Summary
Здесь мы представляем протокол получить большое поле зрения (FOV) трехмерной (3D) флуоресценции и OCT сетчатки изображения с помощью Роман изображений Мультимодальная платформа. Мы будем вводить настройки системы, метод выравнивания и оперативные протоколы. В естественных условиях изображений будет продемонстрирована, и представитель результаты будут предоставлены.
Abstract
Хотя флуоресценции изображений широко используется в офтальмологии, большое поле зрения (FOV) трехмерной (3D) флуоресценции сетчатки изображение по-прежнему является большой проблемой с сетчатки искусства, визуализации формы потому, что они будут требовать, z укладка для Скомпилируйте объемный набор данных. Новая оптическая когерентная томография (Окт) и систем ангиография (OCTA) октября преодолеть эти ограничения представить трехмерные (3D) анатомические и сосудистой изображения, но краска бесплатный характер OCT не может визуализировать утечки свидетельствует о сосудистых дисфункция. Этот протокол описывает Роман косой, сканирование лазерная техника офтальмоскопия (Осло), которая обеспечивает 3D объемного флуоресценции сетчатки изображений. Настройка системы визуализации генерирует косой, сканирование слайдер хвост голубь и выравнивает окончательной визуализации системы под углом для обнаружения флуоресцентные поперечные изображения. Система использует лазерный метод сканирования и таким образом, позволяет легко включение октября как взаимодополняющие объемные структурных изображений модальности. В естественных условиях изображения на сетчатке крыс показано здесь. Флуоресцеин раствора внутривенно вводят производить объемные fluorescein ангиография (vFA).
Introduction
Офтальмология и видение науки значительно выиграть от современные оптические методы визуализации, так как могут быть легко доступны сетчатки с светом. Флуоресценции сетчатки изображений является важным инструментом в области диагностики и управления хориоретинальной сосудистых заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия (DR) и возрастной макулярной дегенерации (AMD), оба из которых являются ведущие причины слепоты в Соединенных Штатах.
Однако это все еще сложно приобрести большое поле зрения (FOV), трехмерные (3D) сетчатки изображений с помощью флуоресценции изображений. Фундус фотография не имеют возможности урегулирования глубины и не отвергают диффузный свет. В результате микширование сигналов от разных глубины снижает качество изображения. Сканирующий лазер офтальмоскопия (SLO) и конфокальный SLO (cSLO) может уменьшить эффект рассеянного света с помощью конфокальной шлюзовой1. Однако это трудно для SLO или cSLO, чтобы получить 3D изображения человека сетчатки вследствие ограничения их глубины фокуса. Адаптивная оптика SLO (AOSLO) может обеспечить превосходное разрешение и контрастность путем исправления аберраций волнового фронта, представленный человеческий глаз. Однако AOSLO по-прежнему потребуется z укладка для объемного изображения2. Оптическая когерентная томография (Окт)3 октября ангиография (OCTA) систем и преодолеть эти ограничения представить трехмерные (3D) изображения анатомических и сосудистой4,5,6, но краска бесплатный характер октября не может визуализировать утечки ориентировочные сосудистые дисфункции.
Этот протокол описывает Роман Мультимодальная платформа для 3D объемного флуоресценции сетчатки воображения, а именно наклонный сканирование лазерная офтальмоскопия (Осло). В этой системе визуализации наклонный сканирование генерируется ползунок хвост голубь, и окончательной визуализации системы выравнивается в угол обнаружения флуоресценции кросс-секционные изображений. Эта система использует лазерные методы проверки, и эти методы позволяют легко включения с октября как взаимодополняющие объемные структурных изображений модальности. Текущее разрешение глубина около 25 мкм в сетчатке крыса и поле зрения составляет 30°. По существу, Осло позволяет флуоресцентные версии OCT и одновременно может сочетаться с октября и оста над большой ПЗ.
В этом протоколе мы будем описывать установку Осло, метод выравнивания и строительства, метод в vivo томография сетчатки крыс и представитель результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) из Бостонского медицинского центра.
1. системы установки
- Система Осло
- Используйте в качестве системы лазерного источника суперконтинуум лазерного источника.
- Отделите видимого света диапазона (450-650 Нм) от выше диапазона длин волн (650-2000 Нм), дихроичное зеркало (DM1). Расширьте спектр с парой Дисперсионные призмы после луч, проходя через splitter луча поляризации (PBS).
- Место щели, чтобы выбрать диапазон волны возбуждения (475-495 нм). Используйте Светоотражающий зеркало, чтобы отразить отфильтрованных луч обратно в призму пар и затем пара свет в одномодового волокна (SMF 1).
- Используйте спектрометр для подтверждения выбора длины волны на выходе одномодового волокна.
- Одномодового волокна соединить две муфты каскадом волоконно-оптических, как показано на рисунке 2. Один из порта вывода волокна от второго волокна стяжка обеспечивает свет к системе Осло.
- Collimate лазер сначала в системе Осло.
- Отвлечь лазер, зеркальный гальванометр (GM1). Реле лазер второй зеркальный гальванометр (GM2) 1:1 телескоп системы и далее реле для зрачка глаза системой телескоп 3:1.
- Установите дихроичное зеркало (DM2) в системе 3:1 телескоп для отражения сигналов флуоресценции.
- Смонтируйте систему телескоп 3:1 и дихроичное зеркало (DM2) на индивидуальные голубь хвост ползунок компенсировать оптической оси и создать косой, сканирование освещенности, как показано на рисунке 3. Используйте суппорт для точного управления смещения длины по желанию.
- Флуоресценции изображений оптического пути.
- Отражать флуоресценции дихроичное зеркало и реле третьего зеркальный гальванометр для исключения из проверки медленное сканирование.
- Реле света изображения объектива другой системой телескоп 1:1. Установка выше оптика на этапе перевода.
Примечание: Этапы два дополнительных перевода устанавливаются под третьего зеркальный гальванометр (GM3) для обеспечения избыточности в степеней свободы для оптимизации изображения.
- Смонтировать систему окончательной визуализации на сцене, которая имеет три степени свободы (вращение и две оси перевода). Используйте плоские камеру для захвата изображений поперечного сечения флуоресценции.
- Используйте в качестве системы лазерного источника суперконтинуум лазерного источника.
- Оптическая когерентная томография системы
- Используйте один и тот же источник лазера суперконтинуум как системы лазерного источника.
- Отделите ближнего инфракрасного диапазона (NIR) (650-900 нм) от остальных света (650-2000 Нм), другой дихроичное зеркало (дм3). Используйте фильтр длинный пас для дальнейшего ограничения пропускной способности до 800-900 нм. Пара пучка в одномодового волокна (SMF 2).
- Подключите одномодового волокна к другой входной порт две муфты каскадом волоконно-оптических сочетать с голубой Осло возбуждения. Прямой свет от второго вывода порта второй стяжку волокна на руке ссылка OCT, который имеет фильтр нейтральной плотности переменной (VNDF), дисперсия компенсации пластины и отражающих зеркал.
Примечание: Свет вернулся из ссылки рука и глаз разбивку на втором муфты оптического волокна и доставляется в Сен-спектрометр для сбора сигнал.
- Используйте один и тот же источник лазера суперконтинуум как системы лазерного источника.
- Сбор данных
- Использование данных приобретение системы программного обеспечения написана в LabVIEW и изменения от сканирующий протокола окта-7,-8,-9,-10. Для каждого B-скан, 80% ПВ увидел зуб с 500 шагов вывода аналогового вывода Советом (AO1) для управления x' быстрого сканирования зеркало, GM2.
- Триггер линии сканирования камеры на каждом шаге для получения данных для развертывания Office только тогда, когда зеркало находится в переднем направлении сканирования. Установите время экспозиции для линии сканирования камеры быть 17 МКС.
- Для получения сигнала OCTA, повторите измерение 5 раз в том же месте B-скан.
- Установите АО показатель на 100 кГц и уровень OCT-line на 50 кГц. Управление y' медленно сканирования зеркало, GM1, наращивает сигнала. Исключения из сканирования зеркало, GM3, синхронизируйте с GM1 для исключения из проверки медленное сканирование.
- Триггер Вселенский камеры Советом еще один аналоговый выход (AO2), чтобы захватить один флуоресцентного изображения на каждом y' местоположение. Кадрирование изображений размер или Бен сосед пикселей для увеличения скорости и чувствительности по желанию.
2. Система выравнивания
- Отрегулируйте щели в Осло источник света для выбора длины волны голубые возбуждения. Используйте спектрометр для мониторинга спектральный диапазон около 475-490 Нм.
- Ползунок горе хвост голубь, который Сдвиг оптической оси на ~ 5 мм. Это приведет к смещение на ученик крыса, ~1.7 мм, что приводит к косой угол ~ 15° на сетчатке.
- Настройте перевод этапе флуоресценции обнаружения оптики, же 5 мм.
- Отрегулируйте окончательный флюоресценция системы быть ~ 30°.
- Измерения оптической мощности, с помощью измерителя мощности. Убедитесь, что синий мощность возбуждения Осло ≤0.2 МВт и OCT лазера мощностью ≤0.8 МВт, которая не вызовет повреждения сетчатки.
Примечание: Основываясь на стандарте ANSI, максимальный разрешительных (ПДВ) для сетчатки соответствует на уровне ~ 2МВт7,8 в видимом диапазоне света. Согласно формуле, Delori и др. 9, ПДВ для ближнего инфракрасного света примерно в два раза выше, чем видимый свет, в около 4 МВт.
3. в естественных условиях животных эксперимент
- Передача 12-недель крыса мужчина долго Эванс в камеру всасывание. Анестезировать крыс с изофлюрановая 4,5% кислорода в течение 10 минут с скорости потока 2 Л/мин, изофлюрановая испарителем.
- Подтвердите глубины анестезии определяется отсутствием ухода рефлекс при межпальцевых пинча.
- После индукции место крысы на держатель 5-оси (x, y, z переводы, рыскания и тангажа). Обеспечивают дополнительное тепло с помощью Подогреваемый столик, циркулирующих одеяло теплой воды или другой подходящий метод в длительный эксперимент. Поддержание анестезии на 1,5% isofluorane с скорость потока 2 л/мин в течение оставшейся части эксперимента. Когда не используете камеру всасывание активных выхлопа, индукции камеры должны быть помещены на таблицу Обратная тяга или нисходящего движения или под трубку, чтобы очистить изофлюрановая.
- Разбавить ученик с 1% Тропикамид офтальмологический раствор на 2 минуты. Применить офтальмологический раствор HCl тетракаин 0,5% на крыс глаз для дополнительных местной анестезией, в случае необходимости. Держите глаза, увлажненной с коммерческой искусственные слезы по крайней мере один раз каждую минуту во время эксперимента.
- Придать флуоресцеин соли (10% w/w) или FITC (10% w/w) разводят в стерильного физиологического раствора (0,1-0,3 мл) через Вену хвост с 1 мл раствора иглу шприца и 29G.
- Включите источник лазера. Место фильтр нейтральной плотности для ослабления синий свет возбуждения во время выравнивания. Измерения силы света OCT быть ~0.8 МВт и синий свет < 0,01 МВт, чтобы избежать формирования катаракты.
- Запустите режим проверки и выравнивание гальванометра. Отрегулируйте высоту глаз мяч, чтобы сделать стационарных лазерного пятна на роговице. Отрегулируйте положение глаз крыса сделать обод ученика примерно перпендикулярно лазер и компенсировать лазер в апикальной центр глаза о ~1.5 мм.
- Далее настройте владельца животного до тех пор, пока Окт изображения достичь оптимального качества. В x' быстрое сканирование направление, убедитесь, что поперечного сечения B-скан изображения отображается плоской. При переключении на y' медленно сканирования направление, убедитесь, что сечение B-скан изображения появляется наклонена, благодаря наклонный сканирования.
- Удалите фильтр нейтральной плотности для синего света возбуждения и контролировать в реальном времени, кормить из камеры. Крест секционные флуоресцентные изображение должно появиться показаны кровеносных сосудов, появляясь в разных глубинах.
- Отрегулируйте фокус заключительном флуоресцирования, визуализации системы для достижения оптимального фокуса. Дать точную регулировку положения глаз в боковой плоскости для достижения оптимального качества изображения Осло.
- После выравнивания начинают приобретать окта одновременное и объемные fluorescein ангиография (vFA).
- Постройте объемных изображений для OCTA и Осло на Matlab. В деталях10ранее описаны алгоритмы. Генерировать сетчатки vasculatures, глубина решена путем сегментации изображений.
- После завершения обработки изображений, выключите лазер, освободить животных и применять некоторые глазная мазь на глазах и затем поместите животное в окне восстановления.
- Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency или за институциональной политики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 4a показывает поперечного сечения OCT изображение сетчатки крыс. Рисунок 4b -4 c показывают же сетчатки поперечные изображения окта- и Осло vFA, приобретенных в то же время. Осло позволяет поперечного сечения FA аналогии в OCT Б-скан. По сравнению с OCTA Осло vFA поперечного сечения изображения четко идентифицирует судов в слой нервных волокон (НФЛ) и слоя клеток ганглия (GCL) и капилляров в внешний сплетениевидный слой (ОБН). Рисунок 4 d и 4 g Показать поверхностный слой изображения vFA окта- и Осло. В отличие от оста Осло vFA изображения (Рисунок 4 g) позволяет избежать артефакты движения (вертикальные полосы в рисунке 4 d), используя флуоресценции выбросов контраст. Сравнивая Осло vFA (Рисунок 4e) и окта (рис. 4 h) изображения в пределах сетчатки промежуточного слоя, вертикально Дайвинг судов четко показано на изображении FA Осло, но не проявляется в оста. Это предположительно потому, что скорость потока крови или направление судна будет влиять на сигнал OCTA, но не контраст флуоресценции Осло.
Рисунок 4f и 4i показывают изображения в слое глубоко капиллярного сплетения. Регионы, указал на синие стрелки в Осло vFA имеют лучшую контрастность, чем OCTA в сосудистую. Размер венулы, указал на белые стрелки в Осло больше чем в оста. В целом образ vFA Осло напоминает фактической сосудистой морфология более точно, чем OCTA, так как это не зависит от скорости потока крови или направление судна. En лицом летать через от двух одновременно приобретенные объемный набор данных от Осло и оста показаны в видео 1.
Рисунок 1. Схема системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Фотография двух стяжки каскадом волокна, которые направляют Осло и света OCT. Помечены маршрутов прохода света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Настройка горе хвост голубь для наклонного освещения. () твердых работы модель для части наклонной освещения. (b-c) Увеличенное представление и отдельный вид горе хвост голубь. (d) фотографии фактической установки для наклонного освещения часть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Крыса сетчатки приобретена Осло и OCTA в то же время изображение. () Поперечного сечения изображения пример октября (b) OCTA и (c) Англии Осло. Панели (d) и (g) показывают лицо en OCT и Осло FA изображения из поверхностного слоя. Движение артефакты в оста изображения было отмечено красными стрелками. Группа (e) и (h) показывают результаты от промежуточного слоя. Местах, где суда погрузиться следующий слой указала на Желтые стрелки, которые на Осло FA яснее OCTA. Панели (f) и (я) показывают результаты от глубоких капиллярного сплетения слоя. Контраст Осло лучше чем OCTA в регионе отмечал синие стрелки. Размер венулы, указал на белые стрелки в Осло больше чем в оста. Бары на рисунке – 200 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали Осло, в естественных условиях объемного флуоресцентные сетчатки изображений технику с ПЗ свыше 30 °. По сравнению с октября, текущий стандарт медицинской помощи визуализации метод в офтальмологии, Осло предлагает аналогичные 3D визуализации возможность еще позволяет флуоресценции контраст, что октября не чувствителен к. Преимущество Осло заключается в том, что он требует только одного растрового сканирования и таким образом позволяет бесшовные сочетание OCT, обеспечивая два взаимодополняющих методов для структурного и флуоресцентные объемных изображений.
В этом протоколе ключевой момент, чтобы получить хорошее качество изображения является четкость глаз крыса. Если Осло изображение закрывается, проверьте ли есть катаракты. Несколько факторов, такие как кетамин/Ксилазина анестезии, роговицы сушки и чрезмерное воздействие синий свет приведет к образованию катаракты, которые значительно ухудшится качество изображения. Чтобы предотвратить катаракту, Избегайте непрерывного воздействия на синий свет на более чем 2 минуты; Применение искусственного глаза слезы по крайней мере один раз каждую минуту для предотвращения высыхания роговицы; и глаза на отдых минимум 30 секунд между изображений разделами, блокируя свет.
Мы предполагаем, что Осло может существенно повлиять на клинической практике флуоресценции изображений. Мы показали, что глубина, разрешающая способность может эффективно устранить сигнала от внешнего сетчатки, уступая высококонтрастные изображения объемных FA до уровня единого капилляров, которая является недоступным с обычными SLO. Значительно улучшена четкость позволит более чувствительным выявления и количественной оценки утечки крови сетчатки барьер дезорганизации и сетчатки капилляров, отличительной чертой видение угрожая макулярного отека в DR и другие хориоретинальной сосудистой заболевания.
В текущей системе, скорость камеры на ПЗС-20 кадров в секунду, что приводит к > 25 второй раз приобретения. Научно CMOS камера будет значительно улучшить скорость системы. Флуоресценции обнаружения имеет другой оптический путь отделены от освещения. Он будет упростить систему, если с помощью одного оптического пути для освещения и обнаружения в будущем дизайн. В резюме Роман Мультимодальная платформа для объемного сетчатки воображения, а именно наклонный сканирование лазерная офтальмоскопия (Осло), был представлен. Была продемонстрирована большая ПЗ в vivo изображений над 30 ° угол крыса сетчатки с использованием Осло и одновременного оптическая когерентная томография (Окт).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ji Yi имеет отложенный патент на Осло. Другие авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Финансирование осуществляется из Эванс медицинский фонд финансирования от Бостонского медицинского центра, а также договор субподряда от НИЗ 5R01CA183101, Бу-CTSI пилот Грант 1UL1TR001430, Бу-Джослин пилотной программы и Бу-CTSI KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
- Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C.
- Roorda, A., et al. Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
- Jia, Y., et al. Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).
- Chen, C. -L., Wang, R. K. Optical coherence tomography based angiography [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).
- Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).
- Zhang, X. Y., et al. Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer. Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).
- Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).
- Zhang, L., et al. Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO). Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).
