi er ikke-porøs, forseglet, holdbare og sanitizable.
- Bære passende beskyttelsesudstyr, herunder scrubs, handsker, dykkermasker og hoved og skoovertræk.
- Brug kirurgiske værktøjer, som er ren og steriliseret (via autoklavering; mættet stilken under højt tryk) i begyndelsen af kirurgi.
- Skift handsker mellem rotter.
-
Forberedelse af dyret for kirurgi
- Bruge 8 til 12 uger gamle nøgen rotter.
- Oprette injicerbare anæstesi for rotter.
- For at forberede bedøvelse løsning, ketamin-xylazin, Bland 2 mL af ketamin, 1 mL af xylazin (i en koncentration på 20 mg/mL) og 1 mL sterilt fysiologisk saltvand (fx, 0,9% natriumchlorid) i en steril 10 mL serum samling hætteglas og ryst godt før brug.
- Hvis du vil anvende anæstesi, injicere 0,2 mL af ketamin-xylazin pr. 100 g kropsvægt af rotte intraperitoneal.
Bemærk: Den samlede dosis af løsningen er 100 mg/kg af ketamin og 10 mg/kg af xylazin.
- Fjerne synlige snavs/snavs fra operationsstedet.
- Check dybden af anæstesi ved at teste pedal tilbagetrækning refleks (mund pad knivspids på begge bagben feet).
Bemærk: Hvis mund pad knivspids forårsager en reaktion, Gentag en dosis af 0,05 mL/100 g (ca. hver 30 min.), derefter recheck den bedøvende dybde. - Desinficere området kirurgi med en to-trins krat povidon-jod/isopropanol.
- Dække rotte med en steril drapere at undgå kontaminering af snittet.
- Injicere rotter subkutant med buprenorphin (0,01 - 0,05 mg/kg)8 før indsnittet.
- Med en steril skalpel, gøre en 7 - til 10-cm skær mellem skind og underliggende muskler til at udsætte leveren.
- Adskille den mavemuskel fra huden med flad bagkant af en skalpel.
- Forsigtigt stikke den linea alba ved hjælp af en skalpel og udvide snit med en skarp saks.
4. celle ark Transplantation
Bemærk: Celle ark transplantation udføres på leveren.
- Indsamle celle ark fra kultur parabol.
- Forsigtigt trykke kultur skålen over bænk at løsne ark fra dens overflade.
- Separat celle ark fra fadets overflade ved at skrabe kanten af arket i en halv cirkel med en steril pipette tip.
- Forsigtigt fjerne den hel medium fra kultur parabol.
- Sikre arket er intakt uden skader; ellers, det kan ikke være brugt (figur 1).
Bemærk: De resulterende ark kan påvises direkte ved øjet.
- Forberede en steril membran (filtrerpapir) til at høste celle ark fra fadet.
- Først, blød membran med normal saltvand. Fjern derefter den overskydende saltopløsning med en steril vatrondel.
- Placer den våde membran over arket celle samtidig undgå folder og luftbobler mellem membranen og arket celle.
- Tilføje nogle dråber af normale saltvand over membranen og celle-ark til at indsamle dem lettere.
Bemærk: For at undgå at bryde celle ark, Brug ikke kolde saltvand og løfte membranen og arket celle med pincet. - Forlade membran i et par sekunder for at sikre, at celle ark er korrekt knyttet til membranen, og derefter indsamle det.
- Forberede celle ark transplantation leveren.
- Sørg for leveren overfladen er tør ved forsigtigt at trykke det med en steril vatrondel.
- Brug steril pincet, placere membran med celle ark over en enkelt lap af rottens leveren.
- Tilsæt et par dråber sterilt saltvand og anvende en blid pres på membranen at frigøre celle ark fra det.
- Vente på 5 min før du omhyggeligt fjerner membranen.
Bemærk: Dette er gjort for at sikre arket celle er korrekt knyttet til leveren. - Endelig lukke de underliggende muskler og hud indsnit med 5-0 nylon sutur.
- Desinficere området kirurgi med povidon-jod.
Bemærk: Figur 2 viser et diagram over celle ark transplantation procedure på leveren af en nøgen rotte.
5. efter operationen pleje
- Umiddelbart efter operationen, hus rotte individuelt for at undgå kannibalisme eller kvælning og overvåge det regelmæssigt (mindst hvert 15 min) indtil det er bevidst og fuldstændig selvforsynende.
- Derefter vurdere rotter dagligt i 5-14 d, mindst 5 d post-operatively, for at sikre, at der ingen komplikationer. Under den daglige vurdering, sørge for følgende.
- Såret lukkes, og suturer er intakt, uden at være alt for stram.
- Der er ingen tegn på infektion i snit site, såsom varme, overdreven hævelse eller purulent udflåd.
- Der er ingen tegn forbundet med smerte, nedsat forbrug af mad og vand, vægttab, dehydrering, hud tenting eller hurtig og åben mund vejrtrækning. At kontrollere moderat til svær post-kirurgi smerter, hvis nogen, injicere rotter subkutant med buprenorphin (0,01 - 0,05 mg/kg) hver 6-8 h9 for et minimum af 48-72 h efter operationen.
6. analyse af det transplanterede område
- En måned efter transplantation, scarifice rat og indsamle de transplanterede område for histologiske og immunhistokemisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorigenisitetsforsøg af transplanterede celle ark i rotter:
En måned efter transplantation, har alle transplanterede celle ark i rats' lever udviklet tumorer (figur 3). Den gennemsnitlige størrelse af de udviklede tumorer fra HepG2, HepG2/BMMSC og HepG2/UCMSC celle ark var 4,5 cm, 4 cm og 2,5 cm, henholdsvis10.
Histologiske analyse af leveren væv:
Hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning af ikke-transplanteret rotter viste lever med hepatocytter arrangeret i plader, der anastomose med hinanden, og atomkerner var runde, med en eller to fremtrædende nucleoli. Derimod afsnittene tumor indsamlet viste kanter af levedygtige betændte og nekrotisk subkutane hepatocytter, med uregelmæssige nukleare konturer og klare degeneration (figur 4).
Figur 1: fabrikation af en celle ark ved hjælp af en 3.5-cm temperatur-responderende kultur parabol. (A) dette panel viser en beskadiget celle ark ikke egnet til transplantation. (B) dette panel viser en intakt celle ark, klar til transplantation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Celle ark transplantation procedure i nøgen rotter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Tumor udviklet på en rotte lever efter en måned af celle ark transplantation. Tumor blev genereret fra (A) en HepG2 celle ark (størrelse: 4,5 cm), (B) en HepG2 og BMMSC celle ark (størrelse: 4 cm), og (C) en HepG2 og UCMSC celle ark (størrelse: 2,5 cm). De blå cirkler viser tumor område. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publicerede artikler10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Histologisk analyse af en rotte leveren. H & E farvning af en rotte lever, fire uger efter celle ark transplantation. (A) dette panel viser normal rotte leveren celler. (B) dette panel viser leveren morfologi efter kræft celler transplantation. Den sorte pil angiver leverkræft, de grønne pile angiver normal hepatocytter, den blå pil angiver betændte celler og den orange pil angiver nekrotisk HCC celler. De skala angiver 20 X forstørrelse. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publicerede artikler10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En omfattende mængde af forskning er dedikeret til at udvikle en passende i vivo prækliniske dyremodeller der ligner menneskelige kræftformer. I øjeblikket inddrage de vigtigste tilgange bruges til at oprette kræft dyremodeller genteknologi og celle transplantation11. Genetisk modificerede animalske modeller er gode redskaber til identifikation og validering af target gener, samt forstå de molekylære mekanismer bag narkotika-induceret toksicitet. Dog, denne model er forbundet med visse begrænsninger; for eksempel, resulterer ændring af et bestemt gen ikke altid i de forventede fænotype12. Celle transplantation tilgang er mere almindeligt anvendt til at inducere kræft hos dyr, og det indebærer injektion af kræft cellesuspension. Alligevel, denne enkel og praktisk tilgang har sine egne ulemper. Du kan generere en cellesuspension ved vil en enzymatisk fordøjelsen skridt blive brugt til at høste kræftcellerne. Dette resulterer i tab af nogle af de proteiner, vedhæftning, hvilket vil reducere engraftment effektiviteten af de transplanterede celler. Derfor er der ingen garanti for, at de transplanterede celler vil danne kræft væv, ikke at nævne er vanskeligheden at kontrollere størrelsen af den inducerede tumor. Denne tilgang har desuden en anden alvorlig ulempe, som er den hurtige overgang af transplanterede kræftceller blod omsætning eller celle engraftment ind i ikke-øremærket organer13.
Roman celle ark teknologien blev udviklet for at overvinde disse ulemper. Suzuki et al. 14 har oprettet tyktarmen, leveren og bugspytkirtlen tumor-bærende dyr med kræft celle ark transplantation metode. Når man sammenligner med tumorer genereret via kræft celle transplantation metode, blev disse tumorer større og mere stabile. Implantation af en lille tumor væv ind i et dyr til at fremkalde en tumor er stærkt afhængige af brugen af en transplantation metode, der ikke kræver en enzymatisk fordøjelsen trin. Proteolytiske enzymer forårsage skade ekstracellulære matricer, der påvirker celle til celle interaktion. Celle ark teknologi overvinder denne begrænsning ved at bruge en invasiv høst metode, giver mulighed for indsamling af et intakt éncellelag celle ark, sammen med dens tilknyttede ekstracellulære matrix og vækstfaktorer15. Celle ark teknologi giver også mulighed for langsigtet engraftment16,17. Dette er af stor værdi i i vivo undersøgelser, hvor celler skal være i stand til at indpode i værtens væv i hele perioden af det væv liv17. Desuden, aktiveret denne teknik udviklingen af en ny metode til vævsmanipulering, uden brug af biologisk nedbrydelige stilladser3,15. Denne tilgang har dog stadig et par begrænsninger. Når du bruger den celle ark teknik, kan den centrale del i det podede væv eventuelt blive nekrotisk hvis podekvisten er for stor. Omvendt, nedsættes succes chance for transplantation, såfremt podekvisten er for lille. Derudover for at styre den efterfølgende vækst af tumor, skal størrelsen af det transplanterede væv være ensartet på tværs af alle eksperimenter. Størrelsen af det transplanterbare væv er begrænset til 2 mm3 som følge af induktion af nekrose på grund af dårlig ilt miljø18.
I denne undersøgelse, blev en HCC dyremodel oprettet ved hjælp af stillads-fri transplantation af celle ark. Tre typer af celle ark blev transplanteret ind i rats' lever: en celle ark af HCC celle linje celler, en celle ark af HCC celle linje celler og BMSCs og en celle ark af HCC celle linje celler og UCMSCs. Transplantation af alle tre celle ark var tilstrækkelig til at inducere tumorer hos rotter, der modtager. Det var imidlertid bemærkes, at tilføje MSC'er til ark reduceret størrelsen af de dannede tumorer. Dette indikerer, at MSC'er anvendes, især UCMSCs, har en negativ virkning på tumor udvikling. Til sidst, tilbyder kræft celle ark transplantation en effektiv metode til at oprette en dyremodel med solide tumorer. Har sådanne i vivo modeller kunne resultere i kritiske kliniske oplysninger med store applikationer. Desuden som fremgår af tumor størrelse reduktion, begrænse UCMSCs tumor udvikling og udbredelse. Dette indikerer, at nogle MSC undertyper kunne bruges i en celle-baserede tilgang til behandling af kræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke personalet i eksperimentel kirurgi og dyr laboratorium ved College of Medicine, King Saud University, for deres samarbejde og støtte-især Hussain Almukhayzim og Hisham Aloudah. Forfatterne også gerne anerkende Mediateam på King Saud bin Abdul-Aziz University for at forberede visuelle materiale-især Muath bin Ghannam og Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river |
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017).
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
