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Biochemistry

हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर Hsp33 पर Hsp33's Redox-विनियमित निगरानी गतिविधि और मानचित्रण गठन परिवर्तन परिभाषित करना

doi: 10.3791/57806 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

सबसे चुनौतीपूर्ण तनाव की स्थिति है कि जीवों को अपने जीवनकाल के दौरान मुठभेड़ में से एक oxidants का संचय शामिल है । ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान, कोशिकाओं को भारी आणविक chaperones पर भरोसा करते हैं । यहाँ, हम वर्तमान redox-विनियमित विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, साथ ही HDX-MS का उपयोग कर निगरानी समारोह शासी संरचनात्मक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए.

Abstract

जीवों को नियमित रूप से तापमान में परिवर्तन, पीएच, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के संचय, और अधिक सहित अपने जीवन चक्र के दौरान अस्थिर वातावरण के साथ सामना करने की जरूरत है । इन उतार चढ़ाव एक व्यापक प्रोटीन खुलासा, एकत्रीकरण, और कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, कोशिकाओं को एक गतिशील और तनाव आणविक chaperones, जो तनाव की स्थिति के दौरान एक "स्वस्थ" proteome बनाए रखने के विशेष नेटवर्क विकसित किया है । एटीपी स्वतंत्र chaperones आणविक chaperones, जो पहली लाइन रक्षा अणुओं के रूप में सेवा, एक तनाव पर निर्भर तरीके से प्रोटीन एकत्रीकरण के खिलाफ की रक्षा के एक प्रमुख वर्ग का गठन किया । एक विशेषता इन chaperones आम में है उनके लिए अपने तनाव विशेष सक्रियण, मांयता के लिए संरचनात्मक प्लास्टिक का उपयोग करने की क्षमता है, और ग्राहक के सामने जारी की ।

इस पत्र में, हम एक ऐसे आंतरिक रूप से परिक्रमित निगरानी के कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित, बैक्टीरियल redox-विनियमित Hsp33, जो ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान एकत्रीकरण के खिलाफ प्रोटीन की रक्षा करता है । यहां, हम redox-विनियमित निगरानी गतिविधि का अध्ययन करने के लिए विविध तकनीकों का एक उपकरण बॉक्स प्रस्तुत करते हैं, साथ ही साथ निगरानी की संरचना में परिवर्तन मानचित्रण के लिए, अपनी गतिविधि अंतर्निहित । विशेष रूप से, हम एक कार्यप्रवाह जो पूरी तरह से कम और पूरी तरह से ऑक्सीकरण प्रोटीन की तैयारी भी शामिल है का वर्णन, निगरानी विरोधी के एक विश्लेषण के द्वारा पीछा इन विट्रो में प्रकाश कैटरिंग का उपयोग कर, की डिग्री पर ध्यान केंद्रित विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि और उसके कैनेटीक्स । एकत्रीकरण परख के दौरान संचित अक्सर outliers पर काबू पाने के लिए, हम Kfits, एक उपंयास चित्रमय उपकरण है जो काइनेटिक माप के आसान प्रसंस्करण की अनुमति देता है के उपयोग का वर्णन । इस उपकरण को आसानी से outliers और फिटिंग काइनेटिक मापदंडों को हटाने के लिए काइनेटिक माप के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । प्रोटीन संरचना के साथ इस समारोह को सहसंबंधी बनाना, हम सेटअप और एक संरचनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक के कार्यप्रवाह का वर्णन, हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम विनिमय जन स्पेक्ट्रोमेट्री, कि निगरानी पर गठन के परिवर्तन के मानचित्रण की अनुमति देता है और Hsp33 गतिविधि के विभिंन चरणों के दौरान सब्सट्रेट । इसी पद्धति से अन्य प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-ligand इंटरैक्शन को लागू किया जा सकता है.

Introduction

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कोशिकाओं को अक्सर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) श्वसन1,2, प्रोटीन और लिपिड ऑक्सीकरण3,4, और अतिरिक्त प्रक्रियाओं5के शोधकार्य के रूप में उत्पादित का एक संचय का सामना, 6,7. ऐसे सेलुलर8,9 और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया10संकेत के रूप में विविध जैविक प्रक्रियाओं में ' ROS लाभकारी भूमिका के बावजूद, ROS उत्पादन और उसके detoxification के बीच एक असंतुलन हो सकता है, ऑक्सीडेटिव के लिए अग्रणी तनाव7. ROS के जैविक लक्ष्य प्रोटीन, लिपिड, और न्यूक्लिक एसिड, जो के ऑक्सीकरण उनकी संरचना और समारोह को प्रभावित कर रहे हैं । इसलिए, सेलुलर oxidants के संचय दृढ़ता से कैंसर9,11, सूजन12,13सहित विकृतियों की एक विविध रेंज से जुड़ा हुआ है, और14उंर बढ़ने, 15, और इस तरह के अल्जाइमर, पार्किंसंस, और ALS रोग के रूप में neurodegenerative विकारों की शुरुआत और प्रगति में शामिल होना पाया गया है16,17,18.

दोनों नव संश्लेषित और परिपक्व प्रोटीन अत्यधिक उनके पक्ष चेन, जो आकार प्रोटीन संरचना और समारोह19,20के संभावित हानिकारक संशोधनों के कारण ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील हैं । इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव आमतौर पर एक व्यापक प्रोटीन निष्क्रियता, खुलासा और एकत्रीकरण की ओर जाता है, अंततः कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी । सुरुचिपूर्ण सेलुलर रणनीतियों में से एक प्रोटीन ऑक्सीकरण की संभावित क्षति के साथ सामना करने के लिए redox-निर्भर chaperones, जो व्यापक प्रोटीन एकत्रीकरण को बाधित का उपयोग करने के बजाय, के साथ स्थिर परिसरों के गठन के लिए ग्राहक प्रोटीन के साथ21 ,२२,२३. ये पहली लाइन रक्षा chaperones तेजी से एक साइट विशेष ऑक्सीकरण द्वारा सक्रिय कर रहे है (आमतौर पर cysteine अवशेषों पर) है कि उंहें शक्तिशाली विरोधी एकत्रीकरण अणुओं में धर्मांतरित24। चूंकि श्वसन के निषेध में ऑक्सीडेटिव तनाव परिणाम और सेलुलर एटीपी स्तर25में घट जाती है, विहित एटीपी-निर्भर chaperones कम प्रभावी रहे हैं ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति के दौरान25,26 ,27. इसलिए, redox-सक्रिय एटीपी-स्वतंत्र chaperones बैक्टीरिया और eukaryotes में oxidants के संचय पर प्रोटीन homeostasis को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं (जैसे, Hsp3328 और रिदा29 बैक्टीरिया में, Get330 खमीर में, peroxiredoxins31 eukaryotes में) । इन chaperones की गतिविधि दृढ़ता से प्रतिवर्ती संरचनात्मक संरचना पर निर्भर करता है एक साइट विशेष ऑक्सीकरण द्वारा प्रेरित परिवर्तन है कि hydrophobic क्षेत्रों को उजागर ग्राहक प्रोटीन की पहचान में शामिल है ।

विरोधी एकत्रीकरण तंत्र के अनुसंधान और chaperones द्वारा ग्राहक प्रोटीन की मांयता शासी सिद्धांतों निगरानी-सब्सट्रेट बातचीत३२,३३के गतिशील और heterogenic प्रकृति के कारण आसान नहीं है, ३४,३५,३६,३७. हालांकि, तनाव विनियमित chaperones के लिए अपनी क्षमता के कारण विरोधी एकत्रीकरण समारोह के बारे में हमारी समझ अग्रिम करने का अवसर है: 1) निगरानी के दो विभिंन रूपों, सक्रिय (जैसे, ऑक्सीकरण) और निष्क्रिय प्राप्त करें (जैसे, कम), परिचय या एक तनाव की स्थिति को हटाने के साथ आसानी से उन दोनों के बीच स्विचन (जैसे, ऑक्सीडेंट और एजेंट को कम करने), 2) सब्सट्रेट की एक विस्तृत श्रृंखला है, 3) फार्म का ग्राहक प्रोटीन है कि द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के साथ उच्च स्थिर परिसरों विभिंन संरचनात्मक तरीके, और 4) पूरी तरह से सब्सट्रेट मांयता और रिहाई पर ध्यान केंद्रित, redox-निर्भर गठन परिवर्तन द्वारा मध्यस्थता, इन chaperones के बहुमत के रूप में तह क्षमता का अभाव है ।

यहां, हम जीवाणु redox-विनियमित निगरानी Hsp33's विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि, ऑक्सीकरण प्रेरित प्रोटीन एकत्रीकरण28के खिलाफ जीवाणु रक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण घटक का विश्लेषण । जब कम, Hsp33 कोई निगरानी गतिविधि के साथ एक कसकर तह जस्ता-बाध्यकारी प्रोटीन है; हालांकि, जब ऑक्सीडेटिव तनाव को उजागर, Hsp33 व्यापक गठन परिवर्तन जो अपने सब्सट्रेट बंधन क्षेत्रों३८,३९बेनकाब से गुजरती है । ऑक्सीकरण पर, जस्ता आयन कि दृढ़ता से चार अत्यधिक संरक्षित cysteine अवशेषों सी के लिए बाध्य है-टर्मिनल डोमेन४०जारी की है । दो डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन में यह परिणाम, सी टर्मिनल डोमेन का एक खुलासा, और आसंन linker क्षेत्र४१के एक स्थिरीकरण । सी टर्मिनल और linker क्षेत्रों अत्यधिक लचीला कर रहे है और आंतरिक या आंशिक रूप से परिक्रमा के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । गैर-तनाव की स्थिति में लौटने पर, cysteines कम हो जाता है और कोई विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि के साथ अपने देशी जोड़ राज्य के लिए निगरानी रिटर्न । निगरानी का खुलासा करने की ओर जाता है एक और खुलासा करने के लिए बाध्य ग्राहक प्रोटीन है, जो विहित निगरानी प्रणाली के लिए अपने स्थानांतरण चलाता है, दनाक/जे,३८re । Hsp33's बातचीत साइटों के विश्लेषण से पता चलता है कि Hsp33 अपने आरोप लगाया परिक्रमा क्षेत्रों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लिंकर और एन-टर्मिनल डोमेन पर hydrophobic क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया ग्राहक प्रोटीन को पकड़ने और उनके एकत्रीकरण३८को रोकने का उपयोग करता है, ४२. मुड़े हुए राज्य में, इन क्षेत्रों को जोड़ लिंकर और सी-टर्मिनल डोमेन द्वारा छिपाया जाता है. दिलचस्प है, linker क्षेत्र Hsp33's तह और निष्क्रिय राज्य के एक द्वारपाल के रूप में कार्य करता है, "संवेदन" अपने आसंन सी के तह स्थिति टर्मिनल डोमेन३४। एक बार mutagenesis द्वारा अस्थिर (या तो एक बिंदु उत्परिवर्तन या एक पूर्ण अनुक्रम गड़बड़ी द्वारा), Hsp33 एक constitutively सक्रिय निगरानी की परवाह किए बिना अपने redox-संवेदी redox४३के cysteines राज्य में परिवर्तित हो जाता है ।

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत Hsp33's redox-निर्भर निगरानी गतिविधि की निगरानी, साथ ही साथ सक्रियकरण और ग्राहक प्रोटीन की बाध्यकारी पर मानचित्रण के गठन के परिवर्तन की अनुमति देते हैं । इस पद्धति के अंय निगरानी ग्राहक मांयता मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर निगरानी प्रोटीन प्रोटीन बातचीत अनुसंधान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, हम पूरी तरह से कम और ऑक्सीकरण chaperones कि अंय redox-स्विच प्रोटीन के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान प्रोटीन गतिविधि पर प्रोटीन ऑक्सीकरण की संभावित भूमिकाओं को प्रकट करने के लिए ।

विशेष रूप से, हम एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए इन विट्रो में निगरानी गतिविधि पर नजर रखने और प्रोटीन एकत्रीकरण (रासायनिक या थर्मल प्रेरित) के विभिंन प्रकार के तहत अपने सब्सट्रेट विशिष्टता को परिभाषित प्रकाश कैटरिंग (रास) का उपयोग कर एक से मापा fluorospectrometer४४. एकत्रीकरण के दौरान, ३६० एनएम पर प्रकाश बिखरने तेजी से बढ़ती turbidity के कारण बढ़ जाती है । इस प्रकार, एकत्रीकरण एक समय पर निर्भर तरीके से इस तरंग दैर्ध्य पर नजर रखी जा सकती है । LS प्रोटीन एकत्रीकरण के परीक्षण के लिए एक तेज और संवेदनशील तरीका है और इस प्रकार nanomolar सांद्रता का उपयोग कर ब्याज की एक प्रोटीन की विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि, विभिन्न के तहत प्रोटीन एकत्रीकरण से संबंधित काइनेटिक मापदंडों के लक्षण वर्णन को सक्षम करने शर्तों. इसके अलावा, रास प्रोटोकॉल यहां वर्णित महंगा उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और आसानी से किसी भी प्रयोगशाला में स्थापित किया जा सकता है ।

फिर भी, यह "स्वच्छ" काइनेटिक घटता प्राप्त करने के लिए काफी चुनौतीपूर्ण है और इस तरह के प्रकाश बिखरने प्रयोगों से एक प्रोटीन की काइनेटिक मापदंडों, शोर और हवा के बुलबुले और बड़े समुच्चय द्वारा उत्पन्न outliers की बड़ी संख्या के कारण । इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एक उपंयास चित्रमय उपकरण, Kfits४५, अलग काइनेटिक माप में शोर के स्तर को कम करने के लिए इस्तेमाल किया, विशेष रूप से प्रोटीन एकत्रीकरण काइनेटिक डेटा के लिए सज्जित प्रस्तुत करते हैं । इस सॉफ्टवेयर के परिणामों की एक प्रारंभिक आकलन के लिए प्रारंभिक काइनेटिक मापदंडों प्रदान करता है और उपयोगकर्ता के लिए "साफ" डेटा की बड़ी मात्रा में जल्दी अपनी काइनेटिक संपत्तियों को प्रभावित किए बिना अनुमति देता है । Kfits पायथन में लागू किया गया है और ४५पर खुला स्रोत में उपलब्ध है ।

क्षेत्र में चुनौतीपूर्ण सवालों में से एक chaperones और उनके ग्राहक प्रोटीन और समझ कैसे chaperones के बीच बातचीत साइटों मानचित्रण से संबंधित है की एक विस्तृत श्रृंखला का खुलासा सब्सट्रेट । यह सवाल और जटिल है जब अत्यधिक गतिशील प्रोटीन परिसरों का अध्ययन है जो आंतरिक रूप से chaperones और एकत्रीकरण प्रवण सब्सट्रेट शामिल है । सौभाग्य से, संरचनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री नाटकीय रूप से पिछले दशक में उंनत है और सफलतापूर्वक उपयोगी दृष्टिकोण और उपकरण प्रदान की संरचनात्मक प्लास्टिक और नक्शे प्रोटीन मांयता४६में शामिल अवशेषों का विश्लेषण, ४७ , ४८ , ४९. यहाँ, हम एक ऐसी तकनीक प्रस्तुत करते हैं-हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HDX-MS)-जो प्रोटीन संशोधन या प्रोटीन/Ligand बाइंडिंग३५पर एक संरचनात्मक अनुरूपता में अवशेषों-स्तर परिवर्तन की मैपिंग की अनुमति देता है, ५०,५१,५२,५३,५४,५५. HDX-MS ड्यूटेरियम द्वारा रीढ़ हाइड्रोजन की सतत विनिमय का उपयोग करता है, जो की दर रासायनिक वातावरण, पहुंच, और आबंध और गैर आबंध बांड५६से प्रभावित है । HDX-एमएस इन एक्सचेंज एक deuterated विलायक, आमतौर पर भारी पानी (डी2ओ) का उपयोग कर प्रक्रियाओं, और ड्यूटेरियम विनिमय के लिए हाइड्रोजन के बाद आणविक वजन में परिवर्तन के आधार पर माप की अनुमति देता है । हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज की धीमी दरों से हाइड्रोजन बांड या, बस, steric बाधा है, जो संरचना५७में स्थानीय परिवर्तन को इंगित करता है में भाग लेने से परिणाम कर सकते हैं । ligand बाइंडिंग या पोस्ट-शोधों के संशोधनों पर होने वाले परिवर्तन हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज (HDX) दरों४६,५३में अंतर में आने वाले बाइंडिंग के साथ हाइड्रोजन वातावरण में भी अंतर पैदा कर सकते हैं ।

हम 1 के लिए इस तकनीक को लागू) नक्शा Hsp33 क्षेत्रों जो तेजी से ऑक्सीकरण पर खुलासा, Hsp33 के सक्रियकरण के लिए अग्रणी है, और 2) अपनी पूरी लंबाई के साथ Hsp33 के संभावित बाध्यकारी इंटरफेस को परिभाषित सब्सट्रेट, साइट्रेट सिंथेस (सीएस)३८

इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों में प्रोटीन के redox-निर्भर कार्यों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, इन विट्रो में, विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि और संरचनात्मक परिवर्तन की भूमिका (यदि कोई हो) प्रोटीन समारोह में परिभाषित । इन तरीकों को आसानी से विविध जैविक प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और प्रयोगशाला में लागू ।

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Protocol

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1. पूरी तरह से कम और पूरी तरह से ऑक्सीकरण प्रोटीन की तैयारी

  1. पूरी तरह से कम प्रोटीन की तैयारी
    नोट: यहां, हम एक जस्ता युक्त प्रोटीन की कमी का वर्णन है, और एक ZnCl2 समाधान का उपयोग करने Zn-शामिल, कम प्रोटीन राज्य बहाल । ZnCl2 समाधान बदला जा सकता है या छोड़ दिया । ध्यान दें कि समय और तापमान में कमी की प्रक्रिया प्रोटीन स्थिरता और समारोह पर निर्भर करता है, और इस प्रकार प्रोटीन प्रति विशिष्ट है ।
    1. बर्फ पर प्रोटीन नमूना गल और यह नीचे स्पिन समुच्चय को दूर करने के लिए । 5 मिमी डीटीटी और 20 µ एम ZnCl2 के साथ ३७ ° c पर कम से १.५ ज के लिए नमूना मशीन (अप करने के लिए ७०% प्रोटीन एकाग्रता) ।
      नोट: इस कदम पर तापमान प्रोटीन पर निर्भर है और प्रोटीन स्थिरता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
    2. डीटीटी स्तंभों का उपयोग करके निकालें ।
      नोट: भिन्न-भिंन लवण स्तंभ उपलब्ध हैं । नीचे प्रोटोकॉल विशिष्ट लवण स्तंभों का उपयोग कर प्रक्रिया का वर्णन ( सामग्री की तालिकादेखें) । अंय लवण स्तंभों का उपयोग करने से पहले, हम डीटीटी हटाने और प्रोटीन वसूली की उनकी दक्षता की जांच की सिफारिश, के बाद से कुछ लवण कॉलम आंशिक रूप से ब्याज की प्रोटीन को अवशोषित कर सकते हैं ।
      1. एक पोटेशियम फॉस्फेट (KPi) बफर (४० mM, पीएच ७.५) के साथ कॉलम पूरी तरह से बफर के साथ भरने और बफर बाहर ड्रिप दे द्वारा स्तंभ Equilibrate । इस प्रक्रिया को दोहराएं 2x ।
      2. धीरे से इसे चिमटी के साथ नीचे धकेलने और इसे हटाने के द्वारा कॉलम में सफेद डिस्क फिल्टर निकालें; यह स्तंभ KPi बफ़र से भरा है, जबकि निकालने के लिए सबसे आसान है । KPi बफ़र के साथ स्तंभ फिर से भरना और यह १,००० x g पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
      3. एक साफ ट्यूब में कॉलम स्थानांतरण, प्रोटीन नमूना जोड़ने के लिए धीरे कॉलम के बीच और यह १,००० पर 2 मिनट के लिए एक्स जी केंद्रापसारक । डीटीटी-नि: शुल्क प्रोटीन अब प्रवाह के माध्यम से में है ।
    3. इसकी सांद्रता की जांच करें (जैसे, एक यूवी/विज़ स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग) और २८० एनएम पर अपने अवशोषण उपाय । प्रोटीन एकाग्रता की गणना बियर के कानून का उपयोग कर ।
    4. aliquots में प्रोटीन के नमूनों का आधा वितरण । anaerobic स्थितियों में aliquots मशीन (उदाहरणके लिए, एक anaerobic चैंबर का उपयोग कर) के लिए 20 मिनट ऑक्सीजन का एक पूरा हटाने के लिए । प्लास्टिक की फिल्म के साथ ट्यूबों सील और नमूनों की दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस, प्रोटीन पर निर्भर करता है ।
      नोट: anaerobic चैंबर का इस्तेमाल करने के बजाय, ट्यूब्स को भी आर्गन गैस से ऑक्सीजन निकालने के लिए फ्लैश किया जा सकता है ।
  2. एक पूरी तरह से ऑक्सीकरण प्रोटीन की तैयारी
    नोट: यह पूरी तरह से कम प्रोटीन से ऑक्सीकरण प्रोटीन के नमूने तैयार करने के लिए सिफारिश की है (पहले वर्णित) । यह cysteines के ऑक्सीकरण राज्यों में विविधता कम हो जाएगा । यह विभिन्न ऑक्सीकरण एजेंट का उपयोग करने के लिए संभव है; यहां, हम हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच22) पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं ।
    चेतावनी: अधिक ऑक्सीकरण से बचने के रूप में यह अवांछनीय intramolecular डाइसल्फ़ाइड बांड और cysteine, methionine, tyrosine सहित विभिंन अमीनो एसिड, अपरिवर्तनीय ऑक्सीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और दूसरों ।
    1. शेष प्रोटीन के नमूने के लिए, 5 मिमी एच22 (ताजा पतला) जोड़ें और ४० डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए यह गर्मी जबकि मिलाते हुए ।
      नोट: इस कदम पर तापमान प्रोटीन पर निर्भर है और प्रोटीन स्थिरता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
    2. स्तंभ को पूरी तरह से बफ़र के साथ भरकर और बफ़र को बाहर ड्रिप दे कर KPi बफ़र (४० mM, pH ७.५) के साथ Equilibrate । इस प्रक्रिया को दोहराएं 2x ।
    3. धीरे से इसे चिमटी के साथ नीचे धकेलने और इसे हटाने के द्वारा कॉलम में सफेद डिस्क फिल्टर निकालें; यह स्तंभ KPi बफ़र से भरा है, जबकि निकालने के लिए सबसे आसान है ।
    4. KPi बफ़र के साथ स्तंभ फिर से भरना और यह १,००० x g पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    5. एक साफ ट्यूब में कॉलम स्थानांतरण, ऑक्सीकरण प्रोटीन के नमूने स्तंभ के बीच में धीरे जोड़ें और यह 2 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक; ऑक्सीकरण प्रोटीन के माध्यम से प्रवाह में अब है ।
    6. कदम 1.2.5 में के रूप में प्रोटीन सांद्रता की जांच करें, aliquots में ऑक्सीकरण प्रोटीन विभाजित है, और उंहें-20 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस, प्रोटीन पर निर्भर दुकान ।

2. लाइट कैटरिंग एकत्रीकरण परख

नोट: इस परख में सभी सांद्रता निगरानी-और सब्सट्रेट-विशिष्ट हैं, और नपेed किया जाना चाहिए । सभी बफ़र्स होना चाहिए ०.२२ µm-फ़िल्टर किया गया, के रूप में यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि बफ़र्स किसी भी कणों या हवा के बुलबुले से मुक्त कर रहे हैं और cuvettes साफ और धूल से मुक्त हैं. यह क्वार्ट्ज cuvette में रखा एक सरगर्मी का उपयोग करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । अवांछनीय हवा बुलबुले के उत्पादन के बिना पूरे समाधान का एक कुशल मिश्रण सुनिश्चित करने के क्रम में विभिन्न सरगर्मी आकार और आकार की जाँच करें । इसके अलावा, प्रयोगशालाओं और सुविधाओं में विभिन्न flouorospectrometers उपलब्ध हैं । यहाँ, एक विशिष्ट fluorospectrometer ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया गया था. विभिन्न उपकरणों के एक विविध संवेदनशीलता, माप की गति, और पारखी मापदंडों है । इसलिए, सटीक माप पैरामीटर (जैसे, उत्सर्जन और उत्तेजना बैंडविड्थ, संवेदनशीलता, और दूसरों) एक ज्ञात एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन और उसकी इसी शर्तों का उपयोग कर अनुकूलित किया जाना चाहिए । nanomolar सांद्रता में प्रारंभिक सब्सट्रेट के रूप में साइट्रेट सिंथेस (सीएस) और/या luciferase का उपयोग करने की सिफारिश की है ।

  1. रासायनिक एकत्रीकरण परख
    1. ४० mM HEPES (पीएच ७.५) और ४.५ मीटर GdnCl में रातोंरात 12 µ एम सीएस की मशीनिंग द्वारा विकृत सब्सट्रेट तैयार करें । आदेश में पीएच को बचाने के लिए, ४० mM HEPES (पीएच ७.५) में GdnCl भंग ।
    2. fluorospectrometer सॉफ्टवेयर खोलें और समय पाठ्यक्रम मापके लिए जाना । करने के लिए पैरामीटर सेट करें: तापमान: 25 ° c; λem: ३६०; Em बैंडविड्थ: 5 एनएम; λex: ३६०; पूर्व बैंडविड्थ: २.५ एनएम; और डेटा अंतराल: ०.५ s ।
    3. एक क्वार्ट्ज cuvette करने के लिए ४० mM HEPES के १,६०० µ एल जोड़कर नमूना तैयार करें । नमूना धारक में cuvette डालें और नमूना वांछित तापमान तक पहुँचने ।
    4. ६०० rpm को सरगर्मी सेट और माप शुरू जब तक एक आधार रेखा की स्थापना की है । पूरे माप के लिए पर सरगर्मी रखें ।
    5. एक निगरानी के अभाव में सीएस एकत्रीकरण को मापने के लिए, माप में १२० s पर, (धीरे, लेकिन जल्दी से) विकृत सीएस के 10 µ एल (७५ एनएम के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें । १,२०० s के लिए माप जारी रखें ।
    6. Hsp33 की उपस्थिति में सीएस एकत्रीकरण को मापने के लिए, माप में ६० s पर, Hsp33 (३०० एनएम के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें । एक अतिरिक्त ६० एस के बाद, विकृत सीएस (७५ एनएम के अंतिम एकाग्रता) के 10 µ एल जोड़ें । १,२०० s के लिए माप जारी रखें ।
      नोट: जब सब्सट्रेट या निगरानी जोड़ने, बुलबुले की प्रविष्टि से बचने के लिए, एक 10-µ l पिपेट का उपयोग करें.
  2. थर्मल एकत्रीकरण परख
    नोट: थर्मल एकत्रीकरण परख के लिए तापमान प्रोटीन स्थिरता पर निर्भर करता है और स्वतंत्र रूप से प्रत्येक प्रोटीन के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
    1. fluorospectrometer सॉफ्टवेयर खोलें और समय पाठ्यक्रम मापके लिए जाना । निम्नानुसार पैरामीटर सेट करें: तापमान: ४३ ° c; λem: ३६०; उत्सर्जन बैंडविड्थ: 5 एनएम; λex: ३६०; उत्तेजना बैंडविड्थ: २.५ एनएम; और डेटा अंतराल: ०.५ s ।
    2. एक क्वार्ट्ज cuvette करने के लिए पूर्व गरम ४० mM HEPES के १,६०० µ एल जोड़कर नमूना तैयार करें । नमूना धारक में cuvette डालें और नमूना ४३ ° c तक पहुंचने दें ।
    3. ६०० rpm को सरगर्मी सेट और माप शुरू जब तक एक आधार रेखा की स्थापना की है । पूरे माप के लिए पर सरगर्मी रखें ।
    4. एक निगरानी के अभाव में सीएस एकत्रीकरण को मापने के लिए, माप में १२० s पर, धीरे सीएस (१२५ एनएम के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और १,२०० एस के लिए मापने जारी है ।
    5. Hsp33 की उपस्थिति में सीएस एकत्रीकरण को मापने के लिए, माप में ६० s पर, Hsp33 (६०० एनएम के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें । एक अतिरिक्त ६० एस के बाद, सीएस जोड़ें (१२५ एनएम के अंतिम एकाग्रता) । १,२०० s के लिए माप जारी रखें ।
      नोट: जब सब्सट्रेट या निगरानी जोड़ने, बुलबुले के सम्मिलन से बचें.
  3. डेटा विश्लेषण और Kfits द्वारा शोर हटाने
    नोट: Kfits Kfits के उपयोग पर उपलब्ध है पहले रिमों एट अल में वर्णित किया गया है । ४५
    1. डेटा फ़ाइल अपलोड करें ।
      नोट: इनपुट एक शाब्दिक कॉमा-सेपरेटेड या टैब-सीमांकित स्वरूप में प्रकाश बिखरने माप से कच्चे परिणाम है ।
    2. कोई भी शोर निकालने के लिए, विश्लेषण पैरामीटर चुनें. स्वत: सबसे अच्छा मॉडल का प्रयोग करें (अनुशंसित), निशान शोर हमेशा संकेत ध्वज से ऊपर है
    3. हरे और लाल समायोज्य लाइनों का उपयोग कर स्पष्ट outliers को मैन्युअल रूप से निकालें; यह कदम हरे रंग की रेखा के ऊपर और लाल रेखा से नीचे शोर फिल्टर होगा ।
    4. आधार रेखा और फ़िट वक्र सेट करें । नॉइज़ थ्रेशोल्ड लागू करने के बाद, संसाधित डेटा डाउनलोड करें ।

3. हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. बफ़र्स और प्रोटीन नमूने (Hsp33 और Hsp33-सीएस परिसर) की तैयारी
    1. एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन के नमूनों को पतला 1 मिलीग्राम/एमएल में 25 mM Tris-HCl बफर पीएच ७.५ में और उंहें १.५-एमएल शीशियों के लिए स्थानांतरण ।
    2. 1:1.5 पर ४३ डिग्री सेल्सियस पर सीएस के साथ Hsp33 के साथ मशीनिंग द्वारा प्रोटीन-सब्सट्रेट जटिल नमूने तैयार करें ।
      1. किसी भी तेजी से एकत्रीकरण से बचने और Hsp33 और थर्मल में सामने आया सीएस के बीच एक उपयोगी बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए एक कदम वार तरीके से सीएस जोड़ें.
      2. (यानी, हर बार अंतिम मात्रा का एक चौथाई जोड़ने के लिए) और Hsp33 द्वारा सीएस संरक्षण की अनुमति देने के लिए हर अलावा के बाद 15 मिनट के लिए नमूने की मशीन कम चार चरणों का उपयोग करें ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर १६,००० x g पर एक 30-ंयूनतम केंद्रापसारक का उपयोग कर किसी भी समुच्चय निकालें ।
      नोट: नए प्रोटीन सब्सट्रेट परिसरों ताजा तैयार किया जाना चाहिए । सब्सट्रेट इसके अलावा धीरे से बनाया जाना चाहिए; अंयथा, एकत्रीकरण हो जाएगा । तापमान, सब्सट्रेट, और सब्सट्रेट सांद्रता प्रोटीन-विशिष्ट होते हैं ।
    4. कोई बफ़र H (25 mm Tris-HCl, pH ७.५) तैयार करें, जो deuteration नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, और एक बफ़र D (25 mM Tris-DCl, pH ७.०९), जो deuteration बफ़र है । इसके अलावा एक ताजा शमन बफर (१५० mM TCEP, 3 एम GdnCl, ०.१% फार्मिक एसिड) तैयार करते हैं ।
      नोट: शमन बफर पेप्सिन पाचन के बाद अपनी अधिक से अधिक अनुक्रम कवरेज प्राप्त करने के लिए ब्याज की प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
    5. सभी बफ़र्स और नमूनों को शीशियों में स्थानांतरित करें, और उन्हें उचित ट्रे में रखें. 25 डिग्री सेल्सियस (ट्रे 25 डिग्री सेल्सियस) पर बफर एच और डी पकड़ो; दूसरी ओर, नमूने पकड़ और 0-2 ° c (ट्रे 0 ° c) पर शमन बफर । १५० में नमूने प्लेस-µ एल ग्लास आवेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) पहले, और फिर उंहें शीशियों में स्थानांतरण ।
  2. साधन की तैयारी
    नोट: जन स्पेक्ट्रोमीटर दो साथ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ आता है: एक पंप नियंत्रण, और अंय जन स्पेक्ट्रोमीटर नियंत्रण ( सामग्री की तालिकाको देखें) । अगले चरणों इन दो सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर वर्णित किया जाएगा ।
    1. मैन्युअल रूप से सभी कूलिंग इकाइयां चालू करें । एक बार सभी कूलिंग सिस्टम अपने लक्ष्य तापमान तक पहुंचने, मैंयुअल रूप से दोनों उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) पर स्विच और पंप लदान ।
      नोट: हमारे मामले में, इन दो ठंडा स्नान और एक ठंडा बॉक्स से मिलकर बनता है (जो जाल और विश्लेषणात्मक कॉलम शामिल हैं) । एक ठंडा इकाई 0 डिग्री सेल्सियस पर ट्रे ठंडा, जबकि अंय 25 डिग्री सेल्सियस पर ट्रे रखता है; कूलिंग बॉक्स का तापमान 1-2 डिग्री सेल्सियस है ।
    2. सॉफ्टवेयर जो नियंत्रण दोनों पंपों, साथ ही सॉफ्टवेयर जो जन स्पेक्ट्रोमीटर नियंत्रण खोलें; सुनिश्चित करें कि MS स्टैंडबायपर है ।
    3. एमएस स्रोत से HPLC आउटलेट वाल्व डिस्कनेक्ट करें और एक "ट्रिपल क्लीनर" समाधान (1% फार्मिक एसिड के साथ पहले प्रणाली धो, ३३% acetonitrile, ३३% isopropanol, ३३% मेथनॉल), तो बफर बी के साथ (८०% acetonitrile, ०.१% फार्मिक एसिड), और अंत में एक बफर के साथ (०.१% फार्मिक एसिड, पीएच २.२५), और फिर प्रणाली में पेप्सिन स्तंभ डालें । बफ़र्स बदलते हैं, तो आगे बढ़ने से पहले दोनों पंपों को पर्ज करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. यह सुनिश्चित करें कि दोनों पंपों के लिए प्रवाह-दर ०.१ मिलीलीटर है और दबाव स्थिर है ।
    5. एक स्थिर प्रवाह और स्थिर दबाव के साथ प्रणाली धोने के बाद, एमएस स्रोत में HPLC आउटलेट डालें और एमएस पर बारी ।
  3. मास स्पेक्ट्रोमीटर पैरामीटर्स
    1. १७५ डिग्री सेल्सियस पर electrospray ionization (ईएसआई) के लिए पेप्टाइड ionization सेट, म्यान गैस के प्रवाह में 17, aux गैस पर चमक 2, और स्प्रे वोल्टेज पर ४.५ केवी (अनुपूरक आंकड़ा 1).
    2. पैरामीटर के रूप में गैर-deuterated नमूने के लिए निम्नानुसार सेट करें ।
      1. पैरामीटर सेट करें: स्कैन श्रेणी m/z करने के लिए ३००-१५००; ७०,००० करने के लिए संकल्प; स्वत: प्राप्त नियंत्रण लक्ष्य (AGC) to 106; और अधिकतम इंजेक्शन समय (आईटी) पर १०० ms.
        नोट: 5 सबसे तीव्र आयनों के बीच आरोप राज्यों के साथ + 2 और 6 (उनकी तीव्रता से अधिक १.३ x 104) और एक गतिशील विंडो में 30 अलग-थलग हो जाएगा.
      2. सामान्य टकराव ऊर्जा (NCE) 28 के बराबर के साथ बहु-टक्कर सेल में उच्च ऊर्जा collisionल पृथक्करण (HCD) द्वारा आयन विखंडन प्रदर्शन । ३५,००० के एक संकल्प में मिलकर एमएस द्वारा टुकड़ा आयनों का पता लगाने, 105के AGC लक्ष्य, ६० MS में अधिकतम यह, और २.० m की एक अलगाव विंडो/
    3. deuterated नमूने के लिए, केवल १४०,००० के एक उच्च संकल्प के साथ और अंयथा इसी तरह के मापदंडों के साथ1 MS रोजगार ।
  4. प्रयोग चल
    1. ट्रे को निंन तरीके से सेट करें ।
      1. ट्रे 25 डिग्री सेल्सियस में बफर एच और डी प्लेस, तो नमूने और 0 ° c ट्रे में शमन बफर जगह है ।
      2. जगह एक्स खाली शीशियों, दोनों ट्रे में गठबंधन, जहां एक्स नमूनों की संख्या = समय अंक की संख्या x ।
        नोट: 25 ° c ट्रे में, खाली शीशियों प्रतिक्रिया शीशियों के रूप में सेवा, और ट्रे 0 डिग्री सेल्सियस में, वे शमन शीशियों के रूप में सेवा करते हैं ।
      3. खाली शीशियों में से प्रत्येक एक खाली गिलास डालने शामिल हैं; छोड़ें और बदलें ने कहा कि प्रयोगों के बीच सम्मिलित करें.
        नोट: सबसे कुशल और कम समय लेने वाले रास्ते में HDX प्रयोग चलाने के लिए, एक सॉफ्टवेयर है जो नमूने एक साथ चलाने के लिए अनुमति देता है (अनुपूरक चित्रा 2) का इस्तेमाल किया गया था । अगले कदम इस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वर्णित किया जाएगा ।
    2. सॉफ़्टवेयर खोलें । निंन कार्य करने के लिए प्रोग्राम पैरामीटर्स सेट करें ।
      1. प्रत्येक नमूना मशीन (5 µ एल) बफर डी के ४५ µ एल के साथ कई मिनट के लिए, समय चयनित अंक के आधार पर (जैसे, 1, 3, 18, ४०, और १०० मिनट) 25 डिग्री सेल्सियस पर । बजाय बफर एच के ४५ µ एल के साथ गैर deuterated नमूना मशीन ।
      2. तुरंत मशीन के बाद, मिश्रण ५० बर्फ के ५० µ एल में deuterated प्रोटीन के µ एल ठंड शमन बफर और उंहें एक स्थिर पेप्सिन कॉलम में सुई (20 मिमी लंबाई में, व्यास में २.० मिमी) ।
      3. Elute पेप्सिन कॉलम से किसी भी पेप्टाइड्स पूर्व कॉलम में यह एक बफर के साथ धोने के द्वारा 6 मिनट के लिए ५० की दर से µ l/0 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा बॉक्स में एक बफर रखें ।
      4. Elute C18 विश्लेषणात्मक स्तंभ (C18 स्तंभ, में पूर्व-स्तंभ से बाहर पेप्टाइड्स १३० Å, १.७ µm, २.१ मिमी x ५० मिमी, 0 डिग्री सेल्सियस पर रखा) और acetonitrile के एक रैखिक ढाल पर लागू करके उन्हें अलग १०० µ l/acetonitrile के रूप में acetonitrile १००% का उपयोग करते हुए ग्रेडिएंट चलाएँ बफ़र B : 7 मिनट में 2%, 7 मिनट में 10-30%, २.५ मिनट में 30-90%, १.५ मिनट पर ९०%, रैपिड ढाल पर 1 मिनट के लिए ९०-8%, और अंत में 2% पर 4 मिनट के लिए कॉलम equilibrate ।
    3. एक चल रहे अनुक्रम बनाएं (अनुपूरक चित्रा 2देखें): सभी समय अंक, नमूना नाम, और ट्रे में स्थानों, साथ ही बफर नाम और स्थानों दर्ज करें ।
      नोट: सॉफ्टवेयर एक बार में कई नमूने चलाता है कि एक कार्यक्रम में सभी अलग चल समय के संरेखण की अनुमति देता है, कुशलता से चल रहे समय कम.
  5. डेटा विश्लेषण
    नोट: हम डेटा विश्लेषण की प्रक्रिया में कई सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ काम, Proteome हैपी और MaxQuant (मुफ्त सॉफ्टवेयर) सहित पेप्टाइड पहचान और अनुक्रम कवरेज के विश्लेषण के लिए, साथ ही HDX कार्यक्षेत्र, एक मुफ्त सॉफ्टवेयर है कि प्रोटीन में ड्यूटेरियम शामिल करने के विश्लेषण की अनुमति देता है, और प्रयोगों के विभिंन सेट के बीच HDX दरों की तुलना । अगले कदम इन सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर वर्णित किया जाएगा ।
    1. सॉफ्टवेयर (अनुपूरक आंकड़ा 3) के माध्यम से गैर deuterated नियंत्रण नमूने चलाकर नमूना के पेप्टाइड कवरेज का विश्लेषण करें । निंन पैरामीटर्स का उपयोग कर सॉफ़्टवेयर सेट करें ।
      1. नो-एंजाइम (unSequest) सट के साथ एचटी विधि का प्रयोग करें । 7 पीपीएम के एक बड़े पैमाने पर सहिष्णुता और प्रणेता आयन और टुकड़ा के लिए ०.५ दा के साथ 4-144 अमीनो एसिड की पेप्टाइड्स के लिए खोजें । एक गतिशील methionine ऑक्सीकरण के लिए अनुमति दें ।
      2. प्रोटीन के लिए एक डाटाबेस बनाएं, जिसके माध्यम से सॉफ्टवेयर पेप्टाइड कवरेज का निर्धारण कर सकते हैं । पहचाने गए पेप्टाइड्स में टेक्स्ट फ़ॉर्मेट निर्यात करें ।
    2. विश्लेषण deuterated HDX कार्यक्षेत्र मुफ्त सॉफ्टवेयर५८का उपयोग कर परिणाम ।
      1. प्रोटीन के संपादक को खोलें और प्रोटीन अनुक्रम और पेप्टाइड कवरेज फ़ाइल डालने से प्रोटीन को परिभाषित ।
      2. इसके बाद, सेटअप प्रयोग विज़ार्ड संपादक खोलें और अनुरोधित सभी इनपुट्स दर्ज करें ।
        नोट: प्रोग्राम नमूनों की संख्या, समय बिंदुओं की संख्या, प्रतिकृतियों की संख्या, बफ़र्स का पीएच मान, और तापमान की आवश्यकता है ।
      3. अंत में, इनपुट मास स्पेक्ट्रोमीटर उपयोग के बारे में पैरामीटर, जिसके बाद प्रोग्राम का पता लगाया पेप्टाइड्स की एक सूची जनरेट करता है ।
        नोट: सॉफ्टवेयर का पता लगाता है "HDX" पेप्टाइड्स, आइसोटोप समूहों का निरीक्षण, और नमूनों में deuteration का एक स्पष्ट दृश्य प्रदर्शित करता है.
  6. डेटा प्रस्तुति
    1. पयमोल सॉफ्टवेयर या किसी भी अन्य दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संरचना पर एक तरजीही deuteration के साथ क्षेत्रों लेबल.
    2. B-कारक मानों के बजाय ड्यूटेरियम के स्तर का परिचय दें ।
      नोट: एक बुनियादी ट्यूटोरियल https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners में पाया जा सकता है ।

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Representative Results

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प्रस्तुत दो तरीके यह काइनेटिक गतिविधि और एक निगरानी और उसके सब्सट्रेट के बीच प्रोटीन बातचीत की गतिशीलता का पालन करने के लिए संभव बनाते हैं । इसके अलावा, कमी-ऑक्सीकरण प्रोटोकॉल एक पूरी तरह से कम और पूरी तरह से ऑक्सीकरण निगरानी की तैयारी की अनुमति देता है, एक और अधिक में redox-निर्भर परिक्रमा chaperones के सक्रियण तंत्र की गहराई से समझ दे रही है ।

सबसे पहले, हम निगरानी के redox-निर्भर गतिविधि की जांच करने के क्रम में प्रकाश बिखरने का इस्तेमाल किया । प्रकाश बिखरने एक ऑक्सीकरण (सक्रिय) या कम (निष्क्रिय) निगरानी (चित्रा 1) की उपस्थिति में एक रासायनिक और थर्मल विकृत सीएस प्रोटीन पर प्रदर्शन किया गया था । रासायनिक विकार प्रतिकूल बफर परिस्थितियों में एक पूरी तरह से denaturized प्रोटीन का खुलासा द्वारा प्रेरित एक तेजी से सीएस एकत्रीकरण की ओर जाता है । दूसरी ओर, मूल रूप से तह सब्सट्रेट के एक अपेक्षाकृत धीमी खुलासा से थर्मल प्रेरित एकत्रीकरण परिणाम है । इसलिए, एकत्रीकरण प्रक्रियाओं के इन विभिंन प्रकार उनके काइनेटिक मापदंडों में बदलती हैं । इसके अलावा, विभिन्न chaperones अलग एकत्रीकरण मोड में एक ही सब्सट्रेट के एकत्रीकरण को रोकने के लिए उनकी क्षमता में भिन्न हो सकते हैं.

विकार के दोनों रूपों में, 1:4 (सीएस: Hsp33) के एक दाढ़ अनुपात में ऑक्सीकरण Hsp33 के अलावा पूरी तरह से एकत्रीकरण समाप्त हो गया, नगण्य मूल्यों के लिए ३६० एनएम रीडिंग कम । एक कम Hsp33 की उपस्थिति, दूसरी ओर, सीएस स्थिरता पर कोई प्रभाव नहीं था और एक निगरानी के अभाव में पाया एक के समान एक एकत्रीकरण वक्र दिया (चित्रा 1). परिणामों का विश्लेषण और पृष्ठभूमि शोर से साफ Kfitsका उपयोग कर रहे थे, के रूप में योजनाबद्ध रूप से 2 चित्रामें वर्णित है ।

HDX-एमएस तकनीक की रूपरेखा ड्यूटेरियम ऑक्साइड के साथ निगरानी की मशीन के साथ शुरू होता है, शमन और पाचन द्वारा पीछा किया, और अंत में एमएस विश्लेषण और हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज की रूपरेखा (चित्रा 3) । HDX-MS के दौरान, निगरानी ट्रे पर 25 डिग्री सेल्सियस में एक डी2ओ-बफर युक्त में किया गया था । नमूना हैंडलिंग रोबोट प्रणाली द्वारा नियंत्रित एक विशिष्ट मशीन समय के बाद, प्रोटीन समाधान शमन समाधान करने के लिए स्थानांतरित किया गया था, अम्लीय और denaturing, ट्रे पर 0 डिग्री सेल्सियस पर. कम पीएच और कम तापमान हाइड्रोजन एक्सचेंज धीमा कर देती है और हाइड्रोजन के बीच सभी के deuteration के स्तर को बरकरार रखता है, जबकि denaturing रासायनिक प्रोटीन करेंगी, इसे सक्षम करने के लिए ठीक से पचा । रोबोट प्रणाली 0 डिग्री सेल्सियस से ठंडा बॉक्स जहां यह ऑनलाइन पेप्सिन पाचन कॉलम में बहती करने के लिए ट्रे से नमूना स्थानांतरित करता है । तुरंत प्रोटीन पाचन के बाद, पेप्टाइड्स और तेज विनिमेय डी2ओ (मुख्य रूप से पक्ष श्रृंखला परमाणुओं पर स्थित) को हटाने के लिए C18-जाल कॉलम के लिए आगे बढ़ना है और फिर C18 कॉलम का उपयोग कर अलग कर रहे है और द्रव्यमान का उपयोग कर विश्लेषण स्पेक्ट्रोमेट्री. नमूना प्रवाह एक दो वाल्व प्रणाली है, जो 1) पेप्सिन और C18 स्तंभ बफ़र्स के जुदाई के लिए कार्बनिक सॉल्वैंट्स द्वारा पेप्सिन की निष्क्रियता को रोकने के लिए सुनिश्चित करता है द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और 2) पेप्टाइड्स के छोटे लवण तेजी से दूर करने के लिए सक्षम बनाता है विनिमेय डी2ओ अणुओं और लवण (चित्रा 4) ।

गणना विश्लेषण के बाद, हम प्रत्येक पेप्टाइड के लिए एक deuteration प्रोफ़ाइल प्राप्त करते हैं, डी2ओ में मशीन समय के एक समारोह के रूप में बड़े पैमाने पर एक परिवर्तन दिखा । HDX कार्यक्षेत्र सॉफ्टवेयर प्रयोगात्मक की तुलना में दोहराने की अनुमति देता है क्रम में प्रत्येक शर्त के सांख्यिकीय विश्लेषण (जैसे, एक असीम रूप में एक सक्रिय निगरानी बनाने के लिए) । अगले कदम अलग नमूनों के बीच deuteration घटता की तुलना है; उदाहरण के लिए, एक बाध्य निगरानी और एक असीम निगरानी । विभिंन निगरानी राज्यों के इन तुलना संरचनात्मक perturbations कि सब्सट्रेट बाध्यकारी साथ प्रकट कर सकते हैं । वे अवशेष जो बाउंड अवस्था में धीमे आदान-प्रदान को दर्शाते हैं, बाध्यकारी साझेदार के साथ इंटरैक्ट करते हैं । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि कम हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम विनिमय दरों में भी एक विशिष्ट क्षेत्र के एक मोड़ से संकेत कर सकते है सब्सट्रेट के साथ वास्तविक प्रत्यक्ष संपर्क के बिना बाध्यकारी (चित्रा 5) । HDX कार्यक्षेत्र सॉफ्टवेयर पूरे प्रोटीन के कवरेज पर एक मानक त्रुटि के साथ deuteration दिखाकर "गड़बड़ी" दृश्य में परिणामों की परीक्षा की अनुमति देता है ।

इस मामले में, HDX-MS अपने सब्सट्रेट सीएस करने के लिए बाध्य और असीम निगरानी Hsp33 के बीच deuteration पैटर्न की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. परिणाम निगरानी (चित्रा 5बी) के सी-टर्मिनल redox स्विच डोमेन के भीतर एक ग्राहक-संपर्क साइट प्रकट करते हैं । जबकि कम, Hsp33 एक पूरी तरह से आदेश दिया संरचना है, जहां संपर्क साइटों दफन कर रहे हैं । Hsp33 अपनी संरचना खो देता है और कार्यात्मक हो जाता है जब यह होश ऑक्सीडेटिव तनाव; इसलिए, हम दोनों बंधे और असीम शर्तों (चित्रा 5सी) के तहत कम और ऑक्सीकरण Hsp33 की तुलना में । परिणाम बताते हैं कि कम Hsp33, चाहे बाउंड या अनबाउंड, समान पेप्टाइड घटता का उत्पादन, ऑक्सीकरण Hsp33 एक महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित करता है. ऑक्सीकरण Hsp33 नमूने एक allosteric बाधा का संकेत सीमित प्रोटीन के विशिष्ट क्षेत्रों के साथ, बाध्य और असीम निगरानी के बीच एक 30% deuteration अंतर दिखा । एन टर्मिनल और thermobile linker क्षेत्रों से अतिरिक्त पेप्टाइड्स का विश्लेषण अनुपूरक चित्रा 3में दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1 . प्रकाश बिखरने से एकत्रीकरण विश्लेषण । रासायनिक और थर्मल रूप से विकृत सीएस का एकत्रीकरण ऑक्सीकरण Hsp33 (लाल), कम Hsp33 (नीला), या निगरानी (काला) के अभाव में की उपस्थिति में निगरानी की गई । ३६० एनएम पर एक प्रकाश बिखरने १,२०० एस के लिए निगरानी की गई थी () रासायनिक एकत्रीकरण के दौरान, एक निगरानी के अभाव में या एक कम Hsp33 की उपस्थिति में, सीएस तेजी से एकत्रित, एक पठार लगभग ३०० s माप में पहुंच रहा है । () थर्मल एकत्रीकरण के दौरान, एक निगरानी के अभाव में या एक घटे Hsp33 की उपस्थिति में सीएस समग्र रूप से. दोनों परख में, ऑक्सीकरण Hsp33 की उपस्थिति पूरी तरह से समाप्त एकत्रीकरण, के रूप में नगण्य ३६०-एनएम रीडिंग द्वारा प्रदर्शन किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . शोर और Kfits का उपयोग कर डेटा विश्लेषण को हटाने. यह पैनल एक Kfits उपकरण द्वारा डेटा विश्लेषण और शोर हटाने सारांश स्कीमा दिखाता है, के रूप में पाठ में वर्णित है और रिमों एट अल । ४५. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3 . HDX-एमएस पद्धति का कार्यप्रवाह । HDX-MS हाइड्रोजन के बीच के रासायनिक वातावरण का निर्धारण करने के लिए deuterated सॉल्वैंट्स को रोजगार, समान रूप से प्रोटीन की रीढ़ के साथ वितरित । ब्याज की प्रोटीन विशिष्ट समय अवधि के लिए अपने मूल रूप में एक deuterating बफर में मशीन है, तो हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम विनिमय एक कम तापमान पर अंलीय स्थितियों से बुझती है । प्रोटीन अम्लीय स्थितियों, जैसे पेप्सिन के तहत स्थिर एंजाइम द्वारा पचता है । इसके बाद, पेप्टाइड्स और एक कम समय में एक वापस विनिमय से बचने के लिए अलग किया जाता है । अंत में, पेप्टाइड्स एक मास स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं और ड्यूटेरियम एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, उदाहरण के लिए HDX कार्यक्षेत्र मुफ्त सॉफ्टवेयर५८द्वारा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. पूरी तरह से स्वचालित HDX-एमएस प्रणाली के घटक। () HDX के इस योजनाबद्ध आरेख एमएस प्रणाली के सभी भागों का प्रतिनिधित्व करता है: लोडिंग पंप और HPLC पंप नियंत्रण बफर प्रवाह और प्रणाली के भीतर नमूना हस्तांतरण । रोबोटिक प्रणाली में दो सिरिंज और ट्रे जो deuterated नमूना तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है और ठंडा बॉक्स (LC कम्पार्टमेंट) के इनपुट वाल्व के माध्यम से ऑन लाइन पाचन कॉलम को प्रोटीन हस्तांतरण होता है । फिर, पचा पेप्टाइड्स C18 जाल और जुदाई कॉलम, बाद में अलग करने के लिए निर्देशित कर रहे हैं, और जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए निर्देशित किया । () यह पैनल वास्तविक HDX सिस्टम सेटअप दिखाता है क्योंकि यह लैब में बनाया गया था । () इस पैनल ऑनलाइन पाचन और पेप्टाइड जुदाई द्रव विंयास की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति से पता चलता है । पाचन और जुदाई प्रणालियों एक वाल्व कि लोड और सुई मोड के बीच बंद किया जा सकता है । पहले वाल्व (बाईं ओर) इंजेक्शन बंदरगाह से जुड़ा है और लोड हो रहा है पंप द्वारा नियंत्रित, पेप्सिन कॉलम में नमूने निर्देशन किसी भी कार्बनिक विलायक कि पेप्सिन राल नुकसान कर सकते है बिना अंलीय बफर का उपयोग कर । नमूना जाल कॉलम में सही वाल्व को हस्तांतरित करने के लिए ड्यूटेरियम के अवशेषों को दूर करने के साथ ही तेजी से विमर्श किया deuterated परमाणुओं (मुख्य रूप से पक्ष श्रृंखला के) । जाल कॉलम में 1-2 मिनट के एक संक्षिप्त धोने के बाद, वाल्व लोड करने के लिए अपने मोड में परिवर्तन और नमूना acetonitrile की बढ़ती सांद्रता के साथ HPLC पंप का उपयोग C18 जुदाई कॉलम में धोया जाता है । नमूना जन विश्लेषण के लिए जन स्पेक्ट्रोमीटर को सौंप दिया है । ट्यूबों की लंबाई चिह्नित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . HDX-एमएस परिणाम । () परिणाम प्रोटीन टुकड़ा प्रति समय के साथ एक deuteration प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, HDX कार्यक्षेत्र सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पंन । प्रत्येक ग्राफ एक प्रोटीन नमूना दिखाता है, या तो ऑक्सीकरण या कम है, और बंधे और असीम नमूनों के बीच तुलना करता है । यहां दर्शाए गए पेप्टाइड अंशों को linker क्षेत्र में पाए गए पेप्टाइड YVVITITPSEG और सी-टर्मिनस में पाए गए पेप्टाइड LQVMPAQNAQQDDFD हैं । () अंतिम परिणाम, बंधे और असीम परिसरों के बीच deuteration अंतर के रूप में प्रस्तुत, एमिनो एसिड प्रति गड़बड़ी दिखाते हैं । () Hsp33 निगरानी के एक संरचनात्मक मॉडल लिंकर और सी-टर्मिनल अस्थिर क्षेत्रों भर में deuteration से अधिक अंतर से पता चलता है । इस पैनल पयमोल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बनाया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1 । कार्यक्रम ऑपरेटिंग मास स्पेक्ट्रोमीटर के इंटरफेस । कार्यक्रम का अनुकूलन और HDX प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया मास स्पेक्ट्रोमीटर विधि मापदंडों को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विधि पैरामीटर (बाएँ फलक में) विधि में सहेजा जा सकता है, ऐसी है कि अन्य प्रोग्राम्स द्वारा पहचाना गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक आंकड़ा 2। यह आंकड़ा सॉफ्टवेयर है जो रोबोट नमूना सौंपने प्रणाली और एमएस-नियंत्रण रेखा प्रणाली के एक एकीकरण मंच के रूप में कार्य करता है के एक स्क्रीनशॉट से पता चलता है । सॉफ्टवेयर HDX प्रयोग के निर्धारण के द्वारा चल रहे समय का अनुकूलन, deuterated बफर में परिभाषित मशीन समय (नीले तीर) के बाद । उदाहरण के लिए, इसके बाद के संस्करण Hsp33 संस्करण STIL के दो प्रतिकृति विश्लेषण के 17 रन का एक चित्र है, अलग समय के लिए एक deuterated बफर में मशीन, 0-100 मिनट से लेकर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Supplementary Figure 3
अनुपूरक आंकड़ा 3। यह आंकड़ा विभिंन Hsp33 वेरिएंट से कई Hsp33 पेप्टाइड्स के ड्यूटेरियम के एक विश्लेषण, PGBD और REV३४नाम से पता चलता है । भूखंडों में Hsp33 में एक ही क्षेत्र के ड्यूटेरियम में परिवर्तन का प्रदर्शन असीम (लाल) और बंधे (नीला) राज्यों । एन-टर्मिनल क्षेत्र से पेप्टाइड्स HDX दरों में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाने के लिए, जबकि linker क्षेत्र से टुकड़े HDX दरों में एक उल्लेखनीय कमी सब्सट्रेट, साइट्रेट सिंथेस के साथ बातचीत पर दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इस पत्र में, हम redox-निर्भर निगरानी गतिविधि और एक ग्राहक प्रोटीन के बंधन पर संरचनात्मक परिवर्तन के लक्षण वर्णन के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रदान की है । इन पूरक के तरीके के लिए संभावित निगरानी-सब्सट्रेट परिसरों को परिभाषित करने और संभावित संपर्क साइटों का विश्लेषण कर रहे हैं ।

यहां, हम एक अच्छी तरह से अध्ययन निगरानी सब्सट्रेट सीएस के साथ redox विनियमित निगरानी Hsp33 के बीच एक परिसर के लक्षण वर्णन के लिए इन प्रोटोकॉल लागू किया । हम दो विभिंन प्रकार के प्रोटीन एकत्रीकरण विश्लेषण है, जो उनकी काइनेटिक और प्रारंभिक अवस्था में अलग प्रस्तुत: एक रासायनिक विकार के दौरान, सब्सट्रेट विकृत रूप से अपनी खुलासा प्रक्रिया शुरू होता है, जबकि एक थर्मल एकत्रीकरण के दौरान, खुलासा सब्सट्रेट के देशी रूप से शुरू की है ।

प्रोटीन एकत्रीकरण के सापेक्ष राशि की निगरानी करने के लिए प्रकाश बिखरने माप एक उपयोगी उपकरण हैं । जब तक हम इस विधि का उपयोग निगरानी की सक्रिय स्थिति निर्धारित करने के लिए, यह आगे सामान्य एकत्रीकरण की स्थिति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, एक अलग प्रोटीन की स्थिरता की तुलना करने के लिए, या दोनों सब्सट्रेट और निगरानी में स्थिर उत्परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए.

अपनी सादगी के बावजूद, प्रकाश कैटरिंग विधि शोर डेटा का उत्पादन हो सकता है, कई outliers के साथ. इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हम ऊपर वर्णित Kfits सॉफ्टवेयर विकसित की है । Kfits सॉफ्टवेयर यह संभव बस और तेजी से शोर डेटा की बड़ी मात्रा को दूर करने के लिए बनाता है, साथ ही प्रकाश बिखरने वक्र से काइनेटिक मापदंडों की गणना. Kfits प्रोटीन एकत्रीकरण करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है और काइनेटिक माप के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है ।

इस प्रकार, यहां वर्णित तरीके सरल कर रहे हैं, प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और नहीं समय लेने वाली । वे विभिंन आणविक chaperones के लिए लागू किया जा सकता है, उनके redox निर्भरता को सक्षम करने के लिए एक दो दिनों के भीतर जांच की जाएगी । इसके अलावा, अन्य, गैर-redox आश्रित chaperones के विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि प्रकाश कैटरिंग और Kfitsके वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । यह इस तरह के तापमान, प्रोटीन एकाग्रता, और माप समय के रूप में विभिन्न मापदंडों, स्वतंत्र रूप से प्रत्येक प्रोटीन प्रणाली के लिए समायोजित किया जाना है कि ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

आदेश में संरचनात्मक एक निगरानी काम चक्र शासी सूचना हासिल करने के लिए, हम HDX-एमएस पद्धति प्रस्तुत की । प्रकाश प्रकीर्णन प्रक्रिया के विपरीत, यह एक अधिक जटिल प्रौद्योगिकी है और एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर और, अधिमानतः, नमूना तैयारी के लिए एक रोबोट प्रणाली सहित विशिष्ट उपकरण, की आवश्यकता है । हालांकि, इस सेटअप भी रोबोट प्रणाली के बिना, एक मौजूदा सुविधा में स्थापित किया जा सकता है । एक बार जब यह स्थापित है, प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल है और चुनौतीपूर्ण प्रोटीन परिसरों जो उच्च संकल्प के तरीके (जैसे, एक्स-रे और एनएमआर) द्वारा नहीं पहुंच सकता है के विश्लेषण की अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक उसे उपयोगी चर्चा और लेख के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Meytal Radzinski के लिए आभारी हैं, और पैट्रिक ग्रिफिन और उनके असीमित सहायता के लिए अपने प्रयोगशाला के सदस्यों जबकि HDX विश्लेषण मंच की स्थापना । लेखक जर्मन इसराइल फाउंडेशन (I-2332-1149.9/2012), Binational विज्ञान फाउंडेशन (२०१५०५६), मैरी-क्यूरी एकीकरण अनुदान (६१८८०६), इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (1765/13 और 2629/16), और मानव फ्रंटियर विज्ञान के लिए आभारी हैं कार्यक्रम (CDA00064/2014) उनके वित्तीय सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

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Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

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