Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Definere Hsp33's Redox-regulerede anstandsdame aktivitet og kortlægning konformationelle ændringer på Hsp33 ved hjælp af brint-deuterium Exchange massespektrometri

doi: 10.3791/57806 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

En af de mest udfordrende stressforhold, at organismer støder på i løbet af deres levetid medfører ophobning af oxidanter. Under oxidative stress afhængige celler stærkt molekylære chaperoner. Vi præsenterer her, metoder, der anvendes til at undersøge den redox-regulerede anti-sammenlægning aktivitet, samt for at overvåge strukturelle ændringer vedrørende den anstandsdame funktion bruger HDX-MS.

Abstract

Levende organismer skal jævnligt håndtere svingende miljøer i løbet af deres livscyklus, herunder ændringer i temperatur, pH, ophobning af reaktive ilt arter og meget mere. Disse udsving kan føre til en udbredt protein udfoldning, sammenlægning, og celle død. Celler har derfor udviklet sig et dynamisk og stress-specifikke netværk af molekylære chaperoner, der opretholder en "sund" proteomet under stress betingelser. ATP-uafhængig chaperoner udgør en stor klasse af molekylære chaperoner, der tjener som første linje forsvar molekyler, beskyttelse mod protein sammenlægning i en stress-afhængige måde. En funktion disse chaperoner har tilfælles er deres evne til at udnytte strukturfondene plasticitet for deres stress-specifik aktivering, anerkendelse og frigivelse af fejlfoldede klient.

I dette papir fokuserer vi på den funktionelle og strukturelle analyse af en sådan uløseligt uordnede anstandsdame, den bakterielle redox-regulerede Hsp33, der beskytter proteiner imod sammenlægning under oxidativt stress. Vi præsenterer her, en værktøjskasse med forskellige teknikker for at studere redox-regulerede anstandsdame aktivitet og for kortlægning konformationelle ændringer af anstandsdame, ligger til grund for sin aktivitet. Specifikt, vi beskriver en arbejdsproces, der omfatter forberedelse af fuldt reduceret og fuldt oxideret proteiner, efterfulgt af en analyse af den anstandsdame anti-sammenlægning aktivitet in vitro- ved hjælp af lys-spredning, med fokus på graden af den anti-sammenlægning aktivitet og dens forsvindingskinetik. For at overvinde hyppige outliers akkumuleret under sammenlægning assays, beskriver vi brugen af Kfits, en roman grafisk værktøj, der giver mulighed for nem behandling af kinetic målinger. Dette værktøj kan let anvendes til andre typer af kinetic målinger for at fjerne outliers og montering kinetiske parametre. For at korrelere funktionen med protein struktur, vi beskriver opsætning og workflow af en strukturel massespektrometri teknik, brint-deuterium exchange-massespektrometri, der giver mulighed for kortlægning af konformationelle ændringer på anstandsdame og substrat i forskellige faser af Hsp33 aktivitet. Samme metode kan anvendes på andre protein-protein og protein-ligand interaktioner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Celler støder ofte på en ophobning af reaktive ilt arter (ROS) produceret som biprodukter af respiration1,2, proteiner og lipid oxidation3,4, og yderligere processer5, 6,7. Trods ROS' gavnlig rolle i forskellige biologiske processer såsom cellulær signalering8,9 og immunrespons10, kan en ubalance mellem ROS produktion og dets afgiftning forekomme, fører til oxidativ understrege7. De biologiske mål af ROS er proteiner, lipider og nukleinsyrer, oxidation af som påvirker deres struktur og funktion. Derfor er ophobning af cellulære oxidanter stærkt knyttet til en række forskellige sygdomme herunder kræft9,11, betændelse12,13, og aging14, 15, og er blevet fundet for at være involveret i starten og progression af neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers, Parkinsons og ALS sygdom16,17,18.

Både nyligt syntetiserede og modne proteiner er meget følsom over for oxidation på grund af de potentielt skadelige ændringer af deres sidekæder, der former protein struktur og funktion19,20. Derfor fører oxidativt stress som regel til en udbredt protein inaktivering, misfoldning og sammenlægning, i sidste ende fører til celledød. En af de elegante cellulære strategier til at håndtere de potentielle skader af protein oxidation er at udnytte redox-afhængige chaperoner, som hæmmer udbredt protein sammenlægning, i stedet for at danne stabile komplekser med fejlfoldede klient proteiner21 ,22,23. Disse første linje forsvar chaperoner aktiveres hurtigt ved en lokationsspecifik oxidation (normalt på cystein restkoncentrationer), der konverterer dem til potente anti-sammenlægning molekyler24. Da oxidativt stress resulterer i hæmning af respiration og i fald i cellulære ATP niveauer25, er kanoniske ATP-afhængige chaperoner mindre effektive under oxidative stress betingelser25,26 ,27. Derfor, redox-aktiveret ATP-uafhængig chaperoner spiller en afgørende rolle i at opretholde protein homøostase ved ophobning af oxidanter i bakterier og eukaryoter (fx, Hsp3328 og RidA29 i bakterier, Get330 i gær, peroxiredoxins31 i eukaryoter). Aktiviteten af disse chaperoner afhænger kraftigt reversible konformationelle strukturændringer fremkaldt af en lokationsspecifik oxidation, der afdækker hydrofobe regioner involveret i anerkendelse af fejlfoldede klient proteiner.

Forskning af den anti-sammenlægning mekanisme og principperne for anerkendelse af klient proteiner af chaperoner er ikke let følge af anstandsdame-substrat interaktioner32,33, dynamisk og heterogenic 34,35,36,37. Stress-regulerede chaperoner har dog mulighed for at fremme vores forståelse af den anti-akkumuleringsfunktion på grund af deres evne til at: 1) få to forskellige former af den anstandsdame, aktiv (fxoxideret) og inaktive (f.eks. reduceret), med introduktion eller fjernelse af en stress tilstand let skifte mellem dem (f.eks., oxidant og reduktionsmiddel), 2) har en bred vifte af substrater, 3) danner meget stabile komplekser med klienten proteiner, som kan evalueres ved forskellige strukturelle metoder, og 4) fokusere udelukkende på substrat anerkendelse og frigivelse, medieret af redox-afhængige konformationelle ændringer, som fleste af disse chaperoner mangler folde kapacitet.

Her analyserer vi den bakterielle redox-regulerede anstandsdame Hsp33's anti-sammenlægning aktivitet, en vital komponent i den bakterielle forsvarssystem mod oxidation-induceret protein sammenlægning28. Når reduceret, er Hsp33 en stramt foldede zink-bindende protein med ingen anstandsdame aktivitet; men når de udsættes for oxidativt stress, Hsp33 undergår omfattende konformationelle ændringer, der udsætter sit Bæremateriale bindende regioner38,39. Ved oxidation er zinkion, der er stærkt bundet til fire meget bevaret cystein rester af domænet C-terminal frigivet40. Dette resulterer i dannelse af to disulfid obligationer, en udfoldelse af domænet C-terminal og en destabilisering af tilstødende linker region41. Regionerne C-terminal og linker er yderst fleksible og er defineret som uløseligt eller delvist uorganiseret. Efter tilbagevenden til ikke-stressforhold, cysteines blive reduceret og anstandsdame vender tilbage til sin oprindelige foldet tilstand med ingen anti-sammenlægning aktivitet. Hvorved man genfolder af anstandsdame fører til en yderligere udfoldelsen og destabilisering af bundne klient protein, der udløser sin overførsel til den kanoniske anstandsdame system, DnaK/J, for hvorved man genfolder38. Analyse af Hsp33's interaktion websteder tyder på, at Hsp33 bruger begge sine opladet uordnede regioner samt de hydrofobe regioner linker og N-terminale domæne til at fange fejlfoldede klient proteiner og forhindre deres akkumulering38, 42. i den foldede tilstand, disse regioner er skjult af den foldede linker og C-terminale domæne. Interessant, fungerer regionen linker som gatekeeper af Hsp33's foldede og inaktiv tilstand, "sensing" folde status af dets tilstødende C-terminale domæne34. Når destabiliseret af mutagenese (enten ved et punkt mutation eller en fuld sekvens undertrykkelse af netbårne), omdannes Hsp33 til et constitutively aktiv anstandsdame uanset redox tilstand af dens redox-følsomme cysteines43.

Protokollerne præsenteres her tillader overvågning af Hsp33's redox-afhængige anstandsdame aktivitet, samt kortlægning konformationelle ændringer efter aktivering og binding af klient proteiner. Denne metode kan tilpasses forskning andre anstandsdame-klient anerkendelse modeller samt ikke-anstandsdame protein-protein interaktioner. Desuden præsenterer vi protokoller til forberedelse af fuldt reduceret og oxideret chaperoner, der kan bruges i undersøgelser af andre proteiner, redox-switch, til at afsløre potentielle roller af protein oxidation på protein aktivitet.

Specifikt, vi beskriver en metode til at overvåge anstandsdame aktivitet in vitro- og definere sit Bæremateriale specificitet under forskellige typer af protein sammenlægning (kemisk eller termisk induceret) ved hjælp af lysspredning (LS) målt ved et fluorospectrometer44. Under sammenlægning, lys spredning på 360 nm stiger hurtigt på grund af den stigende turbiditet. Således, sammenlægning kan overvåges på en tidsafhængig måde ved denne bølgelængde. LS er en hurtig og følsom metode til afprøvning af protein sammenlægning og dermed anti-sammenlægning aktiviteten af et protein af interesse ved hjælp af nanomolar koncentrationer, gør det muligt for karakterisering af protein sammenlægning-relaterede kinetiske parametre under forskellige betingelser. Derudover LS protokollen beskrevet her kræver ikke dyrt instrumentering, og let kan etableres i alle laboratorier.

Det er dog ganske udfordrende at få "rene" kinetic kurver og at udlede et protein kinetiske parametre fra sådanne lys spredning eksperimenter, på grund af støj og det store antal outliers genereret af luftbobler og store aggregater. For at overvinde denne hindring, præsenterer vi en roman grafisk værktøj, Kfits45, anvendes for at reducere støjniveauet i forskellige kinetic målinger, specielt udstyret til protein sammenlægning kinetiske data. Denne software giver foreløbige kinetiske parametre for en tidlig vurdering af resultaterne og tillader brugeren at "rense" store mængder data hurtigt uden at påvirke dets kinetiske egenskaber. Kfits er implementeret i Python og tilgængelige i open source på 45.

En af de udfordrende spørgsmål i feltet vedrører kortlægning interaktion steder mellem chaperoneproteiner og deres klient proteiner og forstå, hvordan chaperoner genkende en bred vifte af fejlfoldede substrater. Dette spørgsmål er yderligere kompliceret, når studerer højdynamiske proteinkomplekser, der involverer uløseligt uordnede chaperoneproteiner og sammenlægning-tilbøjelige substrater. Heldigvis, strukturelle massespektrometri har dramatisk Avanceret i det sidste årti og har med held givet nyttige metoder og værktøjer til at analysere den strukturelle plasticitet og kortlægge restkoncentrationer involveret i protein anerkendelse46, 47 , 48 , 49. her, præsenterer vi en sådan teknik-brint-deuterium exchange massespektrometri (HDX-MS)-som giver mulighed for kortlægning af rest-niveau ændringer i en strukturel kropsbygning ved protein ændring eller protein/Ligand bindende35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS bruger kontinuerlig udveksling af rygraden brintatomer af deuterium, sats som er påvirket af det kemiske miljø, tilgængelighed og kovalente og kovalente bindinger56. HDX-MS spor disse exchange processer ved hjælp af en deutereret opløsningsmiddel, almindeligt tungt vand (D2O), og tillader måling baseret på ændringen i Molekylær vægt efter brint til deuterium exchange. Langsommere satser for brint-deuterium exchange kan skyldes brintatomer deltager i brint obligationer eller, simpelthen, fra sterisk hindring, som viser lokale ændringer i struktur57. Ændringer på en ligand bindende eller posttranslationelle modifikationer kan også føre til forskelle i brint-miljø med en bindende resulterer i forskelle i brint-deuterium exchange (HDX) satser46,53.

Vi anvendte denne teknologi til 1) kort Hsp33 regioner, som hurtigt udvikler sig ved oxidation, fører til aktivering af Hsp33, og 2) definerer den potentielle bindende grænseflade af Hsp33 med dens fuld længde fejlfoldede substrat, citrat syntase (CS)38.

De metoder, der beskrives i dette håndskrift kan anvendes til at studere redox-afhængige funktioner af proteiner i vitro, definere anti-sammenlægning aktivitet og rollen af strukturelle ændringer (hvis nogen) i protein funktion. Disse metoder kan let tilpasses til forskellige biologiske systemer og anvendes i laboratoriet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse af fuldt reduceret og fuldt oxideret proteiner

  1. Forberedelse af en fuldt reduceret protein
    Bemærk: Her, vi beskriver reduktion af en zink-holdige proteiner, og brug en ZnCl2 løsning til at gendanne tilstanden Zn-indarbejdet, reduceret protein. ZnCl2 løsning kan udskiftes eller kasseres. Bemærk, at tid og temperatur reduktion proces afhænger af protein stabilitet og funktion, og er dermed bestemt pr. protein.
    1. Tø protein prøven på is og spinde det ned til fjern aggregater. Inkuber prøve i mindst 1,5 timer ved 37 ° C med 5 mM DTT og 20 µM ZnCl2 (op til 70% af proteinkoncentration).
      Bemærk: Temperatur på dette trin er protein-afhængige og bør tilpasses protein stabilitet.
    2. Fjerne DTT ved hjælp af udvanding kolonner.
      Bemærk: Der er forskellige afsaltning kolonner tilgængelige. Protokollen nedenfor beskrives fremgangsmåden ved hjælp af specifikke udvanding kolonner (Se Tabel af materialer). Før du bruger andre udvanding kolonner, anbefales det, undersøge deres effektivitet af DTT fjernelse og protein opsving, da nogle udvanding kolonner kan delvist absorbere protein af interesse.
      1. Blandingen henstår kolonnen med en kalium fosfat (KPi) buffer (40 mM, pH 7,5) ved at udfylde kolonnen helt med bufferen og lade den buffer, der drypper ud. Gentag denne proces 2 x.
      2. Fjern filteret hvid disk i kolonnen ved forsigtigt at skubbe det med en pincet og fjerner det; Det er nemmest at fjerne, mens kolonnen er fyldt med KPI-buffer. Refill kolonnen med KPI-buffer og centrifugeres ved 1.000 x g i 3 min.
      3. Overfør kolonnen til en ren rør, tilføje protein prøven langsomt til midten af kolonnen og centrifugeres ved 1.000 x g i 2 min. DTT-fri protein er nu i gennemstrømnings.
    3. Kontrollere dets koncentrationer (fxbruge en UV/Vis spektrometer) og måle sin absorbans ved 280 nm. Beregne proteinkoncentration bruger Beers lov.
    4. Fordel halvdelen af protein prøver i delprøver. Inkuber delprøver i anaerobe forhold (f.eks.ved hjælp af en anaerob kammer) i 20 min til en fuldstændig fjernelse af ilt. Forsegle rør med plastfolie og gemme prøver på-20 ° C eller-80 ° C, afhængig af proteinet.
      Bemærk: Istedet for benytter den anaerobe kammer, rør kan også være glimtede med argon gas til at fjerne ilt.
  2. Udarbejdelse af en fuldstændig oxideret protein
    Bemærk: Det anbefales at forberede oxideret protein prøver fra fuldt reduceret proteiner (beskrevet tidligere). Dette vil reducere heterogenitet i oxidationstrin i cysteines. Det er muligt at bruge forskellige oxiderende reagenser; Her fokuserer vi på hydrogenperoxid (H2O2).
    Advarsel: Undgå overdreven oxidation, da det kan føre til uønskede intramolekylære disulfid obligationer og irreversibel oxidation af forskellige aminosyrer, herunder cystein, methionin, tyrosin og andre.
    1. Resterende protein prøven, tilføje 5 mM H2O2 (frisk fortyndet) og inkuberes det i 3 timer ved 40 ° C under omrystning.
      Bemærk: Temperatur på dette trin er protein-afhængige og bør tilpasses protein stabilitet.
    2. Blandingen henstår kolonnen med KPI-buffer (40 mM, pH 7,5) ved at udfylde kolonnen helt med bufferen og lade den buffer, der drypper ud. Gentag denne proces 2 x.
    3. Fjern filteret hvid disk i kolonnen ved forsigtigt at skubbe det med en pincet og fjerner det; Det er nemmest at fjerne, mens kolonnen er fyldt med KPI-buffer.
    4. Refill kolonnen med KPI-buffer og centrifugeres ved 1.000 x g i 3 min.
    5. Overfør kolonnen til en ren rør, tilføje oxideret protein prøven langsomt til midten af kolonnen og centrifugeres ved 1.000 x g i 2 min. den oxiderede protein er nu i gennemstrømnings.
    6. Kontrollere protein koncentrationer som i trin 1.2.5, opdele de oxiderede proteiner i delprøver, og gemme dem på-20 ° C eller-80 ° C, protein-afhængige.

2. lys spredning sammenlægning Assay

Bemærk: Alle koncentrationer i denne analyse er anstandsdame - og substrat-specifikke, og skal kalibreres. Alle buffere bør 0,22 µm-filtreret, da det er yderst vigtigt, at bufferne er fri for eventuelle partikler eller luft bobler og kuvetter er ren og støvfri. Det er meget vigtigt at bruge en omrører placeret i kvarts kuvette. Kontrollere forskellige omrører størrelser og former for at sikre en effektiv blanding af hele løsningen uden at producere uønskede luftbobler. Desuden er der forskellige flouorospectrometers findes i laboratorier og faciliteter. Her, blev en bestemt fluorospectrometer (Se Tabel af materialer) brugt. Forskellige instrumenter har en forskelligartet følsomhed, måling hastighed og sampler parametre. Derfor, de nøjagtige måling parametre (f.eks.emission og excitation båndbredde, følsomhed og andre) skal optimeres ved hjælp af en kendt sammenlægning-tilbøjelige protein og dens tilsvarende betingelser. Bruger citrat syntase (CS) og/eller luciferase som indledende substrater i nanomolar koncentrationer anbefales.

  1. Kemiske sammenlægning assay
    1. Forberede denatureret underlaget af kvægbruget 12 µM CS overnatning i 40 mM HEPES (pH 7,5) og 4,5 M GdnCl. For at bevare pH, opløses GdnCl i 40 mM HEPES (pH 7,5).
    2. Åbn fluorospectrometer software og gå til kursus tidsmåling. Indstil parametrene: temperatur: 25 ° C; Λem: 360; EM båndbredde: 5 nm; Λex: 360; Ex båndbredde: 2,5 nm; og Data interval: 0,5 s.
    3. Forbered prøven ved at tilføje 1.600 µL af 40 mM HEPES til et quartz kuvette. Indsæt kuvette i prøveholderen og lad prøven nå den ønskede temperatur.
    4. Indstil omrøring til 600 omdr. / min. og begynder målingen, indtil en baseline er etableret. Holde omrøring i hele målingen.
    5. At måle CS sammenlægning i mangel af en anstandssdame, på 120 s i målingen, tilføje (forsigtigt, men hurtigt) 10 µL af denatureret CS (endelig koncentration af 75 nM). Fortsætte målingen for 1.200 s.
    6. At måle CS sammenlægning i overværelse af Hsp33, 60 s i målingen, tilføje Hsp33 (endelig koncentration på 300 nM). Efter en yderligere 60 s, tilsæt 10 µL af denatureret CS (endelig koncentration af 75 nM). Fortsætte målingen for 1.200 s.
      Bemærk: Når du tilføjer substrat eller anstandsdame, for at undgå indsættelse af bobler, bruge en 10 µL pipette.
  2. Termisk sammenlægning assay
    Bemærk: Temperaturen for termisk sammenlægning assay afhænger af protein stabilitet og bør justeres til hver protein uafhængigt.
    1. Åbn fluorospectrometer software og gå til kursus tidsmåling. Indstille parametre som følger: temperatur: 43 ° C; Λem: 360; Emission båndbredde: 5 nm; Λex: 360; Excitation båndbredde: 2,5 nm; og Data interval: 0,5 s.
    2. Forbered prøven ved at tilføje 1.600 µL af pre varmede 40 mM HEPES til et quartz kuvette. Indsæt kuvette i prøveholderen og lad prøven nå 43 ° C.
    3. Indstil omrøring til 600 omdr. / min. og begynder målingen, indtil en baseline er etableret. Holde omrøring i hele målingen.
    4. At måle CS sammenlægning i mangel af en anstandssdame, på 120 s i målingen, forsigtigt tilføje CS (endelig koncentration af 125 nM) og fortsætte med måling for 1.200 s.
    5. At måle CS sammenlægning i overværelse af Hsp33, 60 s i målingen, tilføje Hsp33 (endelig koncentration på 600 nM). Efter en yderligere 60 s, tilføje CS (endelig koncentration af 125 nM). Fortsætte målingen for 1.200 s.
      Bemærk: Når du tilføjer substrat eller anstandsdame, undgå indsættelse af bobler.
  3. Data analyse og støj fjernelse af Kfits
    Bemærk: Kfits er tilgængelige ved brug af Kfits har tidligere været beskrevet i Trine et al. 45
    1. Upload datafilen.
      Bemærk: Input er de rå resultater fra lysspredning målinger i en tekstuel semikolonsepareret eller tabulatorsepareret format.
    2. Du kan fjerne enhver støj, vælge analyseparametre. Brug automatisk bedste model (anbefales), markere flaget støj er altid over signal .
    3. Manuelt fjerne indlysende afvigende resultater ved hjælp af de grønne og røde justerbar linjer; Dette trin vil filtrere støj over den grønne linje og rød linje.
    4. Indstil grundlinjen og fit kurven. Efter anvender støj tærsklen, hente de behandlede data.

3. brint-deuterium Exchange massespektrometri

  1. Forberedelse af buffere og protein prøver (Hsp33 og Hsp33-CS komplekse)
    1. Fortynd protein prøver til en endelig koncentration på 1 mg/mL i 25 mM Tris-HCl buffer ved pH 7,5 og overføre dem til 1,5 mL hætteglas.
    2. Forbered protein-substrat komplekse prøver ved at inkubere Hsp33 med CS i forholdet 1:1.5 ved 43 ° C.
      1. Tilføj CS i en trinvis måde at undgå enhver hurtig sammenlægning og sikre en frugtbar binding mellem Hsp33 og termisk udfoldet CS.
      2. Brug mindst fire trin (dvs.hver gang tilføje en fjerdedel af det endelige rumfang) og inkuberes prøver for 15 min efter hver tilsætning at tillade CS beskyttelse af Hsp33.
    3. Fjerne alle aggregater, ved hjælp af en 30-min centrifugering på 16.000 x g ved 4 ° C.
      Bemærk: Nye protein-substrat komplekser skal tilberedes frisk. Substrat tilføjelse bør foretages gradvist; ellers, sammenlægning opstår. Temperatur, substrat og substrat koncentrationer er protein-specifikke.
    4. Forbered en buffer Hansen (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), der fungerer som deuteration kontrol, og en buffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), som er deuteration bufferen. Også forberede en frisk quenching buffer (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, 0,1% myresyre).
      Bemærk: Quenching bufferen skal optimeres for protein af interesse for at få sin maksimal sekvens dækning efter pepsin fordøjelsen.
    5. Overføre alle buffere og prøver i hætteglas, og placere dem i passende bakker. Hold buffere H og D ved 25 ° C (bakke 25 ° C); på den anden side holde prøver og dæmper buffer på 0 - 2 ° C (bakke 0 ° C). Placer prøverne i 150 µL glas indsatse (Se Tabel af materialer) først, og derefter overføre dem til hætteglas.
  2. Forberedelse af instrumentet
    Bemærk: Den massespektrometer kommer med to ledsager softwareprogrammer: en styrer pumperne, og den anden styrer den massespektrometer (Se Tabel af materialer). De næste skridt vil blive beskrevet ved hjælp af disse to programmer.
    1. Manuelt Tænd alle køleenheder. Når alle kølesystemer nå deres mål temperaturer, manuelt skifte på både high-performance væskekromatografi (HPLC) og lastning pumper.
      Bemærk: I vores tilfælde, disse består af to afkøling bade og en kølende boks (som indeholder fælde og analytiske kolonner). En køleenhed køler bakke ved 0 ° C, mens den anden holder skuffen ved 25 ° C; temperaturen i boksen køling er 1-2 ° C.
    2. Åbne den software, der styrer både pumper samt den software, der styrer massespektrometer; Kontroller, at MS er på Standby.
    3. Afmonter HPLC udløbsventilen fra MS kilde og vaske system først med en "tredobbelt renere" løsning (1% myresyre, 33% acetonitril, 33% isopropanol, 33% methanol), derefter med buffer B (80% acetonitril, 0,1% myresyre), og endelig med buffer en (0,1% myresyre, pH 2.25), og derefter indsætte kolonnen pepsin i systemet. Hvis ændre buffere, Sørg for at rense begge pumper, før du fortsætter.
    4. Sikre, at strømningshastigheden for begge pumper er 0,1 mL/min og trykket er stabil.
    5. Efter vask system med et konstant flow og konstant pres, indsætte HPLC outlet i MS kilde og tænde MS.
  3. Massespektrometer parametre
    1. Indstille peptid ionisering til electrospray Ionisation (ESI) ved 175 ° C, kappe gasflow på 17, aux gas glød på 2, og spray spænding på 4,5 kV (tillægs figur 1).
    2. Konfigurer parametre som følger for de ikke-deutereret prøver.
      1. Indstille parametre: scanningsområde m/z til 300-1500; Opløsning til 70.000; Automatisk gain control mål (AGC) til 106; og den maksimale injektion tid (IT) på 100 ms.
        Bemærk: De 5 mest intense ioner med afgift stater mellem + 2 og + 6 (deres intensitet højere end 1,3 x 104) og en dynamisk vindue 30 i bliver isoleret.
      2. Udføre ion fragmentering af højere energi collisional dissociation (HCD) i cellen multiple-kollision med normaliseret kollisionen energi (NCE) svarende til 28. Opdage fragmentioner af tandem Massespektrometri med en opløsning på 35.000, AGC mål 105, maksimale det på 60 ms og en isolation vindue til 2,0 m/z.
    3. Deutereret prøverne, ansætte MS1 kun med en højere opløsning af 140.000 og ellers lignende parametre.
  4. Kører forsøget
    1. Angiv bakkerne på følgende måde.
      1. Placer buffer H og D i bakke 25 ° C, og derefter placere prøver og dæmper buffer i bakken 0 ° C.
      2. Sted X Tom hætteglas, justeret i begge bakker, hvor X = antallet prøver x antallet af tiden point.
        Bemærk: I bakken 25 ° C Tom hætteglassene tjene som prøveglas, og i bakken 0 ° C, de tjener som dæmper hætteglas.
      3. Hver af de tomme hætteglas indeholder en tom glasindsats; Slet og erstat sagde indsætte mellem eksperimenter.
        Bemærk: For at køre HDX eksperiment på den mest effektive og mindst tidskrævende måde, en software, som giver mulighed for prøver, der skal køres samtidigt (tillægs figur 2) blev brugt. De næste skridt vil blive beskrevet ved hjælp af denne software.
    2. Åbn softwaren. Konfigurere parametrene program til at udføre følgende.
      1. Inkuber hver prøve (5 µL) med 45 µL af buffer D i flere minutter, afhængigt af de tid point valgt (f.eks.1, 3, 18, 40 og 100 min) på 25 ° C. Inkuber ikke-deutereret prøven med 45 µL af buffer H i stedet.
      2. Umiddelbart efter inkubation, Bland 50 µL af deutereret protein i 50 µL af iskold quenching buffer og tilføre dem i en immobiliseret pepsin kolonne (20 mm i længden, 2,0 mm i diameter).
      3. Elueres enhver peptider fra kolonnen pepsin i kolonnen før ved at vaske det med buffer A i 6 min. med en sats på 50 µL/min. hold buffer A i boksen afkøling på 0 ° C.
      4. Elueres af kolonnen før i kolonnen C18 analytiske peptider (C18 kolonne, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, holdt ved 0 ° C), og adskil dem ved at anvende en lineær gradient af acetonitril på 100 µL/min. Run acetonitril forløb med acetonitril 100% som buffer B : 7 min på 2%, 7 min. på 10-30%, 2,5 min 30-90%, 1,5 min. ved 90%, hurtige forløb for 1 min på 90-8%, og endelig Blandingen henstår kolonnen i 4 min på 2%.
    3. Opbygge en løbende sekvens (Se tillægs figur 2): Indtast alle tidspunkter, prøve navne, og steder i magasinerne, som buffer navne og placeringer.
      Bemærk: Softwaren giver mulighed for justering af alle de forskellige kørende gange i et program, der kører flere prøver på én gang, effektivt faldende kørende gange.
  5. Dataanalyse
    Bemærk: Vi arbejder med flere software-programmer i forbindelse med dataanalyse, herunder Proteomet Discoverer og MaxQuant (gratis software) for peptid identifikation og analyse af sekvens dækning, samt HDX workbench, en gratis software, der giver mulighed for analyse af deuterium indarbejdelse i proteiner, og en sammenligning af HDX priser mellem forskellige sæt af eksperimenter. De næste skridt vil blive beskrevet ved hjælp af disse programmer.
    1. Analysere peptid dækning af prøven ved at køre ikke-deutereret kontrolprøver gennem software (supplerende figur 3). Konfigurere softwaren ved hjælp af følgende parametre.
      1. Brug metoden Sequest HT med en No-enzym (uspecifik) kløver. Søgning efter peptider af 4-144 aminosyrer med en masse tolerance af 7 ppm og 0,5 Da for en forløber ion og fragment. Mulighed for en dynamisk methionin oxidation.
      2. Oprette en database for protein, hvorigennem softwaren kan bestemme peptid dækning. Eksportere de identificerede peptider i tekstuel format.
    2. Analysere deutereret resultaterne ved hjælp af HDX workbench gratis software58.
      1. Åbne redigeringsværktøjet til protein og definere proteinet ved at indsætte filen protein sekvens og peptid dækning.
      2. Næste, lukke op den Setup eksperimentere guiden editor og indtaste alle de input, efterspurgt i.
        Bemærk: Programmet kræver antallet stikprøver, antallet af point, tid, antallet flergangsbestemmelser, pH-værdien af bufferne, og temperaturen.
      3. Endelig, input parametre vedrørende massespektrometer bruges, hvorefter programmet genererer en liste over fundne peptider.
        Bemærk: Softwaren registrerer "HDX" peptider, inspicerer isotop klynger, og viser en klar visualisering af deuteration i prøverne.
  6. Præsentation af data
    1. Label regioner med en ærbødig deuteration udbredelse struktur ved hjælp af den PyMol eller enhver anden visualisering software.
    2. Indføre deuterium optagelse niveauer i stedet for B-faktor værdier.
      Bemærk: En grundlæggende tutorial kan findes på https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De to beskrevne metoder gør det muligt at følge den kinetiske aktivitet og dynamik af protein interaktioner mellem en anstandsdame og sit Bæremateriale. Derudover tillader reduktion-oxidation protokollen tilberedning af et fuldt reduceret og fuldt oxideret anstandsdame, at give en mere dybdegående forståelse af aktivering mekanisme af redox-afhængige uordnede chaperoner.

Først, vi brugte lysspredning for at undersøge anstandsdame redox-afhængig aktivitet. Lysspredning blev udført på en kemisk og termisk denatureret CS protein i overværelse af en oxideret (aktiv) eller reduceret (inaktiv) anstandsdame (figur 1). Kemiske denaturering fører til en hurtig CS sammenlægning induceret af hvorved man genfolder en fuldt denaturized protein i ugunstige buffer betingelser. På den anden side resultater den thermal-induceret sammenlægning fra en relativt langsom udfoldelsen af den indbygget foldede substrat. Derfor, disse forskellige typer af sammenlægning processer varierer i deres kinetiske parametre. Desuden kan forskellige chaperoneproteiner variere i deres evne til at forhindre en sammenlægning af den samme substrat i forskellige sammenlægning tilstande.

I begge former af denaturering, tilsætning af oxideret Hsp33 i en kindtand forholdet 1:4 (CS: Hsp33) helt afskaffet sammenlægning, sænke de 360 nm aflæsninger til ubetydelige værdier. Tilstedeværelsen af et reduceret Hsp33, på den anden side havde ingen effekt på CS stabilitet og gav en sammenlægning kurven svarer til den opdaget i mangel af en anstandsdame (figur 1). Resultaterne blev analyseret og renset fra baggrundsstøj ved hjælp af Kfits, så skematisk beskrevet i figur 2.

Omridset af HDX-MS teknik begynder med inkubation af anstandsdame med deuteriumoxid, efterfulgt af dæmper og fordøjelse, og endelig MS analyse og brint-deuterium udveksle profilering (figur 3). Under HDX-MS, blev anstandsdame udruget på bakken ved 25 ° C i en D2O-holdige buffer. Efter en bestemt inkubationstiden kontrolleret af prøven håndtering robotsystem, protein løsning blev overført til den dæmper løsning, sure og denaturering, på bakken ved 0 ° C. Den lave pH og lav temperatur bremser brint udveksling og bevarer deuteration niveauerne af alle akrylamid brintatomer, mens den denaturering kemiske udfolder protein, således at det kan være korrekt fordøjet. Den robot system overfører prøven fra bakken ved 0 ° C til boksen afkøling hvor den munder ud i kolonnen online pepsin fordøjelsen. Umiddelbart efter protein fordøjelse, peptider videre til kolonnen C18-fælde til afsaltning og fjernelse af hurtigt udskiftelig D2O (primært placeret på side kæde atomer) og derefter adskilt ved hjælp af C18 kolonne og analyseret ved hjælp af masse massespektrometri. Prøven flow styres af en to-ventil system, som 1) sikrer en adskillelse af pepsin og C18 kolonne buffere for at forhindre inaktivering af pepsinet af organiske opløsningsmidler, og 2) giver korte udblødning peptider til at fjerne hurtigt udskiftelige D2O molekyler og salte (figur 4).

Efter den beregningsmæssige analyse modtager vi en deuteration profil for hver peptid, viser en ændring i masse som en funktion af inkubationstiden i D2O. HDX Workbench software giver mulighed for sammenligning af eksperimentelle flergangsbestemmelser for at skabe statistiske analyser for hver betingelse (f.eks, en aktiv anstandsdame i en ubundet formular). Det næste trin er en sammenligning af deuteration kurver mellem forskellige prøver; for eksempel, en bundet anstandsdame og en ubundet anstandsdame. Disse sammenligninger af forskellige anstandsdame stater kan afsløre de strukturelle perturbationer, der ledsager substrat bindende. Rester, der udviser en langsommere udveksling i tilstanden bundne sandsynligvis interagerer med en bindende partner. Det er vigtigt at bemærke, at nedsat brint-deuterium valutakurser kan også angive en hvorved man genfolder i en bestemt region ved bindende uden de faktiske direkte interaktion med substrat (figur 5A). HDX Workbench software giver mulighed for gennemgang af resultaterne i visningen "undertrykkelse af netbårne" ved at vise deuteration med en standardfejl over dækning af hele proteinet.

I dette tilfælde blev HDX-MS brugt til at sammenligne deuteration mønster mellem bundne og ubundne anstandsdame Hsp33 til sit Bæremateriale CS. Resultaterne afslører en klient-interaktion websted inden for C-terminale redox skifte domæne anstandsdame (figur 5B). Mens reducerede, har Hsp33 en helt bestilte struktur, hvor interaktion websteder er begravet. Hsp33 mister sin struktur og bliver funktionelle, når det sanser oxidativt stress; dermed, vi sammenlignede den reduceret og oxideret Hsp33 på både bundne og ubundne betingelser (figur 5C). Resultaterne viser, at mens den reducerede Hsp33, hvorvidt bundet eller ubundet, producerer lignende peptid kurver, oxideret Hsp33 viser en signifikant forskel. De oxiderede Hsp33 prøver viser en 30% deuteration forskellen mellem det bundne og ubundne anstandsdame, med specifikke områder af bundet protein, der angiver en allosteriske hindring. Analyse af yderligere peptider fra N-terminalen og thermobile linker regioner er vist i supplerende figur 3.

Figure 1
Figur 1 . Sammenlægning analyse af lysspredning. Sammenlægning af kemisk og termisk denatureret CS blev overvåget i overværelse af oxideret Hsp33 (rød), reduceret Hsp33 (blå), eller i mangel af anstandsdame (sort). En lysspredning på 360 nm blev overvåget for 1.200 s. (A) under den kemiske sammenlægning, i mangel af en anstandsdame eller tilstedeværelse af en reduceret Hsp33, CS aggregerede hurtigt, at nå et plateau ca. 300 s i målingen. (B) under de termiske sammenlægning, CS aggregerede gradvist i mangel af en anstandsdame eller tilstedeværelse af en nedsat Hsp33. I begge assays afskaffet tilstedeværelsen af oxideret Hsp33 helt sammenlægning, som blev demonstreret af ubetydelig 360-nm aflæsninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Fjernelse af støj og data analyse ved hjælp af Kfits. Dette panel viser et skema opsummerer data analyse og støj fjernelse af værktøjet Kfits som beskrevet i teksten og i Trine et al. 45. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Arbejdsprocessen af HDX-MS metoden. HDX-MS beskæftiger deutereret opløsningsmidler til at bestemme det kemiske miljø af akrylamid brintatomer, jævnt fordelt langs rygraden i proteinet. Protein af interesse er inkuberes i en deuterating buffer i sin oprindelige form i bestemte perioder, så brint-deuterium exchange er slukket af sure betingelser ved lav temperatur. Protein er fordøjet af et enzym stabil sure betingelser såsom pepsin. Bagefter, er peptider afsaltes og adskilt i en kort tid til at undgå en tilbage udveksling. Endelig, peptider analyseres af et massespektrometer og deuterium optagelsen vurderes ved en analyse software, for eksempel ved HDX Workbench gratis software58. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Komponenter af den fuldt automatiseret HDX-MS system. (A) denne skematisk diagram over HDX-MS repræsenterer alle dele af systemet: lastning pumpen og buffer HPLC pumpe kontrolflow og prøven overførsel inden for systemet. Den robot system indeholder to sprøjter og bakker, som bruges til at forberede deutereret prøven og overføre proteinerne til den on-line fordøjelse kolonne via input ventilen i boksen afkøling (LC rum). Derefter fordøjet peptider, der er rettet til kolonnerne C18 fælde og adskillelse, efterfølgende adskilt og dirigeret til den massespektrometer. (B) dette panel viser den faktiske HDX system setup, som det blev skabt i laboratoriet. (C) dette panel viser en skematisk præsentation af online-fordøjelsen og peptid adskillelse fluidic konfiguration. Fordøjelse og udskillelse systemer har en ventil, hver der kan skiftes mellem belastning og injicere tilstande. Den første ventil (til venstre) er forbundet med havnens injektion og er kontrolleret af lastning pumpe, lede prøver i den pepsin kolonne ved hjælp af den sure buffer uden organiske opløsningsmidler, der kan skade pepsin harpiks. Prøven er overført til den højre ventil i kolonnen fælde for at fjerne rester af deuterium samt udveksles hurtigt deutereret atomer (primært af sidekæder). Efter en kort vask af 1-2 min i kolonnen fælde, ventilen ændrer sin tilstand til at indlæse og prøven er vasket i kolonnen C18 adskillelse ved hjælp af HPLC pumpe med stigende koncentrationer af acetonitril. Prøven overføres til massespektrometer til en masse analyse. Længden af rørene er markeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . HDX-MS resultater. (A) resultaterne er præsenteret som en deuteration procent over tid pr. protein fragment, genereret af HDX Workbench software. Hver graf viser et protein prøve, enten oxideret eller reduceret, og sammenligner mellem bundne og ubundne prøver. Peptid fragmenter vist her er peptid YVVITITPSEG fundet i regionen linker og peptid LQVMPAQNAQQDDFD fundet i C-terminus. (B) de endelige resultater, præsenteret som deuteration forskellen mellem de bundne og ubundne komplekser, viser den undertrykkelse af netbårne pr. aminosyre. (C) en strukturel model af Hsp33 anstandsdame viser deuteration udbredelse forskelle i hele linker og C-terminale ustabile regioner. Dette panel er lavet ved hjælp af PyMol software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Tillægs figur 1. Grænsefladen af programmet opererer massespektrometer. Programmet bruges til at optimere og definere massespektrometer parametre anvendes til HDX eksperiment. Metodeparametre (i panelet til venstre) kan gemmes i metoden, så er anerkendt af andre programmer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2. Denne figur viser et screenshot af den software, der fungerer som en integration platform for robotic prøveudtagning aflevering- og MS-LC-systemet. Programmet optimerer kørselstiden ved planlægning af HDX eksperimentet, efter den definerede inkubationstiden i deutereret bufferen (blå pile). For eksempel, ovenfor er et diagram af 17 løber af to replicative analyser af den Hsp33 variant STIL, inkuberes i en deutereret buffer til forskellige tider, lige fra 0 - 100 min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3. Denne figur viser en analyse af deuterium optagelse af flere Hsp33 peptider fra forskellige Hsp33 varianter, opkaldt PGBD og REV34. Observationsområderne demonstrere ændringer i deuterium optagelsen af den samme område i Hsp33 i ubundet (rød) og bundet (blå) stater. Peptider fra den N-terminale region viser ingen signifikant forskel i HDX satser, mens fragmenter fra regionen linker viser et betydeligt fald i HDX satser på samspillet med udfoldet substrat, citrat syntase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I dette papir givet vi protokoller for analyse af aktivitet i redox-afhængige anstandsdame og karakterisering af strukturelle ændringer på bindingen af en klient protein. Disse er komplementære metoder til at definere potentielle anstandsdame-substrat komplekser og analysere potentielle samspil websteder.

Her, vi har anvendt disse protokoller til karakterisering af en kompleks mellem den redox-regulerede anstandsdame Hsp33 med velundersøgte anstandsdame substrat CS. Vi præsenteret to forskellige typer af protein sammenlægning analyser, som er forskellige i deres kinetiske og oprindelige tilstand: under en kemisk denaturering, underlaget begynder sin udfoldelsen proces fra denatureret form, mens under en termisk sammenlægning, den udfolder sig er initieret fra native form af substratet.

Lys-spredning målinger er et nyttigt værktøj til at overvåge den relative mængde af protein sammenlægning. Mens vi bruger denne metode til at bestemme den aktive tilstand af anstandsdame, kan det yderligere bruges til at studere generel sammenlægning betingelser, at sammenligne stabiliteten i en forskellige protein, eller at studere destabiliserende mutationer både substrat og anstandsdame.

Trods sin enkelhed, kan metoden lysspredning producere larmende data med flere outliers. For at overvinde dette problem har udviklet vi Kfits software beskrevet ovenfor. Kfits software gør det muligt at ganske enkelt og hurtigt fjerne store mængder data, støjende, samt beregne de kinetiske parametre fra lysspredning kurve. Kfits er ikke begrænset til protein sammenlægning og kan anvendes til enhver type af kinetic målinger.

Således, de metoder, der er beskrevet her er enkel, let at udføre og ikke tidskrævende. De kan anvendes til forskellige molekylære chaperoner, gør det muligt for deres redox afhængighed skal undersøges inden for et par dage. Desuden, den anti-sammenlægning aktivitet af andre, ikke-redox afhængige chaperoneproteiner kan evalueres ved hjælp af protokollerne beskrevet af lysspredning og Kfits. Det er vigtigt at bemærke, at forskellige parametre såsom temperatur, proteinkoncentration og måleperioden skal justeres til hver enkelt protein system uafhængigt.

For at opnå strukturelle oplysninger vedrørende en anstandsdame arbejder cyklus, præsenterede vi HDX-MS metoden. I modsætning til lysspredning procedure, det er en mere kompleks teknologi og kræver særlige instrumentering, herunder et massespektrometer og helst, en robot system for prøveforberedelsen. Men denne opsætning kan blive etableret, selv uden robotsystem, i et eksisterende anlæg. Når det er fastslået, at proceduren er relativt simpel og giver mulighed for analyse af udfordrende proteinkomplekser, som kan være unreached ved høj opløsning metoder (f.eks.røntgen og NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemlig hen til Meytal Radzinski for hendes nyttige diskussioner og kritiske læsning af artiklen og Patrick Griffin og hans lab medlemmer for deres ubegrænset hjælp mens etablere HDX analyse platform. Forfatterne er taknemmelige for den tysk-Israel Foundation (I-2332-1149.9-2012), binationale Science Foundation (2015056), Marie Curie-integration grant (618806), Israel Science Foundation (1765/13 og 2629/16), og Human Frontier Science Program (CDA00064/2014) for deres finansielle støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292, (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417, (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98, (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25, (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44, (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32, (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12, (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20, (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18, (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19, (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288, (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23, (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42, (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82, (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427, (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17, (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291, (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291, (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56, (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280, (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51, (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427, (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27, (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429, (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281, (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292, (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135, (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275, (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14, (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285, (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24, (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34, (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24, (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24, (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142, (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291, (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56, (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, (9), 1512-1521 (2012).
Definere Hsp33's Redox-regulerede anstandsdame aktivitet og kortlægning konformationelle ændringer på Hsp33 ved hjælp af brint-deuterium Exchange massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter