Summary
Biz bir tek hücre tabanlı 3 boyutlu (3D) olmayan derleme bir yapay iskele oluşturmak için yeni bir yöntem göstermek.
Abstract
Rejeneratif tıp ve doku mühendisliği dirençli hastalıkların tedavisi için birkaç avantaj sunar ve çeşitli çalışmalarda 3 boyutlu (3D) hücresel derlemeler bu alanlardaki önemini göstermiştir. Yapay iskele kez 3D hücresel derlemeler oluşturmak için kullanılmaktadır. Ancak, hücresel derlemeler oluşturmak için kullanılan iskele bazen zehirlidir ve hücre özelliklerini değiştirebilir. Böylece, hücre-hücre iletişim kolaylaştırmak için bir non-toksik Yöntem kurmak faydalı olacaktır. Bu yazıda, istikrarlı hücresel derlemeler dextran ile Optik cımbız kullanarak oluşturmak için yeni bir yöntem sunar. Bu yöntemin avantajları, birkaç dakika içinde kararlı hücre hücre iletişim kurar biridir. Bu yeni yöntem inşaat 3D hücresel birleştirici bir doğal hidrofilik polimer sağlar ve yeni nesil 3D tek hücreli derlemelerde rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanlarında oluşturmak için yararlı olacağı tahmin edilmektedir.
Introduction
İnsan doku hücrelerinin birkaç derlemelerinin oluşmaktadır ve vücudun homeostazı korumak için yardımcı olabilir iken, kendileri tarafından tek hücre hücre hücre etkileşim yoluyla da önemli rol oynarlar. Bu nedenle, tek hücreler dış sinyalleri tarafından uyarılmış ve yapışık diğer hücrelere böyle sinyallerini aktarmak nasıl aydınlatmak önemlidir. Bu amaç için birkaç yöntem tek hücre tabanlı 3 boyutlu (3D) derlemeler1,2,3,4,5,6 yapımı için kurulmuş olan ,7,8. Ancak, hücresel derlemeler oluşturmak için kullanılan malzemeler hala geliştirilebilir. Örneğin, sentetik jelleri ve polimerler Polietilen glikol (PEG) dahil olmak üzere bazı kimyasal fizikokimyasal özelliklere sahip ve hedef hücreleri (Örneğin, toksisite) etkileyebilir.
Biz son zamanlarda istikrarlı hücre-hücre iletişim9kurarak dextran (DEX) kullanarak hücreleri tek hücre tabanlı 3D derleme üretebilir bir roman sistem bildirdi. Düşündüğümüz bu teknoloji rejeneratif tıp ve hatta kanser biyoloji de dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarında yararlı olabilir. Bu raporda, biz nasıl biz tek hücreleri manipüle ve 3 boyutlu (3D) hücresel derlemeler DEX yapay bir iskele de dahil olmak üzere çeşitli hidrofilik biomacromolecules huzurunda oluşturmak açıklar.
Protocol
1. hücre hazırlanması
- NAMRU fare meme bezi epitel hücreleri (NMuMG) D-MEM içeren %10 (v) fetal Sığır serum (FBS) ve (v) penisilin-streptomisin (P/S) 25 cm3 şişe içinde % 1 5 mL ile bakımını yapar. Kaldır Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (D-MEM), %10 FBS ve % 1'i içeren P/S.
- 37 ° C fosfat tamponlu tuz (PBS) (-) 3-5 mL şişe için ekleyin. PBS pH 7,1-7,3 olduğuna dikkat edin.
- Tüm PBS bir aspiratör kullanarak balonun kaldırın.
- 37 ° C tripsin (%0.25, w/v) 1,5 mL şişe için ekleyin.
- Şişeye CO2 kuluçka 37 ° C'de yaklaşık 1-2 dakika için kuluçkaya.
- D-MEM %10 FBS ve % 1'i içeren 3,5 mL ekleyin P/S şişeye için. Pipet karıştırmak için.
- Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü aktarmak ve oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi. Dönme yarıçapı ve santrifüj rotasyon hızı 16.6 cm ve 1500 devir/dakika, sırasıyla olduğunu unutmayın. Bu durum altında göreli merkezkaç kuvveti 417 x g olduğunu.
- 5 mL taze D-MEM ekleyin (%10 FBS ve % 1 P/S) için orta aspirating sonra şişeye (cryopreservation çözüm, üreticinin yönergeleri izleyerek hücrelerle gerekirse, cryopreserve).
2. Dextran (DEX) hazırlanması
- D-MEM 10 mL karıştırılarak 80 mg/mL DEX çözeltisi hazırlamak (% 10 FBS, 1%P/S) ve DEX 0.8 gr. DEX çözüm olan bir şırınga filtre (0,22 µm) filtre uygulanabilir Not hücreleri için yeterli bir süre kültürlü sonra.
- DEX çözüm 200 µL ve 2.1 hazırlanan hücre süspansiyon 200 µL karıştırılarak 40 mg/mL DEX orta içeren bir hücre süspansiyon hazırlamak. Çözüm hücrelerde sayı yoğunluğu yaklaşık 2.3 × 10 Not5 hücre/mL.
3. lazer ve mikroskopi hazırlık
- (Sürekli dalga, 1,064 nm dalga boyu) üzerine lazer açın (Şekil 1bir). Bir lazer ışını yakın kızılötesi bölgesi için kırmızı bir dalga boyu ile kullanımını en etkili olduğuna dikkat edin; en az hücreleri tarafından emilir beri bu dalga boyu bölge tanı ve tedavi edici pencere10 denir.
- Yazılımı simgesini çift tıklatın.
- ① Kamera, ② ışık yayan diyot (LED), ③ odak için simgeleri ayarlamak çift tıklatmak ve ④ sahne alanı. ①-④ için karşılık gelen görüntüler (Şekil 1bkadar) gösterir.
4. bindirme lazer sistemi kullanarak hücre işleme
- Yer 20 µL adım 2.2 alt kapak cam üzerinde hazırlanan örnek (0,17 mm kalınlık, boyutu = 30 mm × 40 mm) ve ile üst kapak cam kapak (0,17 mm kalınlık, boyutu = 18 mm × 18 mm), iki çubukları (0,17 mm kalınlığında tarafından sağlanan ayırmalı Boyut = 10 mm × 24 mm), Şekil 2' de gösterildiği gibi. Not Bu gözlük özel bir kaplama gerektirmez.
- Adım 4.1 alt objektif Lens üzerinde hazırlanan örnek yerleştirin (su daldırma ile ca. 10 μl, büyütme = 60 X, çalışma mesafesi 0,28 mm, sayısal diyafram = 1,2 =)).
- Üst objektif lens takmak (su daldırma ile ca. 10 μl, büyütme = 60 X, çalışma mesafesi 2 mm, sayısal diyafram = = 1.0) örnek hücrenin üstündeki.
- LED ışık 2 (Şekil 1b) simgesini tıklatarak açın.
- Panelde 3 (resim 1b) simgelerini tıklatarak örnek ve alt objektif lens arasındaki mesafeyi ayarlamak odak olana.
- Lazer ışınları pozisyon 1 ve pozisyon 2 (Şekil 1B) örnek yanında tıkırtı Simgeler ı, II ve III (Şekil 1b) ışınlatayım.
- Her lazer ışını yoğunluğunu ayarlamak için 1500 mW simgesinin IV (Şekil 1b) Bu değer girerek.
- Hareket simgesi 4 gösteren Yön (Şekil 1b) kadar bir hücreyi tıklatarak örnek sahne (Şekil 1b) konum 1'de mahsur kaldı.
- Sürükle kadar başka bir hücre konumu 2 (Şekil 1b) gösteren imleç konumu 2'de kapana kısılmış.
5. 3 boyutlu (3D) hücre yapısı inşaatı
- Böylece temas başka bir hücreyi tek bir hücrede işlemek. Bu durum için 300 korumak s; her hücre bir lazer için 300 maruz Yani, s.
- Şekil 1bgösterilen X-Y ekseni kaydı.
- Rasgele 2D hücre derleme yakalayarak ve hücreleri başka bir hücreye taşıma oluşturun.
- Sahne alanı yukarı ve aşağı hareket ettirerek bir 3D hücresel derleme oluşturun.
- Lazer kapalı sonra derleme istikrarlı kalır onaylayın.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan yazılım ve mikroskop Şekil 1 gösterir. Şekil 2 hücreleri içeren örnek çözümü yerleştirmek için yordamı, şematik bir gösterimidir. Şekil 3 çift Lazer Optik cımbız kullanarak bir piramit yapı oluşumu gösterir. Deneme başarılı olursa, lazer bile kapalı sonra hücresel bu derlemeler kararlı kalır.
Resim 1 : (a) yakalama lazer sistemi için kontrol sistemi (NanoTracker2 (11)). Sistem aşağıdaki adımları ① ③ lazer anahtarı çevirerek etkinleştirilir. (b) yakalama lazer sistemi kontrol etmek için yazılım. Kamera, LED ışık, odak ayarlamak ve sahne alanı aktif simgeler ① ②, ③ ve ④, sırasıyla tıklatarak. Mikroskobik görüntü 1 panelinde görüntülenir. LED açık/kapalı kontrol Masası'nda 2 içindir. Odağı panel 3 kontrol edilir. Lazer ışınları pozisyonları 1 ve 2 simgelerini tıklatarak ışınlanmış ben IV. Bu lazer Systemare yakalama ayrıntılarını Ref. (12) sağlanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: slayt cam yerleştirmek için temsilcisi şematik. Örnek (dextran içeren hücre süspansiyon) 20 µL slayt üzerinde yerleştirilir ve lazer işleme için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : bir) epitel hücreleri (NMuMG) istenen bir şeklin bir ortamda derlemelerinin DEX (40 mg/mL) ile: bir piramit bir 3D küme örnek olarak gösterilir. b) piramit şeklindeki 3D hücresel derleme şematik bir figürü de gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu da çalışmanın çözünen polimerler kullanımı 3D tek hücreli derlemeler inşası için bizim son raporları9,11 beton bir uygulama gösterir. Hücre sayısı 10 ve tek lazer ışını tarafından düzenlenen bu tür derlemeleri stabil toplu çözüm oluşur. 10'dan fazla hücreler olduğunda derlemeler cam yüzeyde çökelti. Deneyler hala ilkel bir aşamasında olmakla birlikte, biz roman metodoloji hücre biyolojisi alanında ilerleme için vazgeçilmezdir yeni nesil 3D tek hücreli derlemeler inşası için güçlü bir araç olabilir beklemek ve rejeneratif tıp.
Hiçbir polimer içeren bir çözümde hücre yüzey ücret, hidrasyon itme gücü, glycocalyx itme etkisi ve membran kıvrım kaynaklanan elektrostatik itme nedeniyle birbirlerine püskürtmek. Bizim önceki çalışma cep çiftleri otelde hücreleri PEG ile tedavi edilir uzun süre kararlı olduğunu gösterdi. Daha da önemlisi, bir hücre çift bir bölgeye hücreleri temas halinde 5 dakika içinde PEG, için düzenlenen sonra PEG, olmadan başarılı taşıma hücresel iletişim istikrarlı bir şekilde korunur öneriyor. Bu iyi açısından tükenmesi etkisi11açıklanmıştır ve temelde aynı mekanizma DEX9kullanılarak oluşturulan hücresel derlemeler için geçerlidir. Geçerli sonuçlarımız doğal oluştururlar, diğer tür de istikrarlı 3D hücresel derlemeler oluşturmak için kullanılan olabilir öneririz.
Polimer konsantrasyon hücreleri, komut istemi aktarımı için önemlidir. Genel olarak, polimer örtüşme konsantrasyon çözüldüğünde viskozite çözüm büyük ölçüde artırır. Bu durum altında Optik cımbız kullanarak hücreleri manipüle etmek zordur. Bu nedenle, deneme örtüşme konsantrasyon altında yapılmalıdır. Bir DEX için çakışma konsantrasyon ca. çözümdür 50 mg/mL (kinetik viskozite ise 5.5 mm2/s). DEX konsantrasyonu 10 mg/mL 40 mg/ml yaşındayken Ref. 9'da gösterildiği gibi istikrarlı bir hücresel derleme gözlendi. Bu sonuç tükenmesi etkisi bile DEX konsantrasyon örtüşme konsantrasyonu düşük olduğunda istikrarlı hücre-hücre temas korumak için yeterince büyük olduğunu göstermektedir. DEX ek hücre canlılığı 40 mg/mL 9' a etkilemez gösterilmiştir.
3D hücresel derlemeler inşası için bir yöntem kurulması rejeneratif tıp alanında önemli bir vivo içinde taklit beri tek hücre yapılanması tarafından hücresel microenvironment kök hücre kaynaklı doku kolaylaştırabilir oluşumu. Şimdiye kadar Neuro2A hücreleri9 NMuMG hücreleri ek olarak kullanarak hücresel derlemeler oluşturmak için mevcut protokolü kullanmış. Hücresel derlemelerinin 3D: çeşitli türleri morfoloji hücreleri daha çok sayıda oluşturmak için deneysel bir metodoloji kurmak istiyoruz. Ichikawa vd tarafından geliştirilen Optik cımbız sistemi hücreleri yönünü kontrol edilebilir bu yana 13 bu amaç için geçerli olacaktır. Bu doğrultuda daha fazla denemeler umut verici olmalıdır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Shu Hashimoto, Aoi Yoshida ve Taeko Ohta Doshisha Üniversitesi'nde deneysel Kur ile cömert yardım için teşekkür ederiz. Bu iş için özel üniversitelerde Stratejik Araştırma Vakfı tarafından KAKENHI (15 H 02121, 15 K 05400, 25103012, 50587441) ve MEXT-Supported Program tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda KNOW (önde gelen Ulusal Araştırma Merkezi) bilimsel konsorsiyum "Sağlıklı hayvan - güvenli gıda", Bilim Bakanlığı ve Yükseköğretim No 05-1/KNOW2/2015 kararı Lehçe hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
