सबसे चुनौतीपूर्ण तनाव की स्थिति है कि जीवों को अपने जीवनकाल के दौरान मुठभेड़ में से एक oxidants का संचय शामिल है । ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान, कोशिकाओं को भारी आणविक chaperones पर भरोसा करते हैं । यहाँ, हम वर्तमान redox-विनियमित विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, साथ ही HDX-MS का उपयोग कर निगरानी समारोह शासी संरचनात्मक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए.
जीवों को नियमित रूप से तापमान में परिवर्तन, पीएच, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के संचय, और अधिक सहित अपने जीवन चक्र के दौरान अस्थिर वातावरण के साथ सामना करने की जरूरत है । इन उतार चढ़ाव एक व्यापक प्रोटीन खुलासा, एकत्रीकरण, और कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, कोशिकाओं को एक गतिशील और तनाव आणविक chaperones, जो तनाव की स्थिति के दौरान एक “स्वस्थ” proteome बनाए रखने के विशेष नेटवर्क विकसित किया है । एटीपी स्वतंत्र chaperones आणविक chaperones, जो पहली लाइन रक्षा अणुओं के रूप में सेवा, एक तनाव पर निर्भर तरीके से प्रोटीन एकत्रीकरण के खिलाफ की रक्षा के एक प्रमुख वर्ग का गठन किया । एक विशेषता इन chaperones आम में है उनके लिए अपने तनाव विशेष सक्रियण, मांयता के लिए संरचनात्मक प्लास्टिक का उपयोग करने की क्षमता है, और ग्राहक के सामने जारी की ।
इस पत्र में, हम एक ऐसे आंतरिक रूप से परिक्रमित निगरानी के कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित, बैक्टीरियल redox-विनियमित Hsp33, जो ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान एकत्रीकरण के खिलाफ प्रोटीन की रक्षा करता है । यहां, हम redox-विनियमित निगरानी गतिविधि का अध्ययन करने के लिए विविध तकनीकों का एक उपकरण बॉक्स प्रस्तुत करते हैं, साथ ही साथ निगरानी की संरचना में परिवर्तन मानचित्रण के लिए, अपनी गतिविधि अंतर्निहित । विशेष रूप से, हम एक कार्यप्रवाह जो पूरी तरह से कम और पूरी तरह से ऑक्सीकरण प्रोटीन की तैयारी भी शामिल है का वर्णन, निगरानी विरोधी के एक विश्लेषण के द्वारा पीछा इन विट्रो में प्रकाश कैटरिंग का उपयोग कर, की डिग्री पर ध्यान केंद्रित विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि और उसके कैनेटीक्स । एकत्रीकरण परख के दौरान संचित अक्सर outliers पर काबू पाने के लिए, हम Kfits, एक उपंयास चित्रमय उपकरण है जो काइनेटिक माप के आसान प्रसंस्करण की अनुमति देता है के उपयोग का वर्णन । इस उपकरण को आसानी से outliers और फिटिंग काइनेटिक मापदंडों को हटाने के लिए काइनेटिक माप के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । प्रोटीन संरचना के साथ इस समारोह को सहसंबंधी बनाना, हम सेटअप और एक संरचनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक के कार्यप्रवाह का वर्णन, हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम विनिमय जन स्पेक्ट्रोमेट्री, कि निगरानी पर गठन के परिवर्तन के मानचित्रण की अनुमति देता है और Hsp33 गतिविधि के विभिंन चरणों के दौरान सब्सट्रेट । इसी पद्धति से अन्य प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-ligand इंटरैक्शन को लागू किया जा सकता है.
कोशिकाओं को अक्सर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) श्वसन1,2, प्रोटीन और लिपिड ऑक्सीकरण3,4, और अतिरिक्त प्रक्रियाओं5के शोधकार्य के रूप में उत्पादित का एक संचय का सामना, 6,7. ऐसे सेलुलर8,9 और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया10संकेत के रूप में विविध जैविक प्रक्रियाओं में ‘ ROS लाभकारी भूमिका के बावजूद, ROS उत्पादन और उसके detoxification के बीच एक असंतुलन हो सकता है, ऑक्सीडेटिव के लिए अग्रणी तनाव7. ROS के जैविक लक्ष्य प्रोटीन, लिपिड, और न्यूक्लिक एसिड, जो के ऑक्सीकरण उनकी संरचना और समारोह को प्रभावित कर रहे हैं । इसलिए, सेलुलर oxidants के संचय दृढ़ता से कैंसर9,11, सूजन12,13सहित विकृतियों की एक विविध रेंज से जुड़ा हुआ है, और14उंर बढ़ने, 15, और इस तरह के अल्जाइमर, पार्किंसंस, और ALS रोग के रूप में neurodegenerative विकारों की शुरुआत और प्रगति में शामिल होना पाया गया है16,17,18.
दोनों नव संश्लेषित और परिपक्व प्रोटीन अत्यधिक उनके पक्ष चेन, जो आकार प्रोटीन संरचना और समारोह19,20के संभावित हानिकारक संशोधनों के कारण ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील हैं । इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव आमतौर पर एक व्यापक प्रोटीन निष्क्रियता, खुलासा और एकत्रीकरण की ओर जाता है, अंततः कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी । सुरुचिपूर्ण सेलुलर रणनीतियों में से एक प्रोटीन ऑक्सीकरण की संभावित क्षति के साथ सामना करने के लिए redox-निर्भर chaperones, जो व्यापक प्रोटीन एकत्रीकरण को बाधित का उपयोग करने के बजाय, के साथ स्थिर परिसरों के गठन के लिए ग्राहक प्रोटीन के साथ21 ,२२,२३. ये पहली लाइन रक्षा chaperones तेजी से एक साइट विशेष ऑक्सीकरण द्वारा सक्रिय कर रहे है (आमतौर पर cysteine अवशेषों पर) है कि उंहें शक्तिशाली विरोधी एकत्रीकरण अणुओं में धर्मांतरित24। चूंकि श्वसन के निषेध में ऑक्सीडेटिव तनाव परिणाम और सेलुलर एटीपी स्तर25में घट जाती है, विहित एटीपी-निर्भर chaperones कम प्रभावी रहे हैं ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति के दौरान25,26 ,27. इसलिए, redox-सक्रिय एटीपी-स्वतंत्र chaperones बैक्टीरिया और eukaryotes में oxidants के संचय पर प्रोटीन homeostasis को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं (जैसे, Hsp3328 और रिदा29 बैक्टीरिया में, Get330 खमीर में, peroxiredoxins31 eukaryotes में) । इन chaperones की गतिविधि दृढ़ता से प्रतिवर्ती संरचनात्मक संरचना पर निर्भर करता है एक साइट विशेष ऑक्सीकरण द्वारा प्रेरित परिवर्तन है कि hydrophobic क्षेत्रों को उजागर ग्राहक प्रोटीन की पहचान में शामिल है ।
विरोधी एकत्रीकरण तंत्र के अनुसंधान और chaperones द्वारा ग्राहक प्रोटीन की मांयता शासी सिद्धांतों निगरानी-सब्सट्रेट बातचीत३२,३३के गतिशील और heterogenic प्रकृति के कारण आसान नहीं है, ३४,३५,३६,३७. हालांकि, तनाव विनियमित chaperones के लिए अपनी क्षमता के कारण विरोधी एकत्रीकरण समारोह के बारे में हमारी समझ अग्रिम करने का अवसर है: 1) निगरानी के दो विभिंन रूपों, सक्रिय (जैसे, ऑक्सीकरण) और निष्क्रिय प्राप्त करें (जैसे, कम), परिचय या एक तनाव की स्थिति को हटाने के साथ आसानी से उन दोनों के बीच स्विचन (जैसे, ऑक्सीडेंट और एजेंट को कम करने), 2) सब्सट्रेट की एक विस्तृत श्रृंखला है, 3) फार्म का ग्राहक प्रोटीन है कि द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के साथ उच्च स्थिर परिसरों विभिंन संरचनात्मक तरीके, और 4) पूरी तरह से सब्सट्रेट मांयता और रिहाई पर ध्यान केंद्रित, redox-निर्भर गठन परिवर्तन द्वारा मध्यस्थता, इन chaperones के बहुमत के रूप में तह क्षमता का अभाव है ।
यहां, हम जीवाणु redox-विनियमित निगरानी Hsp33’s विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि, ऑक्सीकरण प्रेरित प्रोटीन एकत्रीकरण28के खिलाफ जीवाणु रक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण घटक का विश्लेषण । जब कम, Hsp33 कोई निगरानी गतिविधि के साथ एक कसकर तह जस्ता-बाध्यकारी प्रोटीन है; हालांकि, जब ऑक्सीडेटिव तनाव को उजागर, Hsp33 व्यापक गठन परिवर्तन जो अपने सब्सट्रेट बंधन क्षेत्रों३८,३९बेनकाब से गुजरती है । ऑक्सीकरण पर, जस्ता आयन कि दृढ़ता से चार अत्यधिक संरक्षित cysteine अवशेषों सी के लिए बाध्य है-टर्मिनल डोमेन४०जारी की है । दो डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन में यह परिणाम, सी टर्मिनल डोमेन का एक खुलासा, और आसंन linker क्षेत्र४१के एक स्थिरीकरण । सी टर्मिनल और linker क्षेत्रों अत्यधिक लचीला कर रहे है और आंतरिक या आंशिक रूप से परिक्रमा के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । गैर-तनाव की स्थिति में लौटने पर, cysteines कम हो जाता है और कोई विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि के साथ अपने देशी जोड़ राज्य के लिए निगरानी रिटर्न । निगरानी का खुलासा करने की ओर जाता है एक और खुलासा करने के लिए बाध्य ग्राहक प्रोटीन है, जो विहित निगरानी प्रणाली के लिए अपने स्थानांतरण चलाता है, दनाक/जे,३८re । Hsp33’s बातचीत साइटों के विश्लेषण से पता चलता है कि Hsp33 अपने आरोप लगाया परिक्रमा क्षेत्रों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लिंकर और एन-टर्मिनल डोमेन पर hydrophobic क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया ग्राहक प्रोटीन को पकड़ने और उनके एकत्रीकरण३८को रोकने का उपयोग करता है, ४२. मुड़े हुए राज्य में, इन क्षेत्रों को जोड़ लिंकर और सी-टर्मिनल डोमेन द्वारा छिपाया जाता है. दिलचस्प है, linker क्षेत्र Hsp33’s तह और निष्क्रिय राज्य के एक द्वारपाल के रूप में कार्य करता है, “संवेदन” अपने आसंन सी के तह स्थिति टर्मिनल डोमेन३४। एक बार mutagenesis द्वारा अस्थिर (या तो एक बिंदु उत्परिवर्तन या एक पूर्ण अनुक्रम गड़बड़ी द्वारा), Hsp33 एक constitutively सक्रिय निगरानी की परवाह किए बिना अपने redox-संवेदी redox४३के cysteines राज्य में परिवर्तित हो जाता है ।
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत Hsp33’s redox-निर्भर निगरानी गतिविधि की निगरानी, साथ ही साथ सक्रियकरण और ग्राहक प्रोटीन की बाध्यकारी पर मानचित्रण के गठन के परिवर्तन की अनुमति देते हैं । इस पद्धति के अंय निगरानी ग्राहक मांयता मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर निगरानी प्रोटीन प्रोटीन बातचीत अनुसंधान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, हम पूरी तरह से कम और ऑक्सीकरण chaperones कि अंय redox-स्विच प्रोटीन के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान प्रोटीन गतिविधि पर प्रोटीन ऑक्सीकरण की संभावित भूमिकाओं को प्रकट करने के लिए ।
विशेष रूप से, हम एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए इन विट्रो में निगरानी गतिविधि पर नजर रखने और प्रोटीन एकत्रीकरण (रासायनिक या थर्मल प्रेरित) के विभिंन प्रकार के तहत अपने सब्सट्रेट विशिष्टता को परिभाषित प्रकाश कैटरिंग (रास) का उपयोग कर एक से मापा fluorospectrometer४४. एकत्रीकरण के दौरान, ३६० एनएम पर प्रकाश बिखरने तेजी से बढ़ती turbidity के कारण बढ़ जाती है । इस प्रकार, एकत्रीकरण एक समय पर निर्भर तरीके से इस तरंग दैर्ध्य पर नजर रखी जा सकती है । LS प्रोटीन एकत्रीकरण के परीक्षण के लिए एक तेज और संवेदनशील तरीका है और इस प्रकार nanomolar सांद्रता का उपयोग कर ब्याज की एक प्रोटीन की विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि, विभिन्न के तहत प्रोटीन एकत्रीकरण से संबंधित काइनेटिक मापदंडों के लक्षण वर्णन को सक्षम करने शर्तों. इसके अलावा, रास प्रोटोकॉल यहां वर्णित महंगा उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और आसानी से किसी भी प्रयोगशाला में स्थापित किया जा सकता है ।
फिर भी, यह “स्वच्छ” काइनेटिक घटता प्राप्त करने के लिए काफी चुनौतीपूर्ण है और इस तरह के प्रकाश बिखरने प्रयोगों से एक प्रोटीन की काइनेटिक मापदंडों, शोर और हवा के बुलबुले और बड़े समुच्चय द्वारा उत्पन्न outliers की बड़ी संख्या के कारण । इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एक उपंयास चित्रमय उपकरण, Kfits४५, अलग काइनेटिक माप में शोर के स्तर को कम करने के लिए इस्तेमाल किया, विशेष रूप से प्रोटीन एकत्रीकरण काइनेटिक डेटा के लिए सज्जित प्रस्तुत करते हैं । इस सॉफ्टवेयर के परिणामों की एक प्रारंभिक आकलन के लिए प्रारंभिक काइनेटिक मापदंडों प्रदान करता है और उपयोगकर्ता के लिए “साफ” डेटा की बड़ी मात्रा में जल्दी अपनी काइनेटिक संपत्तियों को प्रभावित किए बिना अनुमति देता है । Kfits पायथन में लागू किया गया है और ४५पर खुला स्रोत में उपलब्ध है ।
क्षेत्र में चुनौतीपूर्ण सवालों में से एक chaperones और उनके ग्राहक प्रोटीन और समझ कैसे chaperones के बीच बातचीत साइटों मानचित्रण से संबंधित है की एक विस्तृत श्रृंखला का खुलासा सब्सट्रेट । यह सवाल और जटिल है जब अत्यधिक गतिशील प्रोटीन परिसरों का अध्ययन है जो आंतरिक रूप से chaperones और एकत्रीकरण प्रवण सब्सट्रेट शामिल है । सौभाग्य से, संरचनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री नाटकीय रूप से पिछले दशक में उंनत है और सफलतापूर्वक उपयोगी दृष्टिकोण और उपकरण प्रदान की संरचनात्मक प्लास्टिक और नक्शे प्रोटीन मांयता४६में शामिल अवशेषों का विश्लेषण, ४७ , ४८ , ४९. यहाँ, हम एक ऐसी तकनीक प्रस्तुत करते हैं-हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HDX-MS)-जो प्रोटीन संशोधन या प्रोटीन/Ligand बाइंडिंग३५पर एक संरचनात्मक अनुरूपता में अवशेषों-स्तर परिवर्तन की मैपिंग की अनुमति देता है, ५०,५१,५२,५३,५४,५५. HDX-MS ड्यूटेरियम द्वारा रीढ़ हाइड्रोजन की सतत विनिमय का उपयोग करता है, जो की दर रासायनिक वातावरण, पहुंच, और आबंध और गैर आबंध बांड५६से प्रभावित है । HDX-एमएस इन एक्सचेंज एक deuterated विलायक, आमतौर पर भारी पानी (डी2ओ) का उपयोग कर प्रक्रियाओं, और ड्यूटेरियम विनिमय के लिए हाइड्रोजन के बाद आणविक वजन में परिवर्तन के आधार पर माप की अनुमति देता है । हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज की धीमी दरों से हाइड्रोजन बांड या, बस, steric बाधा है, जो संरचना५७में स्थानीय परिवर्तन को इंगित करता है में भाग लेने से परिणाम कर सकते हैं । ligand बाइंडिंग या पोस्ट-शोधों के संशोधनों पर होने वाले परिवर्तन हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज (HDX) दरों४६,५३में अंतर में आने वाले बाइंडिंग के साथ हाइड्रोजन वातावरण में भी अंतर पैदा कर सकते हैं ।
हम 1 के लिए इस तकनीक को लागू) नक्शा Hsp33 क्षेत्रों जो तेजी से ऑक्सीकरण पर खुलासा, Hsp33 के सक्रियकरण के लिए अग्रणी है, और 2) अपनी पूरी लंबाई के साथ Hsp33 के संभावित बाध्यकारी इंटरफेस को परिभाषित सब्सट्रेट, साइट्रेट सिंथेस (सीएस)३८।
इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों में प्रोटीन के redox-निर्भर कार्यों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, इन विट्रो में, विरोधी एकत्रीकरण गतिविधि और संरचनात्मक परिवर्तन की भूमिका (यदि कोई हो) प्रोटीन समारोह में परिभाषित । इन तरीकों को आसानी से विविध जैविक प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और प्रयोगशाला में लागू ।
इस पत्र में, हम redox-निर्भर निगरानी गतिविधि और एक ग्राहक प्रोटीन के बंधन पर संरचनात्मक परिवर्तन के लक्षण वर्णन के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रदान की है । इन पूरक के तरीके के लिए संभावित निगरानी-सब्सट्रे…
The authors have nothing to disclose.
लेखक उसे उपयोगी चर्चा और लेख के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Meytal Radzinski के लिए आभारी हैं, और पैट्रिक ग्रिफिन और उनके असीमित सहायता के लिए अपने प्रयोगशाला के सदस्यों जबकि HDX विश्लेषण मंच की स्थापना । लेखक जर्मन इसराइल फाउंडेशन (I-2332-1149.9/2012), Binational विज्ञान फाउंडेशन (२०१५०५६), मैरी-क्यूरी एकीकरण अनुदान (६१८८०६), इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (1765/13 और 2629/16), और मानव फ्रंटियर विज्ञान के लिए आभारी हैं कार्यक्रम (CDA00064/2014) उनके वित्तीय सहायता के लिए ।
Chemicals, Reagents | |||
Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
Instruments | |||
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
Software, Software Tools, Database search | |||
Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html |