Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para obter um grande campo de visão (FOV) tridimensional (3D) fluorescência e imagem retiniana OCT usando uma romance plataforma multimodal de imagens. Apresentaremos na configuração do sistema, o método de alinhamento e os protocolos operacionais. Imagem latente na vivo será demonstrada, e serão fornecidos resultados representativos.
Abstract
Enquanto imagens de fluorescência é amplamente utilizada em oftalmologia, uma grande campo de visão (FOV) da imagem retiniana tridimensional (3D) de fluorescência é ainda um grande desafio com o estado-da-arte retinal imaging modalidades porque eles exigiria z-empilhamento para Compile um conjunto de dados volumétrico. Nova tomografia de coerência óptica (OCT) e sistemas de angiografia (OCTA) OCT superar estas restrições para fornecer imagens tridimensionais (3D) anatômicas e vasculares, mas a natureza sem corantes da OCT não pode visualizar o escapamento indicativo de vascular disfunção. Este protocolo descreve um romance oblíquo verificação técnica de laser Oftalmoscopia (oSLO) que fornece a imagem da retina de fluorescência volumétrico 3D. A instalação do sistema de geração de imagens gera o oblíquo digitalização por um botão deslizante cauda de pomba e alinha o sistema final de imagem em um ângulo para detectar imagens transversais fluorescentes. O sistema usa o método de exploração do laser e portanto, permite uma fácil incorporação de OCT como uma modalidade de imagem estrutural volumétrica complementar. In vivo da imagem na retina do rato é demonstrada aqui. Solução de fluoresceína é injetada por via intravenosa para produzir angiografia fluoresceína volumétrico (AGV).
Introduction
Oftalmologia e visão ciência beneficiar muito das modernas técnicas de imagem ópticas, uma vez que a retina pode ser facilmente acessada com luz. Imagem latente retinal da fluorescência é uma ferramenta essencial no diagnóstico e na gestão de choriorétiniennes doenças vasculares tais como a retinopatia diabética (DR) e degeneração macular relacionada à idade (DMRI), ambos os quais são principais causas de cegueira nos Estados Unidos.
No entanto, é ainda um desafio para adquirir um grande campo de visão (FOV), tridimensional imagem usando imagens de fluorescência da retina (3D). Fotografia do fundo não tem a capacidade de resolução de profundidade e não rejeita luz difusa. Como resultado, a mistura de sinais de profundidade diferente reduz a qualidade da imagem. Digitalização Oftalmoscopia do laser (SLO) e confocal pode SLO (cSLO) reduz o efeito de luz difusa usando confocal associada1. No entanto, é difícil para SLO ou cSLO para adquirir uma imagem da retina humana 3D devido ao limite de sua profundidade de foco. Óptica adaptativa SLO (AOSLO) pode fornecer excelente resolução e contraste, corrigindo as aberrações de frente de onda introduzidas pelo olho humano. No entanto, AOSLO ainda precisaria de z-empilhamento para imagiologia volumétrica2. OCT angiografia (OCTA) sistemas de coerência óptica tomografia computadorizada (OCT)3 e superar estas restrições para fornecer tridimensional (3D) imagens anatômicas e vascular4,5,6, mas a natureza sem corantes de outubro não posso Visualizar escapamento indicativo de disfunção vascular.
Este protocolo descreve uma romance plataforma multimodal para retinal fluorescência volumétrico 3D de imagem, ou seja, oblíqua digitalização laser Oftalmoscopia (oSLO). Neste sistema da imagem latente, uma digitalização oblíqua é gerado por um controle deslizante cauda de pomba, e um sistema de imagem final é alinhado em um ângulo para detectar fluorescência Cruz imagens secionais. O sistema utiliza métodos de exploração do laser, e essas técnicas permitem a fácil incorporação com OCT como uma modalidade de imagem estrutural volumétrica complementar. A resolução de profundidade atual é de cerca de 25 µm na retina do rato e o campo de visão é de 30°. Essencialmente, o oSLO permite uma versão fluorescente de outubro e podem ser combinados simultaneamente com OCT e OCTA sobre um grande FOV.
Neste protocolo, descreveremos a configuração de oSLO, o método de alinhamento e de construção, o método de imagem na vivo da retina de ratos e os resultados representativos.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) de Boston Medical Center e cuidado Animal.
1. configuração do sistema
- Sistema de oSLO
- Use uma fonte de laser de supercontinuum como a fonte de sistema laser.
- Separe a gama de luz visível (450 a 650 nm) do intervalo de comprimento de onda maior (650-2000 nm) por um espelho dicroico (DM1). Expanda o espectro com um par de Prismas dispersivos após o feixe passa através de um divisor de feixe de polarização (PBS).
- Lugar uma fenda para selecionar o intervalo de comprimento de onda de excitação (475-495 nm). Use um espelho reflector para refletir o feixe filtrado para o par de prisma e em seguida um par a luz em uma fibra monomodo (SMF 1).
- Use um espectrómetro para confirmar a seleção do comprimento de onda na saída da fibra monomodo.
- Conectar-se a fibra de modo único para dois acopladores em cascata fibra óptica conforme mostrado na Figura 2. Um da porta de saída da fibra do acoplador da fibra segundo fornece a luz para o sistema de oSLO.
- Desbloqueem o laser primeiro no sistema de oSLO.
- Desvie o laser por um espelho de galvanômetro (GM1). Relé do laser para um segundo espelho de galvanômetro (GM2) por um sistema de telescópio de 1:1 e ainda mais relé para a pupila do olho por um sistema de telescópio de 3:1.
- Instale um espelho dicroico (DM2) dentro do sistema 3:1 telescópio para refletir os sinais de fluorescência.
- Monte o sistema do telescópio de 3:1 e o espelho dicroico (DM2) em um slider de cauda de pomba personalizado para compensar o eixo óptico e criar o oblíquo digitalização iluminação conforme mostrado na Figura 3. Use uma pinça para controlar com precisão o comprimento de deslocamento conforme desejado.
- Imagem caminho óptico de fluorescência.
- Refletir a fluorescência pelo espelho dicroico e retransmissão para o terceiro espelho galvanômetro de digitalizar o escaneamento lento.
- Relé da luz de uma lente objetiva de imagem por um outro sistema de telescópio de 1:1. Instale a ótica acima em um estágio da tradução.
Nota: Dois estágios de translação adicionais são instalados sob o terceiro espelho galvanômetro (GM3) para fornecer redundância nos graus de liberdade para otimizar a imagem.
- Monte um sistema de imagem final num palco que tem três graus de liberdade (rotação e dois eixos da tradução). Use uma câmera planar para capturar as imagens de fluorescência transversal.
- Use uma fonte de laser de supercontinuum como a fonte de sistema laser.
- Sistema de tomografia de coerência óptica
- Use a mesma fonte de laser de supercontinuum como a fonte de sistema laser.
- Separe próximo intervalo infravermelho (NIR) (900-650 nm) a luz remanescente (650-2000 nm) por outro espelho dicroico (DM3). Use um filtro passe longo para limitar ainda mais a largura de banda de 800-900 nm. Casal do feixe em uma fibra monomodo (SMF 2).
- Conecte a fibra de modo único a outra porta de entrada dos dois engates em cascata de fibra óptica para combinar com a azul da excitação de oSLO. Direcionar a luz do segundo porto saída do segundo acoplador da fibra para o braço de referência OCT, que tem um filtro de densidade neutra variável (VNDF), placas de compensação de dispersão e um espelho reflector.
Nota: A luz voltou do braço de referência e o olho recombina no segundo acoplador da fibra óptica e é entregue para o espectrómetro de OCT para coletar o sinal.
- Use a mesma fonte de laser de supercontinuum como a fonte de sistema laser.
- Aquisição de dados
- Use um software de sistema de aquisição de dados escrito em LabVIEW e modificado do protocolo de verificação de OCTA7,8,9,10. Para cada B-scan, um ciclo de trabalho de 80% vi dente com 500 passos é a saída por uma placa de saída analógica (AO1) para controlar o x' espelho de varredura rápido, GM2.
- Acionar a câmera de varredura de linha em cada etapa para adquirir dados da TOC só quando o espelho está na frente direção de digitalização. Defina o tempo de exposição para a câmera de varredura de linha para ser 17 µs.
- Para adquirir o sinal do OCTA, repita a medição 5 vezes no mesmo local B-scan.
- Defina a taxa de saída AO 100 kHz e a taxa de uma linha de OCT de 50 kHz. Controlar o y' espelho varredura lento, GM1, por uma subida de forma de onda. Sincronize o espelho de varredura, GM3, com GM1 de digitalizar o escaneamento lento.
- Acionar a câmera planar por uma outra placa de saída analógica (AO2) para capturar uma imagem fluorescente em cada y' local. O tamanho da imagem latente de culturas ou bin os pixels vizinhos para aumentar a velocidade e a sensibilidade como desejado.
2. sistema alinhamento
- Ajuste a ranhura na fonte luminosa de oSLO para selecionar o comprimento de onda de excitação azul. Use um espectrómetro para monitorar a faixa espectral para ser ao redor 475-490 nm.
- Ajuste a barra de montagem de cauda de pomba para deslocar o eixo óptico por ~ 5 mm. Isso resultará em um deslocamento para o aluno de rato por ~1.7 mm, resultando em um ângulo oblíquo de ~ 15° na retina.
- Ajuste o estágio da tradução da ótica de deteção de fluorescência a mesma 5 mm.
- Ajuste a fluorescência final de imagem de sistema para ser ~ 30°.
- Medir a potência óptica usando um medidor de energia. Certifique-se que o poder de excitação de oSLO azul é ≤ 0.2 mW e o OCT laser poder ≤0.8 mW, que não causará dano de retina.
Nota: Baseado no padrão ANSI, a exposição máxima permissiva (MPE) para a retina é a nível de ~ 2mW7,8 na faixa de luz visível. De acordo com a fórmula por Delori et al . 9, o MPE para o infravermelho próximo é cerca de duas vezes maior do que a luz visível, em cerca de 4 mW.
3. in Vivo experimento Animal
- Transferi um rato Evans longo masculino de 12 semanas na câmara de indução. Anestesia o rato com 4,5% de isoflurano em oxigênio por 10 minutos com uma vazão de 2 L/min por um vaporizador de isoflurano.
- Confirme a profundidade de anestesia conforme determinado pela falta de reflexo de retirada durante uma pitada interdigital.
- Após a indução, coloque o rato sobre um suporte de 5 eixos (x, y, z traduções, guinada e arremesso). Fornece calor suplementar pelo uso de uma fase aquecida, circula água quente cobertor ou outro método adequado em uma experiência prolongada. Manter a anestesia em 1,5% de isofluorano com uma vazão de 2 litros/minutos durante a parte restante do experimento. Quando não utilizar uma câmara de indução com ativo de exaustão, câmara de indução deve ser colocada sobre uma mesa backdraft ou do downdraft ou sob um snorkel para eliminar o isoflurano.
- Dilate a pupila com solução oftálmica de tropicamida 1% por 2 minutos. Aplica 0,5% HCl tetracaína solução oftálmica no olho do rato para a anestesia local adicional, se necessário. Mantenha o olho hidratado com lágrimas artificiais comerciais pelo menos uma vez cada minuto durante o experimento.
- Injetar fluoresceína sal (10% w/w) ou FITC (10% w/w) diluído em solução salina estéril (0.1-0.3 mL) na veia da cauda com um 1 mL seringa e um 29G agulha.
- Ligue a fonte de laser. Coloque um filtro de densidade neutra para atenuar a excitação de luz azul durante o alinhamento. Medir o poder da OCT para ser ~0.8 mW e a luz azul < 0,01 mW para evitar a formação de catarata.
- Inicie o modo de digitalização e alinhamento do galvanômetro. Ajuste a altura da bola olho para fazer um laser estacionário mancha na córnea. Ajuste a posição do olho de rato para fazer a borda da pupila aproximadamente perpendicular ao laser e compensar o laser ao centro apical do olho de aproximadamente ~1.5 mm.
- Mais ajuste o animal titular até imagens OCT alcançar qualidade ideal. No x' rápida digitalização direção, certifique-se de que a imagem de B-varredura transversal aparece plana. Ao alternar para o y' slow direção de digitalização, verifique se a imagem de B-scan de secção transversal aparece inclinada, devido a digitalização oblíqua.
- Retire o filtro de densidade neutra para a excitação de luz azul e monitorar o alimentação da câmera em tempo real. Imagem fluorescente secional transversal deve aparecer mostrando vasos aparecendo em diferentes profundidades.
- Ajuste o foco da fluorescência final de imagem de sistema para atingir o foco ideal. Permitem ajustes finos da posição do olho no plano lateral para alcançar uma qualidade de imagem ideal oSLO.
- Após o alinhamento, inicie a aquisição simultânea OCTA e angiografia fluoresceína volumétrico (AGV).
- Construa as imagens volumétricas para OCTA e oSLO pelo Matlab. Os algoritmos são descritos anteriormente no detalhe10. Gere vasculatures da retina profundidade-resolvido por segmentação de imagens.
- Depois de completar a imagem, desligar o laser, liberar o animal e aplicar uma pomada oftálmica nos olhos e em seguida, coloque o animal em uma caixa de recuperação.
- Não deixe o animal autônoma até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal ou como por política institucional.
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Representative Results
Figura 4a mostra uma imagem de OCT transversal de uma retina do rato. Figura 4b -4 c mostram as mesmas imagens transversais da retina de vFA OCTA e oSLO adquiridos ao mesmo tempo. O oSLO permite transversal FA análoga para o B-scan da OCT. Em comparação com OCTA, a imagem de corte transversal de vFA oSLO identifica claramente os vasos na camada de fibras nervosas (NFL) e a camada de células ganglionares (GCL) e capilares na camada plexiforme exterior (OPL). Figura 4 d e 4G mostram a camada superficial da imagem de vFA OCTA e oSLO. Ao contrário de OCTA, a imagem de vFA de oSLO (Figura 4 g) evita os artefatos de movimento (listras verticais na Figura 4-d), utilizando o contraste de emissão de fluorescência. Comparando o AGV oSLO (Figura 4e) e imagens OCTA (Figura 4 h) dentro da camada intermediária da retina, os vasos verticalmente mergulho são claramente demonstrados na imagem oSLO FA mas não aparente no OCTA. Isto é provavelmente porque a velocidade do fluxo de sangue ou a orientação da nave vai afetar o sinal OCTA, mas não o contraste da fluorescência de oSLO.
Figura 4f e 4i mostram as imagens dentro da camada de plexo capilar profunda. As regiões apontadas por setas azuis em oSLO vFA têm um melhor contraste que OCTA na vasculatura. O tamanho da Vénula apontado por setas brancas em oSLO é maior do que em OCTA. Em geral, a imagem de vFA oSLO assemelha-se a morfologia vascular real mais precisão do que OCTA, pois não é dependente da velocidade do fluxo de sangue ou a orientação da nave. Um rosto pt voar através de dois simultaneamente adquirida conjunto de dados volumétricos de oSLO e OCTA são mostrados no vídeo 1.
Figura 1. O sistema esquemático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A fotografia dos dois acopladores de fibra em cascata que direto de oSLO e PTU luz. As rotas da passagem de luz são rotuladas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A configuração de montagem de cauda da pomba para iluminação oblíqua. (um) o trabalho sólido modelo para a parte de iluminação oblíqua. (b-c) A zoom-in e a visualização separada da montagem da cauda da pomba. (d) a fotografia da instalação do real por parte de iluminação oblíqua. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Adquirida pela oSLO e OCTA, ao mesmo tempo da imagem retiniana rato. O exemplo de (um) a imagem transversal da OCT (b), OCTA e (c) FA de oSLO. Painéis (d) e (g) mostram rosto pt OCT e imagens de oSLO FA da camada superficial. Os artefatos de movimento na imagem OCTA foi indicado por setas vermelhas. Painel (e) e (h) mostram os resultados da camada intermediária. Os locais onde as embarcações mergulham próxima camada foram indicados por setas amarelas, que são mais claras em oSLO FA do OCTA. Painéis (f) e (eu) mostram os resultados da camada profunda capilar plexos. O contraste de oSLO é melhor que OCTA na região indicada por setas azuis. O tamanho da Vénula apontado por setas brancas em oSLO é maior do que em OCTA. Bares na figura é 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos a oSLO, na vivo volumétrico fluorescente imagem da retina técnica com um FOV mais de 30 °. Comparado a OCT, um padrão atual de atendimento imagem método em oftalmologia, oSLO oferece um semelhante de imagem capacidade 3D ainda permite o contraste de fluorescência que OCT não é sensível a. A vantagem de oSLO é que requer apenas uma digitalização raster e, portanto, permite a combinação perfeita de PTU, fornecendo duas técnicas complementares para imagiologia volumétrica estrutural e fluorescente.
Neste protocolo, o ponto-chave para obter boa qualidade de imagem é a clareza do olho do rato. Se a imagem de oSLO é obscurecida, verifica se há formação de catarata. Vários fatores como anestesia cetamina/xilazina, secagem da córnea e excesso de exposição à luz azul irão causar formação de catarata, que significativamente deteriorar a qualidade da imagem. Para prevenir a catarata, evitar a exposição contínua ao azul de luz por mais de 2 minutos; aplicar lágrima artificial olho pelo menos uma vez a cada minuto para evitar a secagem de córnea; e permitir que o olho descansar pelo menos 30 segundos entre as seções de imagens, bloqueando a luz.
Vislumbramos que oSLO pode significativamente impactar a prática clínica de imagiologia de fluorescência. Mostramos que a profundidade resolvendo poder pode efetivamente eliminar o sinal proveniente do exterior da retina, produzindo imagens de FA volumétricas alto contraste até o nível capilar único, que é inatingível com SLO convencional. A clareza de imagem melhorada dramàtica permitiria uma deteção mais sensível e quantificação de sangue-retina barreira interrupções e retiniana capilar escapamento, a marca do edema macular visão ameaçadora no DR e outros choriorétiniennes vascular doenças.
No sistema atual, a velocidade da câmera CCD é 20 frames por segundo, o que leva a > 25 segundo tempos de aquisição. Uma câmera CMOS científica melhorará drasticamente a velocidade do sistema. A deteção de fluorescência tem um diferente caminho óptico separado da iluminação. Isso irá simplificar o sistema, se usar o mesmo trajecto óptico para a iluminação e a detecção no futuro design. Em resumo, uma romance plataforma multimodal para volumétrica de imagem da retina, ou seja oblíqua digitalização laser Oftalmoscopia (oSLO), foi apresentada. Demonstraram-se a grande FOV em vivo imagens sobre um ângulo de 30 ° da retina de rato usando oSLO e tomografia de coerência óptica simultânea (OCT).
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Disclosures
Ji Yi detém uma patente pendente para oSLO. O outro autor (es) declara sem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Financiamento é o financiamento de fundação Evans médica do centro médico de Boston, bem como um sub contrato de NIH 5R01CA183101, piloto de BU-CTSI conceder 1UL1TR001430 e programa piloto Joslin BU BU-CTSI KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
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