Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

doi: 10.3791/57806 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Abstract

Canlı organizmalar düzenli olarak dalgalanan ortamları ile sıcaklık, pH, reaktif oksijen türleri birikimi, daha fazla ve değişiklikleri de dahil olmak üzere kendi yaşam döngüsü sırasında başa çıkmak gerekir. Bu dalgalanmalar unfolding, bir yaygın protein için toplama, kurşun ve ölüm hücre. Bu nedenle, hücreleri "sağlıklı" Proteom stres koşullarında korumak moleküler chaperones dinamik ve stres özel ağının gelişmiştir. ATP bağımsız chaperones ilk satır savunma molekülleri, bir stres bağlı şekilde protein toplama karşı koruma olarak hizmet moleküler chaperones bir ana sınıfı oluşturur. Bu chaperones ortak olan bir özelliği yeteneğini kendi stres özgü etkinleştirme, tanıma ve misfolded istemci sürümü için yapısal plastisite kullanmak olmasıdır.

Bu yazıda, bir tür özünde düzensiz refakatçi, bakteriyel redoks düzenlenir Hsp33, proteinler oksidatif stres sırasında toplama karşı koruyan fonksiyonel ve yapısal analizi odaklanmak. Burada, kendi faaliyet altında yatan bir araç çeşitli teknikleri redoks düzenlenir refakatçi etkinlik eğitim için hem de refakatçi konformasyon değişiklikleri eşleştirmek için mevcut. Özellikle, biz tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler, ışık saçılım kullanarak, derecesi üzerinde odaklanan refakatçi anti-toplama etkinliği vitro analizine ardından hazırlanması içeren bir iş akışı tarif Anti-toplama etkinliği ve onun kinetik. Sık outliers toplama deneyleri sırasında biriken üstesinden gelmek için Kfits, kinetik ölçümleri kolay işlenmesini sağlayan yeni bir grafik araç kullanımını açıklar. Bu aracı kolayca diğer türleri kinetik ölçümlerin outliers kaldırma ve kinetik parametrelerin montaj için uygulanabilir. Işlev protein yapısı ile ilişkilendirmek için kurulum ve iş akışı bir yapısal kütle spektrometresi tekniği, refakatçi eşleme konformasyon değişikliklerinin sağlayan hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi, tarif ve Hsp33 faaliyet farklı aşamalarında alt katman. Aynı metodoloji diğer protein-protein ve protein-ligand etkileşimleri için uygulanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hücreleri reaktif oksijen türleri (ROS) solunum1,2, protein ve lipit oksidasyon3,4ve ek işlemler5yan üretilen bir birikimi sık karşılaşırsanız, 6,7. ROS yararlı rolü rağmen8,9 ve bağışıklık yanıtı10sinyal cep gibi farklı biyolojik süreçleri, ROS üretim ve onun detoksifikasyon arasında bir dengesizlik, oksidatif için önde gelen ortaya çıkabilir 7stres. Biyolojik ROS, proteinler, lipidler ve nükleik asitler, bunların oksidasyon etkiler onların yapısı ve fonksiyonu hedefleridir. Bu nedenle, hücresel oksidanlar birikimi güçlü patolojiler kanser9,11, iltihap12,13ve yaşlanma14, de dahil olmak üzere çeşitli bir yelpazede bağlı olduğu 15ve başlangıçlı ve nörodejeneratif hastalıklar gibi Alzheimer, Parkinson'ın ilerlemesini ve ALS hastalığı16,17,18dahil olduğu tespit edilmiştir.

Hem yeni sentezlenmiş ve olgun protein oksidasyon protein yapısı ve fonksiyonu19,20şekil onların yan zincirlerinin zararlı olabilecek değişiklikler nedeniyle son derece duyarlıdır. Bu nedenle, oksidatif stres genellikle yaygın protein inactivation, misfolding ve toplama, sonunda hücre ölümüne giden yol açar. Protein oksidasyon olabilecek hasarları ile başa çıkmak için zarif hücresel stratejilerden birini yerine misfolded istemci protein21 ile kararlı kompleksler kurma yaygın protein toplama, inhibe redoks bağımlı chaperones kullanmaktır ,22,23. Bu ilk satır savunma chaperones hızla bunları güçlü anti-toplama molekülleri24dönüştürür bir siteye özgü oksidasyon (genellikle üzerinde sistein kalıntıları) tarafından etkinleştirilir. Oksidatif stres sonuçlar solunum inhibisyonu ve hücresel ATP düzeyleri25düşüşler beri kurallı ATP-bağımlı chaperones oksidatif stres koşulları25,26 sırasında daha az etkili ,27. Bu nedenle, redoks aktif ATP bağımsız chaperones oksidanlar bakteri ve ökaryotlar birikimi üzerine protein homeostazı korumak hayati bir rol oynamaktadır (Örneğin, Hsp3328 ve bakterilerde, Get3 RidA29 30 Maya, peroxiredoxins31 ökaryotlarda içinde). Bu chaperones etkinlik şiddetle hidrofobik bölgeler misfolded istemci proteinler tanıma dahil ortaya çıkaran bir siteye özgü oksidasyon tarafından indüklenen tersine çevrilebilir yapısal konformasyon değişiklikler bağlıdır.

Anti-toplama mekanizması ve istemci proteinler tanınması chaperones tarafından yöneten ilkeleri araştırma refakatçi-substrat etkileşimleri32,33dinamik ve heterogenic yapısı nedeniyle kolay değil, 34,35,36,37. Ancak, stres düzenlenir chaperones anti-toplama işlevi nedeniyle onların yetenek-e doğru bizim anlayışı ilerletmek için bir fırsat var: 1) refakatçi, (oksideÖrneğin,) etkin ve etkin olmayan (Örneğin, iki farklı türde elde giriş veya kolayca (Örneğin, oksidan ve indirgeyici), aralarında 2 geçiş bir stres durumu kaldırılması ile azaltılmış,)) yüzeyler, 3 geniş bir yelpazesi var) tarafından değerlendirilecek istemci proteinler ile son derece kararlı kompleksler oluşturur farklı yapısal metodolojisi ve 4) yalnızca substrat tanıma ve açıklaması, bu chaperones çoğunluğu katlama yeteneği yoksun olarak redoks bağımlı konformasyon değişikliklerden aracılı üzerinde odaklanmak.

Burada, bakteriyel redoks düzenlenir refakatçi Hsp33'ın anti-toplama etkinliği, oksidasyon kaynaklı protein toplama28karşı bakteriyel savunma sisteminin önemli bir bileşeni analiz. Azaltılmış, Hsp33 sıkıca katlanmış bir çinko-bağlayıcı protein hiçbir refakatçi etkinlik ile olur; Ancak, oksidatif strese maruz kaldığında, Hsp33, substrat bağlama bölgeleri38,39maruz kapsamlı konformasyon değişiklikler uğrar. Oksidasyon, C-terminal etki alanı dört son derece korunmuş sistein kalıntıları kuvvetle bağlı çinko iyon yayımlanan40olur. Bu iki disülfür bağları, bir C-terminal etki alanı ve bir istikrarsızlık bitişik bağlayıcı bölge41unfolding oluşumunda sonuçlanır. C-terminal ve bağlayıcı bölgeleri son derece esnektir ve özünde veya kısmen düzensiz olarak tanımlanır. Sigara stres koşulları döndüğünde, katıldı sınırlı olmak ve refakatçi hiçbir anti-toplama etkinlik ile yerel katlanmış durumuna döndürür. Refakatçi refolding daha fazla unfolding için yol açar ve refolding38için kanonik refakatçi sistem, DnaK/J, onun transfer tetikler ilişkili istemci protein destabilization. Onun dolu düzensiz bölgeler hem de hidrofobik bölgeler bağlayıcı ve N-terminal etki alanı yakalamak için Hsp33 kullanan her iki istemci proteinler misfolded ve önlemek onların toplama38, analiz Hsp33'ın etkileşim sitelerin öneriyor 42. katlanmış durumda katlanmış bağlayıcı ve C-terminal etki alanı tarafından bu bölgeler gizlidir. İlginçtir, bağlayıcı bölge "onun bitişik C-terminal etki alanı34katlama durumunu algılama" bir ağ geçidi denetleyicisi Hsp33'ın devletin, katlanmış ve etkin değil hizmet vermektedir. Bir kez mutagenesis (ya bir nokta mutasyon veya tam sırası pertürbasyon) tarafından dengeleri bozdu, Hsp33 bir yapısal etkin refakatçi ne olursa olsun onun redoks duyarlı katıldı43redoks durumunu dönüştürülür.

Burada sunulan iletişim kurallarına izin ver Hsp33'ın redoks bağımlı refakatçi etkinlik, yanı sıra etkinleştirme üzerine eşleme konformasyon değişiklikleri izleme ve istemci proteinlerin bağlama. Bu yöntem diğer refakatçi-müşteri tanıma modelleri yanı sıra refakatçi protein-protein etkileşimleri araştırma için adapte edilebilir. Ayrıca, biz potansiyel rolleri protein oksidasyon protein etkinlikte ortaya çıkarmak için başka redoks-anahtarı proteinlere çalışmalarında kullanılan tam olarak azaltılmış ve okside chaperones hazırlanması için protokolleri mevcut.

Özellikle, refakatçi etkinlik vitro izlemek ve onun substrat özgüllüğü (kimyasal olarak veya termal olarak ışık saçılma (LS) tarafından ölçülen kullanarak indüklenen) protein toplayıcı farklı türleri altında tanımlamak için bir yordam tarif bir fluorospectrometer44. Toplama sırasında hızla artan bulanıklık nedeniyle 360 nm artar, ışık saçılma. Böylece, toplama, bu dalga boyu bir saat-bağımlı şekilde izlenebilir. MU var protein toplama ve böylece bir protein nanomolar konsantrasyonları, protein toplama ile ilgili kinetik parametreleri altında farklı karakterizasyonu etkinleştirme kullanarak ilgi anti-toplama etkinliğini test etmek için hızlı ve hassas bir yöntem koşullar. Ayrıca, burada açıklanan LS Protokolü pahalı araçları gerektirmez ve kolayca herhangi bir laboratuvar olarak kurulabilir.

Yine de, "temiz" Kinetik eğriler elde etmek için ve deneyler, gürültü ve hava kabarcıkları ve büyük toplamları tarafından oluşturulan aykırı çok sayıda nedeniyle saçılma böyle ışık protein kinetik parametrelerin türetmek için oldukça zor. Bu engeli aşmak için biz mevcut bir roman grafik aracı, Kfits45gürültü seviyeleri özellikle protein toplama kinetik verileri için donatılmış farklı kinetik ölçümlerde azaltmak için kullanılan. Bu yazılım ön kinetik parametrelerin sonuçları erken bir değerlendirmesi için sağlar ve kullanıcının veri büyük miktarlarda hızlı bir şekilde kinetik özelliklerini etkilemeden temiz"". Kfits uygulanan Python ve 45açık kaynak mevcuttur.

Alanında zor sorulardan biri etkileşim siteleri chaperones ve onların istemci proteinler arasında eşleme ve nasıl tanımak chaperones misfolded yüzeylerde geniş bir anlama ile ilgilidir. Bu soruyu daha da özünde dahil son derece dinamik protein kompleksleri eğitim chaperones ve toplama eğilimli yüzeylerde düzensiz zaman karmaşık. Neyse ki, yapısal kütle spektrometresi son on yıl içinde önemli ölçüde ilerlemiştir ve başarılı bir şekilde yararlı yaklaşımlar ve yapısal plastisite analiz ve artıkları protein tanıma46, yer alan eşlemek için araçları sağlamıştır 47 , 48 , 49. burada, bir tür tekniği-hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi (HDX-MS) mevcut-protein ve/veya protein/Ligand bağlayıcı35, üzerine yapısal bir biçimsel kalıntı düzeyinde yapılan değişiklikler eşleme sağlar 50,51,52,53,54,55. HDX-MS tarafından döteryum, hangi oranı kimyasal çevre tarafından erişilebilirlik, etkilenen omurga hidrojen sürekli değişimi kullanır ve kovalent ve Kovalent bağlar56. HDX-MS deuterated solvent, yaygın olarak "ağır su" (D2O) kullanarak bu satım işlemleri izler ve moleküler hidrojen döteryum Exchange'e takip ağırlık değişiklik dayalı ölçüm sağlar. Hidrojen-döteryum değişiminin daha yavaş gore hidrojen hidrojen bağları katılan veya, yerel değişikliklerde sonuçlanırsa yapısı57gösterir sadece, steric engel neden olabilir. Değişiklikleri bir ligand bağlayıcı veya translasyonel modifikasyon üzerine de farklılıklar hidrojen ortamda hidrojen-döteryum exchange (HDX) oranları46,53farklılıkları sonuçlanan bir bağlama ile yol açabilir.

Biz bu teknoloji hızla Hsp33, harekete geçirmek için önde gelen oksidasyon, üzerine açılmak ve 2) tanımlamak Hsp33 olası bağlama arayüzü, tam uzunlukta misfolded substrat, sitrat sentaz (CS)38ile 1) harita Hsp33 bölgelere uygulanır.

Bu el yazması açıklanan yöntemleri proteinler vitroanti-toplama etkinliği ve yapısal değişiklikler rolü (varsa) protein işlevinde tanımlama, redoks-bağımlı işlevler çalışmaya uygulanır. Bu metodolojileri kolayca farklı biyolojik sistemleri için uyarlanmış ve laboratuvar olarak uygulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler hazırlanması

  1. Tam olarak azaltılmış bir protein hazırlanması
    Not: Burada, biz bir çinko içeren protein ve Zn dahil, düşük protein durumuna için kullanım ZnCl2 çözüm azalma tarif. ZnCl2 çözüm yerine atılan veya. Not zaman ve sıcaklık azaltma işleminin protein istikrar ve işlev bağlıdır ve böylece başına protein özgüdür.
    1. Protein örnek buz çözme ve Kaldır toplamları aşağı sıralayacağız. Örnek en az 1,5 saat 37 ° C 5 mM DTT ile ve 20 µM ZnCl2 için kuluçkaya (ilâ protein konsantrasyonu %70).
      Not: Bu adımda sıcaklığı protein bağımlı ve protein istikrar için ayarlanmalıdır.
    2. DTT desalting sütunları kullanarak kaldırın.
      Not: Kullanılabilir sütunlar desalting farklı vardır. İletişim kuralı aşağıdaki yordamı ( Tablo malzemelerigörmek) belirli desalting sütunları kullanarak açıklar. Desalting diğer sütunları kullanmadan önce desalting bazı sütunlar kısmen ilgi protein absorbe beri onların verimliliği DTT kurtarma, kaldırma ve protein inceleyerek öneririz.
      1. Potasyum fosfat (KPI) arabelleği (40 mM, pH 7.5) ile sütun sütun tamamen arabellek ile doldurma ve arabelleğin dışarı damla icar tarafından equilibrate. Bu tekrarlayın 2 x.
      2. Beyaz disk filtre sütununda yavaşça cımbız ile iterek ve kaldırma Kaldır; sütun ile KPI tampon dolu iken kaldırmak en kolay yoldur. KPI arabellek sütun doldurma ve 1000 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi.
      3. Sütun temiz bir tüpün içine transfer protein örnek yavaş orta sütun ekleyin ve 1000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi. DTT-Alerjik protein akışı-aracılığıyla artık.
    3. Onun konsantrasyonları kontrol edin (Örneğin, bir UV/Vis Spektrometre kullanın) ve onun absorbans 280 ölçmek nm. Bira'nın hukuk kullanarak protein konsantrasyonu hesaplayın.
    4. Protein örnekleri yarısı aliquots dağıtmak. (Anaerobik bir odası kullanarakÖrneğin,) anaerobik koşullarda aliquots oksijen tamamen kaldırılması için 20 dk için kuluçkaya. Plastik film ile tüplerin mühür ve örnekleri-20 ° C veya-80 ° C, protein bağlı olarak saklayın.
      Not: anaerobik odası kullanmak yerine, tüpler de oksijen kaldırmak için argon gazı ile parladı.
  2. Tam okside protein hazırlanması
    Not: Bu tam olarak azaltılmış proteinler (daha önce açıklanan) oksitlenmiş protein örnekleri hazırlamak için tavsiye edilir. Bu heterojenlik katıldı durumlarında oksidasyon azaltacaktır. Farklı oksitleyici reaktifler kullanmak mümkündür; burada, hidrojen peroksit (H2O2) üzerinde duruluyor.
    Dikkat: istenmeyen intramolecular disülfür bağları ve sistein, metiyonin, Tirozin ve diğerleri de dahil olmak üzere farklı amino asitler, geri dönüşü olmayan oksidasyon neden olabilir aşırı oksidasyon önlemek.
    1. Kalan protein örnek için 5 mM H2O2 (taze seyreltilmiş) ekleyin ve 40 ° C'de 3 h için sallayarak süre kuluçkaya.
      Not: Bu adımda sıcaklığı protein bağımlı ve protein istikrar için ayarlanmalıdır.
    2. KPI arabelleği (40 mM, pH 7.5) ile sütun sütun tamamen arabellek ile doldurma ve arabelleğin dışarı damla icar tarafından equilibrate. Bu tekrarlayın 2 x.
    3. Beyaz disk filtre sütununda yavaşça cımbız ile iterek ve kaldırma Kaldır; sütun ile KPI tampon dolu iken kaldırmak en kolay yoldur.
    4. KPI arabellek sütun doldurma ve 1000 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi.
    5. Sütun temiz bir tüpün içine aktarmak, oksitlenmiş protein örnek yavaş orta sütun ekleyin ve 1000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi; oksitlenmiş şimdi akış-aracılığıyla proteindir.
    6. Adım 1.2.5, olduğu gibi protein konsantrasyonları oksitlenmiş proteinler aliquots bölmek ve bunları saklamak-20 ° C veya-80 ° C, protein-bağımlı kontrol edin.

2. ışık toplama tahlil saçılma

Not: Bu tahlil tüm konsantrasyonlarda refakatçi ve substrat özel, vardır ve ayarlanması. Arabellekleri herhangi bir parçacıkların ücretsiz ya da hava kabarcıkları ve temiz ve tozsuz cuvettes son derece önemli olduğu gibi tüm arabellekleri 0,22 µm süzülmüş olması gerekir. Kuvars küvet yerleştirilen bir karıştırıcı kullanmak çok önemlidir. Farklı karıştırıcı boyut ve şekillerde istenmeyen hava kabarcıkları üretmeden karıştırma, verimli bir bütün çözümü sağlamak için kontrol edin. Ayrıca, mevcuttur farklı flouorospectrometers laboratuvarlar ve imkanlar. Burada, belirli bir fluorospectrometer ( Tablo malzemelerigörmek) kullanıldı. Farklı enstrümanlar farklı bir hassasiyet, Ölçüm hızı ve örnekleyici parametreleri vardır. Bu nedenle, kesin ölçüm parametreleri (Örneğin, emisyon ve uyarma bant genişliği, duyarlılık ve diğerleri) bilinen bir toplama eğilimli protein ve onun karşılık gelen koşulları kullanarak optimize edilmelidir. Sitrat sentaz (CS) ve/veya luciferase olarak nanomolar konsantrasyonlarda ilk yüzeylerde kullanılması önerilir.

  1. Kimyasal toplama tahlil
    1. Kuluçka 12 µM CS 40 mM HEPES (pH 7.5) geceleme denatüre substrat hazırlayın ve 4,5 M GdnCl. PH korumak için 40 mm HEPES (pH 7.5) GdnCl geçiyoruz.
    2. Fluorospectrometer yazılım açık ve saat ders ölçüm. Parametrelerini ayarlamak: sıcaklık: 25 ° C; Λem: 360; Em bant genişliği: 5 nm; Λex: 360; Bant genişliği Ex: 2.5 nm; ve veri aralığı: 0,5 s.
    3. Örnek bir kuvars küvet 40 mm HEPES 1.600 µL ekleyerek hazırlayın. Küvet örnek yuvasına takın ve istenilen sıcaklık ulaşmak örnek izin.
    4. Karıştırma için 600 rpm ayarla ve temel kurulana kadar ölçüm başlar. Tüm ölçüm için karıştırmaya devam et.
    5. 120 bir koruyucuya CS toplama yokluğunda ölçmek için s ölçüm içine ekleyin (yumuşak, ama hızlı bir şekilde) 10 µL denatüre CS (75 son konsantrasyonu nM). Ölçüm için 1.200 devam s.
    6. Hsp33, huzurunda CS toplama 60 ölçmek için s ölçüm içine eklemek Hsp33 (son konsantrasyonu 300 nM). Sonra ek bir 60 s, denatüre CS 10 µL ekleyin (75 son konsantrasyonu nM). Ölçüm için 1.200 devam s.
      Not: substrat veya refakatçi, ekleme baloncuklar önlemek için eklerken, 10 µL pipet kullanın.
  2. Termal toplama tahlil
    Not: Sıcaklık termal toplama tahlil için protein istikrarı üzerinde bağlıdır ve her protein bağımsız olarak ayarlanmalıdır.
    1. Fluorospectrometer yazılım açık ve saat ders ölçüm. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: sıcaklık: 43 ° C; Λem: 360; Emisyon bant genişliği: 5 nm; Λex: 360; Uyarma bant genişliği: 2.5 nm; ve veri aralığı: 0,5 s.
    2. Örnek bir kuvars küvet için önceden ısıtılmış 40 mm HEPES 1.600 µL ekleyerek hazırlayın. Küvet örnek yuvasına takın ve 43 ° C. ulaşmak örnek izin
    3. Karıştırma için 600 rpm ayarla ve temel kurulana kadar ölçüm başlar. Tüm ölçüm için karıştırmaya devam et.
    4. 120 bir koruyucuya CS toplama yokluğunda ölçmek için s ölçüm içine yavaşça CS ekleyin (son konsantrasyonu 125 nM) ve 1200 ölçme devam s.
    5. Hsp33, huzurunda CS toplama 60 ölçmek için s ölçüm içine eklemek Hsp33 (son konsantrasyonu 600 nM). Sonra ek bir 60 s, CS eklemek (son konsantrasyonu 125 nM). Ölçüm için 1.200 devam s.
      Not: substrat veya refakatçi eklerken, kabarcıklar ekleme kaçının.
  3. Veri analizi ve gürültü kaldırma Kfits tarafından
    Not: Kfits de mevcuttur kullanımı Kfits daha önce Rimon ve ark. içinde tanımlanmıştır 45
    1. Veri dosyasını karşıya yükle.
      Not: Işık saçılma ölçüleri metinsel bir virgülle ayrılmış veya sekmeyle ayrılmış biçimde ham sonuçlarından girilir.
    2. Herhangi bir gürültü kaldırmak için analiz parametrelerini seçin. Kullanım Otomatik en iyi modeli (önerilen), gürültü her zaman sinyaldir bayrak işareti.
    3. Apaçık aykırı yeşil ve kırmızı ayarlanabilir hatlarını kullanarak el ile kaldırın; Bu adım yeşil hat üstündeki ve altındaki kırmızı çizgi gürültü süzer.
    4. Taban çizgisi ve uygun eğrisi ayarlayın. Gürültü eşik uygulandıktan sonra işlenen verileri karşıdan yükleyin.

3. hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi

  1. Arabellekleri ve protein örnekleri (Hsp33 ve Hsp33-CS kompleksi) hazırlanması
    1. Protein örnekleri son konsantrasyonu 1 mg/ml 25 mM Tris-HCl tampon pH 7.5 oranında seyreltin ve 1.5-mL şişe için aktarabilirsiniz.
    2. 1:1.5 43 ° C'de oranında, Hsp33 CS ile kuluçka tarafından karmaşık örnekleri protein-substrat hazırlamak
      1. CS herhangi bir hızlı toplama önlemek ve Hsp33 ve termal olarak gelişeceğini CS arasında verimli bir bağ emin olmak için step-wise bir şekilde ekleyin.
      2. En az dört adımları kullanın (yani, her zaman son hacim dörtte eklemek) ve sonra CS koruma Hsp33 ile izin vermek için her ek örnekleri 15dk için kuluçkaya.
    3. 16.000 x g 4 ° C'de 30-dak Santrifüjü kullanarak herhangi bir toplamları kaldırmak
      Not: Yeni protein-substrat kompleksleri taze hazırlanmalıdır. Substrat yanı sıra yavaş yavaş yapılmalıdır; Aksi halde, toplama ortaya çıkar. Sıcaklık, substrat ve substrat konsantrasyonu protein özgüdür.
    4. Bir arabellek deuteration denetimi olarak hizmet veren, H (25 mM Tris-HCl, pH 7.5) ve bir arabellek deuteration arabellek olan D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), hazır olun. Ayrıca taze su verme arabellek (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, %0,1 formik asit) hazırlayın.
      Not: Su verme arabellek için faiz protein pepsin sindirim sonra onun maksimal sıra kapsama almak için optimize edilmelidir.
    5. Tüm arabellekleri ve örnekleri tüpleri aktarmak ve uygun tepsilerde koyun. Tutun arabellekleri H ve D 25 ° c (tepsi 25 ° C); Öte yandan, örnekleri ve su verme arabellek 0 - 2 ° C (tepsi 0 ° C) basılı tutun. Örnekleri 150-µL cam ekler yer ( Tablo reçetesiilk, görmek) ve o zaman şişe aktarabilirsiniz.
  2. Araç hazırlanması
    Not: Kütle spektrometre ile iki bilgisayar yazılımı bilgisayar programı ile birlikte gelir: bir pompalar da diğer kütle spektrometre kontrol ( Malzemeler tabloiçin bakınız). Bu iki yazılım programları kullanarak sonraki adımlar açıklanır.
    1. Tüm soğutma birimleri üzerinde el ile açın. Tüm soğutma sistemleri kendi hedef sıcaklık ulaştığınızda, el ile yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ve yükleme pompalar üzerinde geçiş.
      Not: bizim durumda, bunlar iki soğutma banyo ve soğutma bir kutu (hangi tuzak ve analitik sütunlar) oluşur. Diğer 25 ° C'de tepsi süre belgili tanımlık tepsi 0 ° C'de bir soğutma ünitesi soğur; soğutma kutusu sıcaklığı 1-2 ° c.
    2. Hem pompaları kontrol eden yazılım gibi kütle spektrometre denetleyen yazılım açık; MS beklemekonumuna olduğundan emin olun.
    3. HPLC çıkış vanası MS kaynağından bağlantısını kesmek ve sistem bir "Çift Kişilik süpürge" Çözüm (%1 formik asit, % 33 Asetonitril, % 33 isopropanol, % 33 metanol) ile ilk, sonra arabellek B ile (% 80 Asetonitril, %0,1 formik asit) yıkama ve son olarak (%0,1 ile tampon Formik asit, pH 2,25) ve sonra sisteme pepsin sütun ekleyin. Arabellekleri değiştirme, devam etmeden önce her iki pompa temizlemek emin olun.
    4. Her iki pompa için akış hızı 0.1 mL/dk ve basınç stabil emin olun.
    5. Yıkama sistemi sürekli akış ve sabit basınç ile sonra HPLC çıkış MS kaynak yerleştirin ve MS açın.
  3. Kütle Spektrometre parametreleri
    1. 175 ° c, kılıf gaz akışı 17, aux gaz kızdırma 2 ve sprey voltaj 4.5, peptid iyonlaşma electrospray iyonlaşma (ESI) için ayarla kV (ek Şekil 1).
    2. Sigara deuterated örnekleri için aşağıdaki gibi parametreleri ayarlayın.
      1. Küme parametreleri: tarama aralığı m/z 300-1500; Çözünürlük 70.000 için; Otomatik kazanç denetimi hedef (AGC) 106; ve en büyük enjeksiyon zaman (Bu) 100 ms.
        Not: 5 en yoğun iyonları ile şarj durum + 2 ve + 6 arasında (kendi yoğunluğu 1.3 x 10'dan daha yüksek4) ve 30'u dinamik bir pencere-ecek var olmak izole.
      2. İyon parçalanma yüksek enerjili collisional ayrılma (PİLGRİM6A) normalleştirilmiş çarpışma enerji (NCE) 28 için eşit ile çoklu-çarpışma hücre yerine getirilir. Tandem MS 10 35.000, AGC hedefinin bir çözünürlükte parçası iyonları saptamak5, en fazla 60 ms ve 2,0 m/z bir yalıtım pencere de.
    3. Deuterated örnekleri için MS1 sadece 140.000 daha yüksek çözünürlüğe sahip ve aksi takdirde benzer parametreler ile istihdam.
  4. Deneme gerçekleştirme
    1. Kasetlerdeki aşağıdaki şekilde ayarlayın.
      1. Arabellek H ve D yer tepsi 25 ° C, o zaman örnekleri ve su verme arabellek 0 ° C tepsisine yerleştirin.
      2. Yer X boş şişeleri, her iki tepsilerde hizalı, nerede X = x zaman puan sayısı örnekleri sayısı.
        Not: 25 ° C tepsisinde boş şişeleri tepki şişeleri hizmet ve içinde belgili tanımlık tepsi 0 ° C, şişeleri Şoklama olarak hizmet vermektedir.
      3. Boş şişeleri bir boş bardak ekleme içerir; atın ve deneyler arasında adı geçen yuvasını yerine.
        Not: (ek Şekil 2) en verimli ve en az zaman alıcı şekilde, örnekleri aynı anda çalışmasına izin veren bir yazılım HDX denemeyi çalıştırmak için kullanıldı. Bu yazılımı kullanarak sonraki adımlar açıklanır.
    2. Yazılımını açın. Aşağıdakileri gerçekleştirmek için program parametreleri ayarlayın.
      1. Her örnek (5 µL) seçili zaman puan bağlı olarak birkaç dakika için arabellek D 45 µL ile kuluçkaya (Örneğin, 1, 3, 18, 40 ve 100 dk) 25 ° C'de Sigara deuterated örnek arabelleği H 45 µL ile bunun yerine kuluçkaya.
      2. Kuluçka hemen sonra deuterated protein 50 µL buz gibi su verme arabellek 50 µL mix ve onları bir immobilize pepsin sütun (20 mm uzunluğunda, 2.0 mm çapında) içine enjekte.
      3. Arabellek A 50 oranında 6 dk ile yıkayarak ön sütuna herhangi bir peptidler pepsin sütundan elute µL/dk. tutun arabellek A 0 ° C'de soğutma kutusunda
      4. Peptidler C18 analitik sütun ön sütuna dışında elute (C18 sütun, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 mm x 50 mm 0 ° C'de muhafaza,) veya Asetonitril istimal %100 arabellek B Asetonitril degrade Asetonitril 100 µL/dk. çalışma, doğrusal bir gradyan uygulayarak ayırabilirsiniz : % 2, % 10-30, 30-%90, % 90, 90-%8, 1 dk. için hızlı degrade at 1,5 dk 2.5 min 7 dk. 7 dk ve nihayet 4 dk az %2 için sütun equilibrate.
    3. Çalışan bir sıra oluşturmak (ek Şekil 2bakın): tüm zaman puan, örnek adları ve mekanlar tepsiler yanı sıra arabellek adları ve konumları girin.
      Not: Yazılımın her farklı çalışan zaman uyum içine çeşitli örnekleri aynı anda, verimli çalışan kez azalan çalışan bir program izin verir.
  5. Veri Analizi
    Not: Biz Proteom Discoverer ve MaxQuant (özgür yazılım) peptid kimlik ve analiz HDX tezgah, yanı sıra kapsama için de dahil olmak üzere veri analizi sürecinde çeşitli yazılım programları ile çalışma bir proteinlerde döteryum şirketleşme Analizi ve HDX oranları farklı deneyler kümesi arasında bir karşılaştırma sağlayan ücretsiz yazılım. Bu yazılım programlarını kullanarak sonraki adımlar açıklanır.
    1. Peptid kapsamının örnek yazılım (ek Şekil 3) Sigara deuterated kontrol örnekleri çalıştırarak analiz. Aşağıdaki parametreleri kullanarak yazılımı kurar.
      1. Bir No-enzim (belirsiz) ile Sequest HT yöntemi kullanın ayırmak. 4-144 amino asit peptidlerin 7 ppm ve 0.5 Da habercisi 's iyon ve parça için toplu bir hoşgörü ile arayın. Dinamik metiyonin oksidasyon için izin.
      2. Protein, hangi aracılığıyla peptid kapsama yazılımları belirlemek için bir veritabanı oluşturun. Metin biçiminde tanımlanan peptidler verin.
    2. HDX tezgah özgür yazılım58kullanarak deuterated sonuçları çözümleyebilirsiniz.
      1. Protein Düzenleyicisi'ni açın ve protein protein sırası ve peptid kapsama dosya ekleyerek tanımlayabilirsiniz.
      2. Ardından, Kur Sihirbazı deneme Düzenleyicisi'ni açın ve istenen tüm girişleri girin.
        Not: Program örnekleri sayısı, zaman puan sayısı, çoğaltır sayısı, arabellekleri ve sıcaklık pH değerini gerektirir.
      3. Son olarak, giriş parametreleri sonra algılanan peptidler listesini program oluşturur kullanılan, kütle spektrometre ile ilgili.
        Not: Yazılımın "HDX" peptidler algılar, izotop kümeleri inceler ve deuteration örneklerde açık bir görselleştirme gösterir.
  6. Veri sunumu
    1. PyMol yazılım veya başka bir görselleştirme yazılımı kullanarak yapısına saygılı deuteration alımını bölgeleriyle etiketleyin.
    2. Döteryum alımını düzeyleri yerine B faktörü değerleri tanıtmak.
      Not: Bir temel eğitim https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sunulan iki yöntem kinetik etkinlik ve protein etkileşimleri, substrat arasındaki bir koruyucuya dinamikleri takip olanak sağlar. Ayrıca, oksidasyon azaltma Protokolü redoks bağımlı düzensiz chaperones etkinleştirme mekanizması daha derinlemesine bir anlayış vererek bir tam olarak azaltılmış ve tam okside koruyucuya hazırlanması sağlayan.

İlk olarak, ışık saçılma refakatçi redoks bağımlı etkinliğini incelemek için kullanılır. Işık saçılma oksitlenmiş (etkin) huzurunda bir kimyasal ve termal denatüre CS protein üzerinde gerçekleştirilen veya azaltılmış (etkin değil) refakatçi (Şekil 1). Kimyasal denatürasyon olumsuz arabellek koşullarında tam olarak denaturized protein refolding tarafından indüklenen hızlı bir CS toplama yol açar. Öte yandan, termal kaynaklı toplama nispeten yavaş yerli katlanmış substrat unfolding üzerinden sonuçlanır. Bu nedenle, onların kinetik parametrelerin toplama işlemleri bu farklı türleri farklı. Ayrıca, farklı chaperones yeteneklerini farklı toplama modlarında aynı substrat toplama önlemek için değişebilir.

Her iki türlü denatürasyon eklenmesi okside Hsp33 bir molar oranı 1:4 (CS: Hsp33) 360 nm okumaları ihmal edilebilir değerlere düşürücü toplama, tamamen kaldırıldı. Azaltılmış bir Hsp33 varlığı öte yandan, bir CS istikrar üzerindeki etkisi olmadı ve bir toplama eğri bir koruyucuya (Şekil 1) yokluğunda tespit benzer verdi. Sonuçları analiz ve şematik olarak Şekil 2' de açıklanan Kfits, kullanarak arka plan gürültü gelen temizledim.

Sonunda Döviz MS Analizi ve hidrojen-döteryum profil oluşturma (Şekil 3) ve refakatçi ile döteryum oksit, ardından Şoklama ve sindirim, kuluçka HDX-MS tekniği çerçevesinde başlar. HDX-MS sırasında refakatçi tepsi O içeren D2arabellekte 25 ° C'de inkübe. Robotik sistem işleme örnek tarafından kontrollü bir belirli kuluçka süre sonra protein çözüm su verme çözümü, asitli ve denaturing, transfer edildi 0 ° C'de tepsi Düşük pH ve sıcaklık düşük hidrojen Satım yavaşlatır ve düzgün sindirmek için etkinleştirme protein, denaturing kimyasal izlerken iken tüm Amid hidrojen, deuteration düzeylerini korur. Robotik sistem nerede online pepsin sindirim sütuna akar soğutma kutusuna 0 ° C'de tepsisinden örnek aktarır. Hemen sonra protein sindirimi peptidler C18-tuzak sütun desalting ve hızlı değiştirilebilen D2(esas olarak yer alan yan zinciri atomları üzerinde) O kaldırılması için geçin ve sonra C18 sütunu kullanarak ayrılır ve kitle kullanılarak analiz spektrometresi. Örnek akış 1) tarafından organik çözücüler pepsin inactivation önlemek pepsin ve C18 sütun arabellekleri ayrılması sağlar ve sağlar 2) hızlı kaldırmak için peptidler kısa desalting bir iki-valf sistemi tarafından kontrol edilir değiş tokuş edilebilir D2O molekülleri ve tuzları (Şekil 4).

Sayısal analiz sonra her peptid, deuteration profil bir değişiklik kütle D2O. kuluçka zamanında bir fonksiyonu olarak gösterilen aldığımız HDX Workbench yazılım deneysel çoğaltır karşılaştırılması (Örneğin, etkin bir koruyucuya ilişkisiz bir biçimde) her durumun istatistiksel analizleri oluşturmak için izin verir. Deuteration eğriler farklı örnekleri arasında bir karşılaştırma sonraki adımdır; Örneğin, ilişkili bir koruyucuya ve ilişkisiz bir refakatçi. Bu karşılaştırmalar farklı refakatçi devletlerin substrat bağlama eşlik yapısal tedirginlikler ortaya çıkarabilir. İlişkili devlet daha yavaş bir değişimi sergi artıkları büyük olasılıkla bir bağlama ortağı ile etkileşim vardır. Düşük hidrojen-döteryum Döviz kurları da bir bağlama olmadan gerçek doğrudan etkileşim ile belgili tanımlık substrate (Şekil 5A) belirli bir bölgeye refolding gösterebilir unutmamak gerekir. HDX Workbench yazılım sonuçları sınav "pertürbasyon" görünümünde tüm protein kapsama standart hata ile deuteration göstererek sağlar.

Bu durumda, HDX-MS deuteration desen ilişkili ve ilişkisiz refakatçi Hsp33, substrat CS için arasında karşılaştırmak için kullanıldı. Sonuçları istemci etkileşimi site içinde refakatçi (Şekil 5B) C-terminal redoks anahtarı etki ortaya koyuyor. Azaltılmış olsa da, Hsp33 etkileşim siteleri gömüldüğü tamamen sipariş edilen bir yapıya sahiptir. Hsp33 yapısını kaybeder ve oksidatif stres hissediyor işlev olur; Bu nedenle, ilişkili ve ilişkisiz koşullar (Şekil 5C) altında azaltılmış ve okside Hsp33 karşılaştırıldığında. Süre olup ilişkili veya ilişkisiz, azaltılmış Hsp33 benzer peptid eğrileri üretmek, oksitlenmiş Hsp33 önemli bir fark görüntüler sonuçlar gösterir. Oksitlenmiş Hsp33 örnekleri allosteric bir ayak bağı gösteren ilişkili protein belirli alanları ile ilişkili ve ilişkisiz refakatçi arasındaki % 30 deuteration farkı gösterir. N-terminal ve thermobile bağlayıcı bölgeleri ek peptidler analizini ek şekil 3' te gösterilmektedir.

Figure 1
Resim 1 . Işık saçılma göre toplama analiz. Kimyasal ve termal denatüre CS toplama izlenen huzurunda oksitlenmiş Hsp33 (kırmızı), Hsp33 (mavi), azaltılmış veya refakatçi (siyah) yokluğunda. Bir ışık saçılma, 360 nm 1200 için sınıf başkanı s.(a)bir koruyucuya veya azaltılmış bir Hsp33, bir plato yaklaşık 300 s ölçüm ulaşan hızla, toplanan CS varlığında yokluğunda kimyasal toplama sırasında. (B) termal toplama sırasında CS toplanan yavaş yavaş bir koruyucuya veya azaltılmış Hsp33 varlığında yokluğunda. Her iki deneyleri oksitlenmiş Hsp33 varlığını tamamen ihmal edilebilir 360-nm okuma tarafından gösterildiği toplama, kaldırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Kfits kullanarak ses ve veri analizi kaldırılması. Bu panel veri analizi ve gürültü kaldırma Kfits aracı tarafından özetleyen bir şema metin ve Rimon ve ark. açıklandığı gibi gösterir 45. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . İş akışı HDX-MS metodolojisi. HDX-MS deuterated çözücüler Amid hidrojen, birörnek dağıtılmış protein omurga kimyasal ortam belirlemek için kullanır. Protein ilgi belirli süreler için doğal haliyle deuterating arabellekte inkübe sonra hidrojen-döteryum Satım düşük ısıda asidik koşullarından söndürülür. Pepsin gibi asitli koşullarda bir enzim kararlı tarafından protein sindirilir. Daha sonra peptidler desalted ve geri bir değişimi önlemek için kısa bir süre içinde ayrılmış. Son olarak, peptidler kütle spektrometre tarafından incelenir ve döteryum alımını bir analiz yazılımı tarafından örneğin HDX Workbench özgür yazılım58tarafından değerlendirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Tam otomatik HDX-MS sisteminin bileşenleri. (A) HDX-MS bu Şematik diyagramı sistemin tüm parçalarını temsil eder: yükleme pompa ve HPLC pompa arabelleği akış denetimi ve örnek transfer sistemi içinde. Robotik sistem iki şırınga ve deuterated örnek hazırlamak ve proteinler on-line sindirim sütun üzerinden için giriş vana soğutma kutusunun (LC bölme) aktarmak için kullanılan Tepsi içerir. O zaman, sindirilmiş peptidler C18 tuzak ve ayırma sütunları yönetmen, daha sonra ayrılmış ve kütle spektrometre yönetmen. Laboratuarda oluşturulduğu şekliyle (B) Bu panel gerçek HDX sistem kurulumu gösterir. (C) Bu panel online-sindirim ve peptid ayrılık sıvı yapılandırma şematik bir sunum gösterir. Sindirim ve ayırma sistemleri her Yük ve enjekte modları arasında geçiş bir kapak var. İlk vana (solda) enjeksiyon bağlantı noktasına bağlıysa ve pepsin sütun olmadan pepsin reçine zarar verebilir herhangi bir organik çözücü asidik arabellek kullanarak içine örnekleri yönetmenlik yükleme pompa tarafından denetlenir. Gibi hızlı deuterated atomlarının (esas olarak yan zincirleri) değiş tokuş örnek değil Vana döteryum artıkları kaldırmak için tuzak sütununa aktarılır. Bir kısa yıkama tuzak sütun 1-2 dk sonra kapak yüklemek için kendi modunu değiştirir ve örnek Asetonitril konsantrasyonları artan HPLC pompa kullanarak C18 ayrılık sütununa yıkadım. Örnek toplu bir analiz için kütle spektrometre transfer edilir. Tüpler uzunluğu ile işaretlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . HDX-MS sonuçları. (A)sonuçları sunulmuştur deuteration yüzde olarak HDX Workbench yazılımı tarafından oluşturulan protein parça başına zamanla. Her grafik ya okside veya azaltılmış ve ilişkili ve ilişkisiz örnekleri arasında karşılaştırır bir protein örnek gösterir. Burada gösterilen peptid YVVITITPSEG bağlayıcı bölgede bulunan peptit ve LQVMPAQNAQQDDFD C-terminus bulundu peptid oluşuyor. (B) amino asit başına pertürbasyon ilişkili ve ilişkisiz kompleksleri arasındaki deuteration fark olarak sunulan nihai sonuçları göster. (C) A Hsp33 refakatçi yapısal model deuteration alımı arasındaki bağlayıcı ve C-terminal istikrarsız bölgeler boyunca gösterir. Bu panel PyMol yazılım kullanılarak oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 1
Ek resim 1. Arayüz kütle spektrometre işletim. Program optimize etmek ve HDX deneme için kullanılan kütle spektrometre Yöntem parametreleri tanımlamak için kullanılır. Yöntem parametreleri (sol bölmede) yönteminde öyle ki diğer programlar tarafından tanınan kaydedilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 2
Takıma giren Şekil 2. Bu şekilde bir ekran sistemi ve MS-LC sistemi teslim robot örnekleme bir entegrasyon platformu olarak hizmet veren yazılım görüntüsü gösterilir. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı deuterated arabellek (mavi oklar) tanımlanmış kuluçka zamanında takip HDX deneme planlama ile çalışma süresi en iyi duruma getirir. Örneğin, yukarıda bir deuterated bir arabellekte farklı zamanlarda için inkübe Hsp33 varyantın STIL, iki ikileştirici analizleri 17 çalışan diyagramıdır 0 - 100 dk. arasında Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 3
Takıma giren şekil 3. Bu rakam üzerinden farklı Hsp33 türevleri, birkaç Hsp33 peptidler döteryum alımını analizini gösterir PGBD ve REV34adlı. Araziler Hsp33 aynı bölgede ilişkisiz (kırmızı) ve bağlı (mavi) Birleşik döteryum alımını içinde yapılan değişiklikleri göstermektedir. Parçaları bağlayıcı bölgesinden HDX oranları gelişeceğini substrat, sitrat sentaz ile etkileşim üzerine önemli bir azalma gösterirken peptidler N-terminal bölgesinden HDX oranlarında anlamlı bir fark gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yazıda, redoks bağımlı refakatçi etkinlik analizi ve yapısal değişiklikler bir istemci protein bağlama üzerine karakterizasyonu için protokolleri sağladı. Bu potansiyel refakatçi-substrat kompleksleri tanımlamak ve olası etkileşim siteleri çözümlemek için tamamlayıcı yöntemler vardır.

Burada, biz bu protokollerin iyi okudu refakatçi substrat CS ile redoks düzenlenir refakatçi Hsp33 arasında karmaşık bir karakterizasyonu için uygulanır. Biz onların kinetik ve ilk durumda farklı protein toplama analizleri, iki farklı türde sundu: bir kimyasal denatürasyon sırasında belgili tanımlık substrate denatüre formunda, bir termal toplama iken sırasında onun açılım süreci başlar unfolding substrat yerli formundan başlatılır.

Işık saçılım ölçüleri protein toplama göreli miktarını izlemek için yararlı bir araç vardır. Biz refakatçi etkin durumunu belirlemek için bu yöntemi kullanırken, daha fazla genel toplama koşulları, farklı bir protein kararlılığını karşılaştırmak veya kararsız hale mutasyonlar substrat ve refakatçi hem de çalışma için eğitim için kullanılabilir.

Sadeliği rağmen ışık saçılma yöntemi gürültülü verilerle birkaç outliers üretebilir. Bu sorunu aşmak için yukarıda açıklanan Kfits yazılım geliştirdi. Kfits yazılım sade bir şekilde ve hızla gürültülü veri büyük miktarlarda kaldırmak yanı sıra ışık saçılma eğrisi üzerinden kinetik parametrelerin hesaplamak mümkün kılar. Kfits protein toplamak için sınırlı değildir ve kinetik ölçümleri herhangi bir türü için uygulanabilir.

Böylece, burada açıklanan yöntemleri basit, kolay gerçekleştirmek ve zaman alıcı değil. Onlar bir kaç gün içinde muayene olmak onların redoks bağımlılığı etkinleştirme farklı moleküler chaperones uygulanabilir. Ayrıca, diğer, redoks bağımlı chaperones anti-toplama etkinliği ışık saçılma ve Kfitsaçıklanan protokolleri kullanılarak değerlendirilebilir. Sıcaklık, protein konsantrasyonu ve ölçüm süresi gibi farklı parametreleri her protein sisteme bağımsız olarak ayarlanması gerektiğini unutmamak gerekir.

Bir koruyucuya döngüsü çalışmaya ilişkin yapısal bilgi kazanmak için HDX-MS metodoloji sundu. Işık saçılma yordamı, aksine bu daha karmaşık bir teknolojidir ve kütle spektrometre ve tercihen, numune hazırlama için bir robot sistemi de dahil olmak üzere belirli araçları gerektirir. Ancak, bu kurulum, varolan bir tesiste robotik sistem olmadan da kurulabilir. Oluşturulduktan sonra prosedür oldukça kolaydır ve yüksek çözünürlüklü metodolojiler tarafından (Örneğin, x-ışını ve NMR) unreached zor protein kompleksleri analiz sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar onun yararlı tartışmalar için Meytal Radzinski için müteşekkir ve kritik HDX analiz platformu kurmak onların sınırsız yardım için makale ve Patrick Griffin ve laboratuvar üyeleri için okuma. Yazarlar Almanca-İsrail Vakfı (ı-2332-1149.9/2012), iki uluslu Bilim Vakfı (2015056), Marie-Curie tümleştirme grant (618806), İsrail Bilim Vakfı için minnettar (1765/13 ve 2629/16) ve insan sınır bilim Mali destek programı (CDA00064/2014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292, (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417, (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98, (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25, (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44, (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32, (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12, (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20, (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18, (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19, (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288, (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23, (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42, (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82, (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427, (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17, (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291, (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291, (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56, (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280, (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51, (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427, (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27, (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429, (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281, (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292, (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135, (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275, (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14, (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285, (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24, (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34, (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24, (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24, (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142, (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291, (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56, (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, (9), 1512-1521 (2012).
Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter