Summary
여기, 우리 소설 영상 복합 플랫폼을 사용 하 여 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 및 10 월 망막 이미지를 얻을 프로토콜 제시. 시스템 설치 프로그램, 정렬 방법 및 운영 프로토콜을 소개 합니다. Vivo에서 화상 진 찰 설명 될 것입니다, 그리고 대표적인 결과 제공 됩니다.
Abstract
형광 이미징 안과에서 널리 이용 된다, 하는 동안 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 망막 이미지는 여전히 그들을 z 스태킹 요구할 것 때문에 형식 이미징-의 상태--예술 망막으로 큰 도전 체적 데이터 집합을 컴파일하십시오. 새로운 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 및 10 월 제품은 (OCTA) 시스템 3 차원 (3D) 해 부 및 혈관 이미지를 제공 하기 위해 이러한 제한을 극복 하지만 10 월의 염료 무료 자연 누설 혈관의 지표를 시각화 수 없습니다. 부전입니다. 이 프로토콜 소설 간접을 스캐닝 3 차원 체적 형광 망막 영상 제공 하는 레이저 ophthalmoscopy (오슬로) 기술에 설명 합니다. 이미징 시스템의 설정을 간접 비둘기 꼬리 슬라이더에 의해 검사를 생성 하 고 형광 단면 이미지를 감지 하는 각도에서 최종 이미징 시스템을 정렬. 시스템 검색 방법, 레이저를 사용 하며 따라서, 10 월의 쉬운 법인은 보완 체적 구조 이미징 형식으로 Vivo에서 화상 진 찰 쥐 망막에는 여기에 보여 줍니다. Fluorescein 솔루션은 체적 fluorescein angiography (vFA) 생산 정 맥 주입 됩니다.
Introduction
안과 및 비전 과학 크게 혜택을 현대 광학 이미징 기법에서 때문에 망막 빛으로 쉽게 액세스할 수 있습니다. 형광 망막 영상 진단 및 둘 다 미국에 있는 장 님의 원인 선도 chorioretinal 혈관 질병 연령 관련 황 반 변성 (AMD) 및 당뇨 망막 병 증 (DR) 등의 관리에 필수적인 도구입니다.
그러나, 그것은 여전히 큰 시야 (FOV), 3 차원 (3D) 망막 형광 이미징 사용 하 여 이미지를 얻으려고 도전. 저 사진 깊이 해결 기능이 없는 확산 빛을 거부 하지 않습니다. 그 결과, 다른 깊이에서 신호를 혼합 하 여 이미지 품질을 줄일 수 있습니다. 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (SLO)와 confocal 제어1를 사용 하 여 확산된 한 빛의 효과 감소 하는 confocal SLO (cSLO) 수 있습니다. 그러나, SLO 또는 cSLO 초점의 깊이의 제한으로 인해 3D 인간의 망막 이미지를 얻기 어렵습니다. 적응 광학 SLO (AOSLO)는 인간의 눈으로 도입 wavefront 착오에 대 한 수정 하 여 뛰어난 해상도 콘트라스트를 제공할 수 있습니다. 그러나, AOSLO는 여전히 필요 z 스태킹 체적 영상2. 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)3 및 10 월 제품은 (OCTA) 시스템 제공 하는 3 차원 (3D) 해 부 및 혈관 이미지4,,56, 하지만 염료 무료 자연 이러한 제한을 극복합니다 10 월의 누설 혈관 장애의 지표를 시각화 수 없습니다.
이 프로토콜 3D 체적 형광 망막 화상 진 찰, 즉 경사 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (오슬로)에 대 한 새로운 복합 플랫폼을 설명 합니다. 이 이미징 시스템에서 비둘기 꼬리 슬라이더에 의해 생성 되는 간접 검사 하 고 최종 이미징 시스템 단면 이미지 크로스 형광을 검출 하는 각도에 정렬 됩니다. 레이저 스캐닝 방법, 사용 하 고 이러한 기술을 보완 체적 구조 이미징 적임으로 oct 쉽게 설립 허용. 현재 깊이 해상도 쥐 망막에서 약 25 µ m 이며, 보기의 필드는 30 ° 이다. 기본적으로, 오슬로 형광 버전 10 월의 고 동시에 10 월 결합 될 수 있다 및 큰 FOV 동안 OCTA.
이 프로토콜에서 오슬로, 정렬 및 건설의 방법, vivo에서 쥐 망막의 이미징 방법 및 대표 결과의 설정을 설명 합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) 보스턴 의료 센터에 의해 승인 되었습니다.
1. 시스템 설치
- 오슬로 시스템
- Supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.
- Dichroic 거울 (DM1)에 의해 더 높은 파장 범위 (650-2000 nm)에서 보이는 빛 범위 (450-650 nm)를 구분 합니다. 편광 빔 스플리터 (PBS)를 통과 하는 광선 후 흩어진 프리즘의 쌍으로 스펙트럼을 확장 합니다.
- 여기 파장 범위 (475-495 nm)를 선택 하는 슬릿을 배치 합니다. 반사 거울을 사용 하 여 프리즘 쌍을 다시 필터링 된 광선을 반영 하 고 다음 단일 모드 광섬유 (SMF 1)으로 빛을 커플.
- 분 광 계를 사용 하 여 단일 모드 광섬유의 출력에서 파장 선택 확인.
- 그림 2와 같이 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러를 단일 모드 광섬유를 연결 합니다. 두 번째 섬유 커플러에서 섬유 출력 포트 중 하나는 오슬로 시스템에 빛을 제공합니다.
- 오슬로 시스템에서 먼저 레이저를 당기기.
- 검 류 계 미러 (GM1)으로 레이저를 편향. 릴레이 1:1 망원경 시스템에 의해 두 번째 검 류 계 미러 (GM2) 레이저 그리고 3:1 망원경 시스템에 의해 눈의 눈동자를 더 릴레이.
- 시스템 내에서 3:1 망원경 형광 신호에 맞게 dichroic 거울 (DM2)를 설치 합니다.
- 광 축 오프셋을 간접 조명 그림 3에서 같이 검색을 만들 사용자 지정된 비둘기 꼬리 슬라이더에 3:1 망원경 시스템 및 dichroic 거울 (DM2)를 탑재 합니다. 캘리퍼스를 사용 하 여 정확 하 게 제어할 원하는 대로 오프셋된 길이.
- 형광 이미징 광학 경로입니다.
- Dichroic 거울과 느린 스캔 스캔 드 3 검 류 계 미러 릴레이 의해 형광을 반영 합니다.
- 또 다른 1:1 망원경 시스템 이미징 대물 렌즈에 빛을 릴레이 합니다. 번역 단계에서 위의 광학을 설치 합니다.
참고: 두 개의 추가 번역 단계 3 검 류 계 미러 (GM3)는 이미지를 최적화 하기 위한 자유도에 중복을 제공 하기에 설치 됩니다.
- 3 자유도 (회전, 그리고 번역의 두 축)은 무대에서 최종 이미징 시스템을 탑재 합니다. 평면 카메라를 사용 하 여 횡단면 형광 이미지를 캡처합니다.
- Supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.
- 광학 일관성 단층 촬영 시스템
- 동일한 supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.
- 가까운 적외선 (NIR) 범위 (650-900 nm) 나머지 빛 (650-2000 nm)에서 다른 dichroic 거울 (DM3) 구분 합니다. 긴 패스 필터를 사용 하 여 800-900 nm 대역폭 제한에. 단일 모드 광섬유 (SMF 2)에 빔 커플.
- 단일 모드 섬유 블루 오슬로 여기와 결합 하 여 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러의 다른 입력된 포트에 연결 합니다. 직접 변수 중립 밀도 필터 (VNDF), 분산 보상 접시와 반사 거울 OCT 참조 팔 두 번째 섬유 커플러의 두 번째 출력 포트에서 빛.
참고: 빛 참조 팔에서 반환 그리고 눈 두 번째 광섬유 커플러에서 recombines 신호를 수집 하는 OCT 분석기에 전달 됩니다.
- 동일한 supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.
- 데이터 수집
- 사용 데이터 수집 시스템 소프트웨어를 LabVIEW에서 그리고 OCTA7,8,,910의 검사 프로토콜에서 수정 합니다. 각 B-스캔에 대 한 80% 듀티 사이클 500 단계와 치아 x를 제어 하는 아날로그 출력 보드 (AO1)에 의해 출력은 본 ' 빠른 스캐닝 미러, GM2.
- OCT에 대 한 데이터를 얻기 위해 각 단계에서 라인 스캔 카메라를 트리거 거울은 검색 방향을 전달에서 하는 경우에. 라인 스캔 카메라 17 µs에 대 한 노출 시간을 설정 합니다.
- OCTA 신호를 획득, 5 번 같은 B-스캔 위치에서 측정을 반복 합니다.
- 50 kHz에서 100 khz, AO 출력 속도 10 월 라인 속도 설정 합니다. Y 제어 ' 느린 스캔 거울, GM1, 램프 파형에 의해. GM1 드 느린 스캔 스캔 스캔 드 미러, GM3, 동기화.
- 다른 아날로그 출력 보드 (AO2) 한 형광 이미지 각 y에 의해 평면 카메라를 트리거 ' 위치. 이미지 크기 자르기 또는 증가 속도 감도 원하는 대로 이웃 픽셀을 빈.
2. 시스템 맞춤
- 블루 여기 파장 선택 오슬로 광원에서 슬릿을 조정 합니다. 주위에 스펙트럼 범위를 모니터링 하는 분석기를 사용 하 여 475-490 nm.
- 비둘기 꼬리 마운트 슬라이더 ~ 5 m m에 의해 광 축 변화를 조정 합니다. 이 쥐 눈동자에 오프셋 ~1.7 m m, 결과 망막에 ~ 15 °의 경사 각도에 의해 발생 합니다.
- 같은 5 m m 형광 검출 광학의 번역 단계를 조정 합니다.
- 최종 형광 이미징 시스템 ~ 30 ° 되도록 조정 합니다.
- 전력 측정기를 사용 하 여 광 출력을 측정 합니다. 블루는 오슬로 전원을 ≤0.2 mW 및 OCT 레이저 전원 ≤0.8 mW는 망막 손상을 일으키지 것입니다 있는지 확인 합니다.
참고: ANSI 표준에 따라, 망막에 최대 허용 노출 (MPE)의 수준 이다 ~ 2mW7,8 빛 보이는 범위에서. Delori 그 외 여러분 에 의해 수식에 따라 9, MPE 근처 적외선 빛은 가시 광선 보다 약 2 배 높은 약 4 mW.
3. Vivo에서 동물 실험
- 12 주 남성 긴 에반스 쥐 유도 챔버로 전송 합니다. Isoflurane 기화에 의해 2 L/min의 유량과 10 분 동안 산소에 4.5 %isoflurane 쥐를 anesthetize.
- 인터 핀치 동안 철수 반사의 부족에 의해 결정 된 마 취의 깊이 확인 합니다.
- 유도, 후 5-축 (x, y, z 번역, yaw 및 피치) 보유자에 쥐를 놓습니다. 열띤된 무대, 순환 온수 담요 또는 장기간된 실험에 적합 한 다른 방법을 사용 하 여 추가 열을 제공 합니다. 실험의 나머지 부분 동안 2 리터/분의 유량과 isofluorane의 1.5%에서 마 취를 유지 합니다. 액티브 배기 유도 챔버를 사용 하지 않는 때 유도 챔버 청소 isoflurane에 스노 클 또는 backdraft 또는 하강 기류 테이블에 배치 되어야 합니다.
- 2 분 동안 1 %Tropicamide 안과 솔루션 눈동자 같은데요. 필요한 경우 추가 취에 대 한 쥐의 눈에 0.5% Tetracaine HCl 안과 솔루션을 적용 합니다. 실험 기간 동안 적어도 한 번 모든 분 상용 인공 눈물 moisturized 눈을 유지.
- Fluorescein 소금 (10 %w / w) 또는 FITC 주입 (10 %w / w) 멸 균 식 염 수에 희석 (0.1-0.3 mL) 1 mL를 꼬리 정 맥을 통해 주사기와 29 G 바늘.
- 레이저 소스를 켭니다. 장소는 중립 밀도 필터 정렬 하는 동안 블루 빛 자극을 감소. ~0.8 mW 수 10 월 빛과 푸른 빛의 전력을 측정 < 0.01 mW 백 내장의 형성을 피하기 위해.
- 검 류 계 스캐닝 및 맞춤 모드를 시작 합니다. 고정 된 레이저 각 막에 자리 만들려고 눈 볼의 높이 조정 합니다. 레이저에 대략 수직 눈동자의 테두리를 만들 수 쥐 눈 위치를 조정 하 고 오프셋 ~1.5 m m에 대 한 눈을의 꼭대기 센터 레이저.
- 10 월 이미지 최적의 품질에 도달할 때까지 더 동물 홀더를 조정 합니다. X에서 ' 단면 B-스캔 이미지 평면 나타나는지 확인 빠른 스캔 방향. Y을 전환할 때 ' 느린 스캔 방향, 단면 B-스캔 이미지 표시 기울어진, 비스듬한 검색으로 확인.
- 블루 라이트 여기에 중립 밀도 필터를 제거 하 고 실시간으로 카메라에서 피드를 모니터링 합니다. 교차 단면 형광 이미지 보여주는 혈관 다른 깊이에 나타나는 나타납니다.
- 최종 형광 이미징 최적의 초점을 도달 하는 시스템의 초점을 조정 합니다. 미세 조정 최적의 오슬로 이미지 품질에 도달 하는 측면 평면에서 눈 위치를 허용 합니다.
- 맞춤, 후 동시 OCTA와 체적 fluorescein angiography (vFA)를 시작 합니다.
- OCTA를 Matlab으로 오슬로 체적 이미지를 생성 합니다. 세부10이전 알고리즘 설명 합니다. 이미지 세분화 하 여 깊이 해결 망막 vasculatures를 생성 합니다.
- 완료 후는 이미징, 레이저 해제, 동물 하 고는 눈에 일부 안과 연 고를 적용 놓고 복구 상자에서 동물을 배치.
- 두지 마십시오 동물 무인 또는 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 기관 정책에 당.
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Representative Results
그림 4a 쥐 망막의 단면 OCT 이미지를 보여줍니다. 그림 4b -4 c 를 동시에 취득 하는 OCTA 및 오슬로 vFA의 동일한 망막 단면 이미지를 표시 합니다. 오슬로 횡단면 FA를 유사한 10 월 B-스캔 수 있습니다. OCTA, 비해 오슬로 vFA 단면 이미지는 신경 섬유 층 (NFL)와 신경 절 세포 층 (GCL), 혈관과 모세 혈관 외부 plexiform 레이어 (OPL)에 명확 하 게 식별합니다. 그림 4 d 와 4 g OCTA 및 오슬로 vFA 이미지의 표면 층을 보여준다. OCTA, 달리 오슬로 vFA 이미지 (그림 4 g) 형광 방출 대비를 이용 하 여 모션 아티팩트 (수직 줄무늬 그림 4d에서)를 방지 합니다. 오슬로 vFA (그림 4e)와 망막 중간 계층 내에서 OCTA (그림 4 h) 이미지 비교, 수직 다이빙 선박 오슬로 FA 이미지에만 하지 OCTA에 명백한 명확 하 게 표시 됩니다. 이 아마도 혈액 흐름 속도 또는 선박 방향에 영향을 줍니다 OCTA 신호 하지만 오슬로 형광 대비 하지 때문입니다.
그림 4 층 및 4i 깊은 모 세관 신경 총 계층 내에서 이미지를 표시합니다. 오슬로 vFA에 파란색 화살표에 의해 지적 지구는 맥 관 구조에 OCTA 보다 더 나은 대조에 있다. 오슬로에서 흰색 화살표로 지적 venule 크기 OCTA 보다 큽니다. 전반적으로, 오슬로 vFA 이미지와 유사 하지만 실제 혈관 형태 OCTA, 보다 더 정확 하 게 혈액 흐름 속도 또는 선박 방향에 의존 하지 않기 때문. en 얼굴 플라이-통해 서 오슬로 OCTA에서 두 개의 동시에 획득된 체적 데이터 집합에서 비디오 1에 표시 됩니다.
그림 1입니다. 시스템 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 오슬로 10 월 빛 두 개의 캐스케이드 섬유 커플러의 사진. 빛 통과 노선 표시 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 간접 조명 위한 비둘기 꼬리 마운트의 설치. 간접 조명 부분에 대 한 (는) 단단한 작업 모델. (b-c) 확대 보기 고 비둘기 꼬리 마운트의 별도 보기. (d)의 간접 조명 부분에 대 한 실제 설치 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 오슬로 OCTA는 동시에 인수 하는 쥐 망막 이미지. 10 월 (b) OCTA의 (a) 단면 이미지의 예 고 (c) 오슬로 FA. 패널 (d) 및 (g) en 얼굴 10 월 및 표면 층에서 오슬로 FA 이미지를 표시합니다. OCTA 이미지에서 모션 아티팩트는 빨간색 화살표에 의해 지적 되었다. 패널 (e)와 (h) 중간 계층에서 결과 보여줍니다. OCTA 보다 오슬로 FA에 명확 하 게는 노란색 화살표로 혈관 다음 계층으로 다이빙 위치 했다 지적 했다. 패널 (f)와 (나) 깊은 모 세관 plexuses 계층에서 결과 보여줍니다. 오슬로의 명암은 파란색 화살표에 의해 지적 영역에 OCTA 보다 낫다. 오슬로에서 흰색 화살표로 지적 venule 크기 OCTA 보다 큽니다. 그림에 바는 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리가 오슬로 vivo에서 체적 형광 망막 상상 이상 30 ° FOV와 기법을 설명 했습니다. 10 월, 관리 인, 방법 이미징의 현재 표준에 비해 오슬로 비슷한 3D 이미징 기능을 제공 합니다 아직 10 월에 과민 하지 않다 형광 대비 수 있습니다. 오슬로의 장점은 하나의 래스터 스캔을 요구 하 고 따라서 구조 및 형광 체적 영상에 대 한 두 개의 상호 보완적인 기법을 제공 하는 10 월의 완벽 한 결합 수 있습니다.
이 프로토콜에서 좋은 이미지 품질을 얻기 위해 핵심은 쥐 눈의 선명도. 오슬로 이미지 가려진 경우 백 내장 형성 여부를 검사 합니다. 케 타 민/xylazine 마 취, 각 막 건조, 라이트 블루를 노출 등 여러 가지 요인 백 내장, 화질 저하 크게 것의 형성을 원인이 됩니다. 2 분 이상;에 대 한 라이트 블루를 지속적인 노출을 피하는 백 내장을 방지 하 인공 눈 눈물 적어도 한 번 모든 분을 적용 방지 각 막 건조; 눈 빛을 차단 하 여 이미징 섹션 사이 적어도 30 초 휴식을 허용 하 고.
우리는 오슬로 형광 이미징의 임상 연습 영향 크게 수 그리 다. 우리는 표시 분해능 깊이 효과적으로 외부 망막에서 신호를 제거할 수 있습니다 체적 FA 이미지는 기존의 SLO에 얻을 수 있는 단일 모 세관 수준까지 떨어졌다. 극적으로 향상 된 이미지 선명도 혈관 더 민감한 감지 및 혈액 망막 방 벽 장애 및 망막 모 세관 누설의 정량화, 박사 및 다른 chorioretinal에 황 반 부 종 비전 위협의 특징에 대 한 허용 질병입니다.
현재 시스템에서 CCD 카메라의 속도에 이르게 초당 20 프레임입니다 > 25 초 수집 시간. 과학적인 CMOS 카메라도 시스템 속도 향상 시킬 것입니다. 형광 탐지는 다른 광학 경로 조명에서 분리. 그것은 조명 및 검출 미래에 대 한 동일한 광학 경로 사용 하 여 디자인 하는 경우 시스템을 단순화 합니다. 요약 하자면, 즉 경사 레이저 ophthalmoscopy (오슬로), 검사 체적 망막 화상 진 찰에 대 한 새로운 복합 플랫폼 제시 했다. 오슬로 동시 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 사용 하 여 쥐 망막의 30 °의 시야각을 통해 이미징 비보에 큰 FOV 시연 했다.
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Disclosures
지 이순신 오슬로 대 한 보류 중인 특허를 보유 하고있다. 다른 저자는 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
자금 인 NIH 5R01CA183101에서 하위 계약 뿐만 아니라 보스톤 의료 센터에서 에반스 의료 재단 자금에서 부 CTSI 파일럿 1UL1TR001430, 부 Joslin 파일럿 프로그램, 및 부 CTSI KL2TR001411를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
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