Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at få et stort synsfelt (FOV) tre-dimensionelle (3D) Fluorescens og OCT retinal billede ved hjælp af en roman imaging multimodal platform. Vi vil indføre Systemopsætning, metoden for tilpasning og de operationelle protokoller. In vivo billeddannelse vil blive demonstreret, og repræsentative resultater vil blive leveret.
Abstract
Mens fluorescens imaging er meget udbredt i oftalmologi, er et stort synsfelt (FOV) tre-dimensionelle (3D) Fluorescens retinal billede stadig en stor udfordring med state-of-the-art retinal imaging modaliteter, fordi de ville kræve z-stacking til udarbejde en volumetrisk datasæt. Nyere optisk kohærens tomografi (OCT) og OCT angiografi (OCTA) systemer overvinde disse begrænsninger for at give tre-dimensionelle (3D) anatomiske og vaskulære billeder, men de dye-fri natur i OLT kan ikke visualisere lækage vejledende af vaskulære dysfunktion. Denne protokol beskriver en roman skrå scanning laser oftalmoskopi (oSLO) teknik, der giver 3D volumetriske fluorescens nethinde billedbehandling. Opsætningen af imaging systemet genererer den skrå scanning af en due hale skyderen og justerer den endelige billedbehandlingssystem i en vinkel til at opdage fluorescerende tværsnitsdata billeder. Systemet bruger laser scanning metode, og derfor tillader en nem indarbejdelse i OLT som en supplerende volumetriske strukturelle imaging modalitet. In vivo billeddannelse på rotte nethinden er vist her. Fluorescein løsning sprøjtes intravenøst for at producere volumetriske fluorescein angiografi (vFA).
Introduction
Oftalmologi og vision videnskab stor gavn af de moderne optiske billeddannelse teknikker, da nethinden let kan tilgås med lys. Fluorescens nethinde billedbehandling er et vigtigt redskab i diagnosticeringen og forvaltning af chorioretinal Vaskulære sygdomme såsom diabetisk retinopati (DR) og aldersbetinget makuladegeneration (AMD), som begge er førende årsager til blindhed i USA.
Det er imidlertid stadig udfordrende at erhverve et stort synsfelt (FOV), tre-dimensionelle (3D) retinal imaging ved hjælp af fluorescens billeddannelse. Fundus fotografering har ikke mulighed for løsning af dybde og afviser ikke diffuse lys. Som et resultat, reducerer en blanding af signaler fra forskellige dybde billedkvaliteten. Scanning laser oftalmoskopi (SLO) og konfokal SLO (cSLO) kan reducere effekten af diffust lys ved hjælp af Konfokal gating1. Men det er vanskeligt for SLO eller cSLO at erhverve en 3D menneskelige retinal billede på grund af grænsen på deres dybden af fokus. Adaptive optik SLO (AOSLO) kan levere fremragende opløsning og kontrast ved at korrigere for wavefront aberrationer indført af det menneskelige øje. Imidlertid skulle AOSLO stadig z-stacking til volumetriske billeddannelse2. Optisk kohærens tomografi (OCT)3 og OCT angiografi (OCTA) systemer overvinde disse begrænsninger for at give tre-dimensionelle (3D) anatomiske og vaskulære billeder4,5,6, men naturens dye-fri OLT kan ikke visualisere lækage vejledende af vaskulær dysfunktion.
Denne protokol beskriver nye multimodale platform for 3D volumetriske fluorescens nethinde tænkelig, nemlig skråt scanning laser oftalmoskopi (oSLO). I denne billedbehandlingssystem, en skrå scanning genereres af en due hale skyderen, og en afsluttende billedbehandling system er justeret i en vinkel til at opdage fluorescens cross tværsnit billeder. Systemet bruger laser scanning metoder, og disse teknikker giver mulighed for nem integration med OCT som en supplerende volumetriske strukturelle imaging modalitet. Den nuværende dybde opløsning er ca. 25 µm i rotte nethinden og synsfeltet er 30°. Det væsentlige, oSLO giver mulighed for en fluorescerende version af OLT og samtidig kan kombineres med OCT og OCTA over en stor FOV.
I denne protokol, vil vi beskrive opsætningen af oSLO, metoden for tilpasning og konstruktion, metoden for i vivo billeddannelse af rotte nethinden og de repræsentative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalg (ACUC) af Boston Medical Center.
1. Systemopsætning
- oSLO System
- Bruge en supercontinuum Laserkilde som system Laserkilde.
- Adskille det synlige lys spektrum (450-650 nm) fra højere bølgelængdeområdet (650-2000 nm) af en dichroic spejl (DM1). Udvide spektret med et par af dispersive prismer efter strålen passerer gennem en polarisering stråledeler (PBS).
- Sted en slids at vælge excitation bølgelængdeområdet (475-495 nm). Bruge en reflekterende spejl til at reflektere den filtrerede stråle tilbage til prisme par og derefter par lyset i en single-mode fiber (SMF 1).
- Brug et spektrometer til at bekræfte den bølgelængde udvalg på outputtet af single-mode fiber.
- Tilslut single-mode fiber til to overlappende optisk fiber koblinger som vist i figur 2. En af fiber outputport fra den anden fiber kobling leverer lys til oSLO-systemet.
- Collimate laser først i oSLO-systemet.
- Aflede laser af et galvanometer spejl (GM1). Relæ laser til en anden Drejespoleinstrument spejl (GM2) ved en 1:1 teleskopet, og yderligere relæ til elev i øjet ved en 3:1 teleskopet.
- Installere en dichroic spejl (DM2) inden for 3:1 teleskopet til at afspejle fluorescens-signaler.
- Montere 3:1 teleskopet og den dichroic spejl (DM2) på en tilpasset due hale skyderen til at opveje den optiske akse og oprette den skrå scanning belysning, som vist i figur 3. Bruge en skydelære til netop kontrol offset længden som ønsket.
- Fluorescens imaging optisk transmissionslængde.
- Afspejle fluorescens af dichroic spejl og relæ til den tredje Drejespoleinstrument spejl til at scanne den langsomme scanning.
- Relæ lys til en billeddannelse mål linse ved en anden 1:1 teleskopet. Installere den ovenfor optisk på en oversættelse scene.
Bemærk: To yderligere oversættelse faser er installeret under den tredje Drejespoleinstrument spejl (GM3) at give redundans i frihedsgraderne til at optimere billeddannelse.
- Montere en endelige imaging system på en scene, der har tre grader af frihed (rotation, og to akse af oversættelse). Brug en planar kamera hen til fange tværsnits fluorescens billeder.
- Bruge en supercontinuum Laserkilde som system Laserkilde.
- Optisk kohærens tomografi System
- Brug den samme supercontinuum Laserkilde som system Laserkilde.
- Adskille den i nærheden af infrarødt (NIR) interval (650-900 nm) fra de resterende lys (650-2000 nm) af en anden dichroic spejl (DM3). Bruge en lang pass filter til yderligere for at begrænse båndbredden til 800-900 nm. Par strålen i en single-mode fiber (SMF 2).
- Tilslut single-mode fiber til andre input port af de to overlappende optisk fiber koblinger til at kombinere med blå oSLO excitation. Direkte lys fra den anden outputport af den anden fiber kobling til OCT reference arm, som har en variabel neutral density filter (VNDF), dispersion kompensation plader og en reflekterende spejl.
Bemærk: Lyset tilbage fra reference arm og øjet rekombineres på den anden optisk fiber kobling og leveres til OCT spektrometer til at indsamle signalet.
- Brug den samme supercontinuum Laserkilde som system Laserkilde.
- Dataopsamling
- Bruge en data erhvervelse systemsoftware skrevet i LabVIEW og ændret fra scanning protokollen af OCTA7,8,9,10. For hver B-scanning, så en 80% intermittens tand med 500 trin er output af en analog udgang board (AO1) til at styre x' hurtig scanning spejl, GM2.
- Udløse line scan kameraet på hvert trin at erhverve data for OLT kun når spejlet er i Videresend scanning retning. Indstillet eksponeringstid for line scan kamera at være 17 µs.
- For at erhverve OCTA signal, Gentag målingen 5 gange på det samme sted, B-scan.
- Indstille AO output hastighed på 100 kHz og OCT A-line sats på 50 kHz. Styre y' langsom scanning spejl, GM1, af en ramping bølgeform. Synkronisere de-scanning spejlet, GM3, med GM1 de scanne den langsomme scanning.
- Udløse den plane kamera af en anden analog output board (AO2) til at fange en fluorescerende billedet på hver y' placering. Beskære den billeddiagnostiske størrelse eller bin nabo pixel for at forøge hastigheden og følsomhed som ønsket.
2. systemet justering
- Justere slids i oSLO lyskilde til at vælge blå excitation bølgelængden. Bruge et spektrometer til at overvåge den spektrale række til ca. 475-490 nm.
- Juster skydekontrollen due hale mount for at flytte den optiske akse af ~ 5 mm. Dette vil resultere i en forskydning, rotte elev af ~1.7 mm, hvilket resulterer i en skrå vinkel på ~ 15° på nethinden.
- Justere den oversættelse fase af fluorescens påvisning optik af den samme 5 mm.
- Justere den endelige fluorescens imaging system for at være ~ 30°.
- Måle den optiske effekt ved hjælp af en energimåler. Sørg for den blå oSLO excitation magt er ≤0.2 mW og OCT laser power ≤0.8 mW, som ikke vil beskadige nethinden.
Bemærk: Baseret på ANSI-standard, den maksimale eftergivende eksponering (MPE) til nethinden er på niveau med ~ 2mW7,8 i synligt lys område. Ifølge formlen af Delori et al. 9, den maksimalt tilladelige fejl for den i nærheden af infrarødt lys er omkring to gange højere end det synlige lys, på omkring 4 mW.
3. in Vivo animalske eksperiment
- Overføre et 12-ugers mænd lang Evans rotte i induktion kammer. Bedøver rotte med 4,5% isofluran ilt i 10 min. med en gennemstrømningshastighed på 2 L/min ved en isofluran vaporizer.
- Bekræfte dybde af anæstesi som bestemt ved en manglende tilbagetrækning refleks under en håndfladens knivspids.
- Efter induktion, placere rotten på en 5-akse (x, y, z oversættelser, yaw og pitch) indehaver. Give supplerende varme ved brug af en opvarmet fase, cirkulerende varmt vand tæppe eller anden egnet metode i et længerevarende eksperiment. Opretholde anesthesia på 1,5% af isofluorane med en gennemstrømningshastighed på 2 liter/minutter under den resterende del af forsøget. Når du ikke bruger en induktion kammer med aktiv udstødningssystem, bør induktion kammer placeres på et bord backdraft eller bordemfang eller under en snorkel til at skyllepumpetab isofluran.
- Spile eleven med 1% tropicamid oftalmologiske løsning i 2 minutter. Anvende 0,5% tetracain HCl oftalmologiske løsning på rottens øje for yderligere lokalbedøvelse, hvis det er nødvendigt. Holde øje fugtet med kommercielle kunstige tårer mindst én gang hvert minut under eksperimentet.
- Injicere fluorescein salt (10% w/w) eller FITC (10% w/w) opløses i sterilt saltvand (0,1-0,3 mL) gennem den hale vene med en 1 mL sprøjte og en 29G nål.
- Aktivere Laserkilde. Sted et filter med neutral tæthed til at dæmpe det blå lys excitation under justering. Måle magt OCT lyset til at være ~0.8 mW og det blå lys < 0,01 mW at undgå dannelse af grå stær.
- Starte tilstanden Drejespoleinstrument scanning og justering. Justere højden på øjet bolden til at gøre en stationær laser spot på hornhinden. Justere positionen rotte øje for at gøre kanten af eleven omtrent vinkelret på laser, og udligne laser til den apikale midten af øjet til om ~1.5 mm.
- Yderligere justere animalske indehaveren indtil OCT billeder når optimal kvalitet. I x' hurtig scanning retning, Sørg for at tværsnits B-scan billedet vises flade. Når du skifter til y' langsom scanning retning, Sørg for tværsnit B-scan billedet vises vippes, på grund af den skrå scanning.
- Fjerne neutralfiltre at det blå lys excitation og overvåge i realtid, feed fra kameraet. Cross Sektional fluorescerende billedet skal vises viser blodkar, der optræder i forskellige dybder.
- Justere fokus for den endelige fluorescens imaging system for at opnå optimal fokus. Tillad fine justeringer i øjenhøjde i lateralplan at nå optimale oSLO billed seriøs.
- Efter justeringen, begynde at erhverve samtidige OCTA og volumetriske fluorescein angiografi (vFA).
- Konstruere de volumetriske billeder for både OCTA og oSLO af Matlab. Algoritmerne, der er tidligere beskrevet i detaljer10. Generere dybde-løst retinale vasculatures af billedsegmentering.
- Efter færdiggører imaging, slukke laser, frigive dyret og anvende nogle oftalmologiske salve på øjne og derefter placere dyret i en recovery boks.
- Efterlad ikke dyret uden opsyn, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency eller som pr institutionelle politik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4a viser en tværsnits OCT billede af en rotte nethinden. Figur 4b -4 c viser de samme retinal tværsnitsdata billeder af OCTA og oSLO vFA erhvervet på samme tid. OSLO muliggør tværsnits FA svarer til OCT B-scan. I forhold til OCTA identificerer oSLO vFA tværsnits billedet klart fartøjer i nerve fiber lag (NFL) og ganglion cellelag (GCL) og kapillærerne i yderste plexiform lag (OPL). Figur 4 d og 4 g viser de overfladiske lag af OCTA og oSLO vFA billede. I modsætning til OCTA undgår oSLO vFA billede (figur 4 g) motion artefakter (lodrette striber i figur 4 d) ved at udnytte fluorescens emission kontrast. Ved at sammenligne oSLO vFA (figur 4e) og OCTA (figur 4 h) billeder inden for den retinale mellemliggende lag, er de vertikalt dykning fartøjer tydeligt vist i oSLO FA billede men ikke fremgår i OCTA. Dette er formentlig fordi blod flow hastighed eller fartøj orientering vil påvirke OCTA signal men ikke oSLO fluorescens kontrast.
Figur 4f og 4i Vis billeder i laget dybt kapillær plexus. Regionerne påpeget af blå pile i oSLO vFA har en bedre kontrast end OCTA i Vaskulaturen. Størrelsen af venule påpeget af hvide pile i oSLO er større end det i OCTA. Samlet set ligner oSLO vFA billede de faktiske vaskulære morfologi mere præcist end OCTA, da det ikke er afhængig af blod flow hastighed eller fartøj orientering. En da ansigt flyve-through fra to samtidigt erhvervede volumetriske datasæt fra oSLO og OCTA vises i Video 1.
Figur 1. Den skematiske ordning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fotografiet af de to overlappende fiber koblinger, der direkte oSLO og OCT lys. Ruterne i den lys pass er mærket. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Opsætningen af due hale mount for skrå belysning. (en) det solide arbejde model for skrå belysning del. (b-c) Zoomet i visningen, og visningen separat af due hale mount. (d) fotografering af den faktiske installationsprogrammet til skrå belysning del. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Rotte retinal billede erhvervet af oSLO og OCTA samtidig. Eksempel på (en) de tværsnitsbaserede billede af OLT (b) OCTA og (c) oSLO FA. Paneler (d) og (g) viser en ansigt OCT og oSLO FA billeder fra det overfladiske lag. Motion artefakter i OCTA billede blev påpeget af røde pile. Panel (e) og (h) viser resultaterne fra det mellemliggende lag. De steder, hvor fartøjer dykke i næste lag blev påpeget af gule pile, som er tydeligere på oSLO FA end OCTA. Paneler (f) og (jeg) viser resultaterne fra det dybe kapillær plexus lag. Kontrasten i oSLO er bedre end OCTA i regionen påpeget af blå pile. Størrelsen af venule påpeget af hvide pile i oSLO er større end det i OCTA. Barer i figur er 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet oSLO, en i vivo volumetriske fluorescerende retinal imaging teknik med en FOV over 30 °. I forhold til OLT, en aktuel standard for pleje imaging metode i oftalmologi, oSLO tilbyder en lignende 3D imaging kapacitet endnu tillader fluorescens kontrast, OCT ikke er følsomme over for. Fordelen ved oSLO er at det kræver kun en raster scanning, og herigennem tillader den sømløse kombination af OLT, give to supplerende teknikker til strukturelle og fluorescerende volumetriske billeddannelse.
I denne protokol er det centrale punkt at få god billedkvalitet klarhed af rotte øjet. Hvis oSLO billede sløres, undersøge, om der er kataraktdannelse. Flere faktorer såsom ketamin/xylazin anæstesi, hornhinde tørring og over-eksponering for blåt lys vil forårsage dannelse af grå stær, som ville væsentligt forringet billedkvalitet. For at forhindre grå stær, undgå vedvarende udsættelse for at blåt lys i mere end 2 minutter; anvende kunstige øje tåre mindst én gang hvert minut for at forhindre hornhinde tørring; og tillade øje hvile mindst 30 sekunder mellem billeddiagnostiske afdelinger ved at blokere for lyset.
Vi forestiller os, at oSLO væsentligt kan påvirke den kliniske praksis af fluorescens billeddannelse. Vi har vist, at dybden opløsningsevne effektivt kan fjerne signalet fra den ydre retinal giver høj kontrast volumetriske FA billeder enkelt kapillært niveau, der er uopnåelig med traditionelle SLO. Dramatisk forbedret billedklarhed ville give mulighed for mere følsomme påvisning og kvantitativ bestemmelse af blod-retina barriere forstyrrelser og retinal kapillær lækage, kendetegnende for vision-truende makulært ødem i DR og andre chorioretinal vaskulære sygdomme.
I det nuværende system, hastigheden af CCD-kamera er 20 frames per sekund, hvilket fører til > 25 sekunder erhvervelse gange. En videnskabelig CMOS kamera vil dramatisk forbedre systemets hastighed. Fluorescens påvisning har en forskellige optiske transmissionslængde adskilt fra belysning. Det vil forenkle systemet, hvis ved hjælp af den samme optiske transmissionslængde til belysning og detektion i fremtiden design. I Resumé, blev en roman multimodal platform for volumetriske retinal imaging, nemlig skråt scanning laser oftalmoskopi (oSLO), præsenteret. Den store FOV i vivo billeddannelse over en 30 ° betragtningsvinkel på rotte nethinden ved hjælp af oSLO og samtidige optisk kohærens tomografi (OCT) blev påvist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ji Yi holder en verserende patent for oSLO. Anden forfatter erklære nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansiering er fra Evans medicinsk fundament finansiering fra Boston Medical Center samt en sub-kontrakt fra NIH 5R01CA183101, BU-CTSI pilot give 1UL1TR001430, BU-Joslin pilotprogram og BU-CTSI KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
- Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C.
- Roorda, A., et al. Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
- Jia, Y., et al. Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).
- Chen, C. -L., Wang, R. K. Optical coherence tomography based angiography [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).
- Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).
- Zhang, X. Y., et al. Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer. Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).
- Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).
- Zhang, L., et al. Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO). Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).
