Summary
Vamos demonstrar um método novo para a construção de um assembly para single-cell-based 3-dimensional (3D) sem um andaime artificial.
Abstract
Engenharia de tecidos e medicina regenerativa oferecem várias vantagens para o tratamento de doenças intratáveis, e diversos estudos têm demonstrado a importância de 3-dimensional (3D) celular módulos (assemblies) nestes campos. Andaimes artificiais, muitas vezes têm sido utilizados para construir conjuntos celulares 3D. No entanto, os andaimes usados para construir conjuntos celulares são às vezes tóxicos e podem alterar as propriedades das células. Assim, seria benéfico estabelecer um método não-tóxico para facilitar o contato célula-célula. Neste trabalho, apresentamos um novo método para a construção de módulos (assemblies) celular estável usando Pinça óptica com dextrano. Uma das vantagens deste método é que estabelece contato de célula para célula estável em poucos minutos. Este novo método permite a construção de módulos (assemblies) celular 3D em um polímero hidrofílico natural e é esperado para ser útil para construir a próxima geração 3D assemblies de célula única nos campos da engenharia de tecidos e medicina regenerativa.
Introduction
Enquanto os tecidos humanos são compostos de vários conjuntos de células e podem ajudar a manter a homeostase do organismo, células únicas por si também desempenham papéis importantes através de interação célula a célula. Portanto, é importante elucidar como únicas pilhas podem ser estimuladas por sinais externos e como eles transferir tais sinais a outras células aderentes. Para este efeito, foram estabelecidos vários métodos para a construção de single-cell-based 3-dimensional (3D) módulos (assemblies)1,2,3,4,5,6 ,7,8. No entanto, os materiais que são usados para construir conjuntos celulares ainda podem ser melhorados. Por exemplo, géis sintéticas e polímeros incluindo polietileno glicol (PEG) possuam certas propriedades químicas e físico-químicas e podem afetar células-alvo (por exemplo, toxicidade).
Recentemente, informou um novo sistema que poderia gerar um assembly de single-cell-based 3D de células usando o dextran (DEX) através do estabelecimento de contato célula-célula estável9. Consideramos que esta tecnologia pode ser útil em vários campos de pesquisa, incluindo até mesmo câncer biologia e medicina regenerativa. Neste relatório, descrevemos como manipular células únicas e construir 3-dimensional (3D) celular módulos (assemblies) na presença de várias macromoléculas hidrofílicas incluindo DEX sem um andaime artificial.
Protocol
1. preparação das células
- Manter o NAMRU do mouse glândula mamária epiteliais células (NMuMG) com 5 mL de D-MEM contendo 10% (v) fetal de soro bovino (FBS) e 1% (v) penicilina-estreptomicina (P/S) num balão de3 25 cm. Remover Dulbecco modificado médio da águia (D-MEM), contendo 10% FBS e 1% P/S.
- Adicione 3 a 5 mL de 37 ° C fosfato salino (PBS) (-) no balão. Observe que o pH da PBS é 7,1-7,3.
- Remova todos a PBS o balão usando um aspirador.
- Adicione 1,5 mL de tripsina de 37 ° C (0,25%, p/v) ao balão.
- Incube o frasco por aproximadamente 1-2 minutos a 37 ° C numa incubadora de CO2 .
- Adicionar 3,5 mL de D-MEM contendo 10% FBS e 1% P/S para o balão. Pipeta para misturar.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifuga-lo por 3 min à temperatura ambiente. Observe que o raio de rotação e a velocidade de rotação do centrifugador são 16,6 cm e 1500 rpm, respectivamente. Sob estas condições, a força centrífuga relativa é 417 x g.
- Adicionar 5 mL de D-MEM fresco (10% FBS e 1% P/S) para o balão após aspiração do meio (se necessário, cryopreserve as células com solução de criopreservação, seguindo as instruções do fabricante).
2. preparação do Dextran (DEX)
- Prepare 80 mg/mL de solução DEX, misturando-se 10 mL de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) e 0,8 g de DEX. Observe que a solução DEX pode ser filtrada com um filtro de seringa (0,22 µm) depois que as células têm cultivado por um tempo suficiente.
- Prepare uma suspensão de células contendo 40 mg/mL de meio de DEX, misturando-se 200 µ l de solução DEX e 200 µ l da suspensão celular preparada no ponto 2.1. Observe que o número densidade de células na solução é de aproximadamente 2,3 × 105 células/mL.
3. preparação para Laser e microscopia
- Ligue o laser (onda contínua, comprimento de onda de 1.064 nm) (Figura 1um). Observe que o uso de um feixe de laser com um comprimento de onda de vermelho a região infravermelha é mais eficaz; nesta região de comprimento de onda é chamada a janela de diagnóstico e terapêutica de10 pois é minimamente absorvido pelas células.
- Clique duas vezes no ícone do software.
- Clique duas vezes em que ícones para a câmera ①, ② diodo emissor de luz (LED), foco ③ ajustar e ④ estágio movente. O exibe correspondente a ①-④ aparecerá (Figura 1b).
4. célula manipulação usando o sistema de captura de Laser
- Lugar 20 µ l da amostra preparada no passo 2.2 no vidro da tampa do fundo (0,17 mm de espessura, tamanho = 30 mm × 40 mm) e cubra-o com o vidro de tampa superior (0,17 mm de espessura, tamanho = 18 mm × 18 mm), com separação fornecida por dois espaçadores (0,17 mm de espessura tamanho = 10 mm × 24 mm), conforme mostrado na Figura 2. Note que estes óculos não requerem um revestimento especial.
- Coloque a célula de amostra preparada no passo 4.1 o inferior da lente objetiva (imersão com ca. 10 μl, ampliação de água = 60 X, distância de trabalho = 0,28 mm, abertura numérica = 1,2)).
- Anexar a lente objetiva superior (imersão com ca. 10 μl, ampliação de água = 60 X, distância de trabalho = 2 mm, abertura numérica = 1.0) na parte superior da célula de amostra.
- Liga o LED luz clicando no ícone 2 (Figura 1b).
- Ajustar a distância entre a amostra e a lente objetiva inferior clicando os ícones no painel 3 (Figura 1b) até que esteja em foco.
- Irradiar os raios laser na posição 1 e 2 de posição (Figura 1B) da amostra clicando em ícones I, II e III (Figura 1b).
- Defina a intensidade de cada feixe de laser para 1.500 mW inserindo este valor no ícone IV (Figura 1b).
- Mover o estágio de amostra clicando em direções indicando do ícone 4 (Figura 1b) até uma célula está preso na posição 1 (Figura 1b).
- Arrastar o cursor indica a posição 2 (Figura 1b) até outra célula está preso na posição 2.
5. construção de uma estrutura de 3-Dimensional (3D) celular
- Manipule uma única célula, para que fique em contato com outra célula. Manter essa condição para 300 s; ou seja, cada célula é exposta a um laser para 300 s.
- Grave o eixo de X-Y, mostrado na Figura 1b.
- Construa um conjunto arbitrário de célula 2D pela captura e transporte de outra célula para as células.
- Construa um assembly celular 3D movendo-se acima e para baixo do palco.
- Confirme que a Assembleia permanece estável após o laser é desligado.
Representative Results
A Figura 1 mostra o microscópio e o software utilizado neste estudo. A Figura 2 é uma representação esquemática do procedimento de colocação da solução de amostra contendo células. A Figura 3 demonstra a formação de uma estrutura de pirâmide usando Pinça óptica de duplo-feixe. Se a experiência for bem-sucedida, estes conjuntos celulares permanecem estáveis, mesmo quando o laser é desligado.
Figura 1 : (a) o sistema de controle para o sistema de captura de Laser (NanoTracker2 (11)). O sistema é activado ao ligar o interruptor do laser seguindo passos ①-③. (b) o software para controlar o sistema Laser de Trapping. A câmera, levou luz, ajustar o foco, e estágio movente são ativados clicando em ícones ①, ②, ③ e ④, respectivamente. A imagem microscópica é exibida no painel 1. O controle de ligar/desligar para o LED está no painel 2. O foco é controlado no painel 3. Os raios laser são irradiados em posições 1 e 2, clicando em ícones I a IV. Os detalhes do Systemare de Trapping Laser fornecido em ref. (12). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquema representativa para a colocação do vidro de slide. 20 µ l da amostra (suspensão de células contendo dextrano) é colocado no slide e usado para manipulação do laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : um) conjuntos de células epiteliais (NMuMG) de uma forma pretendida em um meio com DEX (40mg/mL): uma pirâmide é mostrada como um exemplo de um cluster de 3D. b) uma figura esquemática do conjunto celular 3D em forma de pirâmide também é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O presente estudo mostra uma aplicação concreta dos nossos últimos relatórios9,11 , sobre o uso de polímeros solúveis para a construção de conjuntos de célula única 3D. Esses assemblies são formados estàvel na solução em massa quando o número de células é de até 10 e pode ser realizado por um feixe de laser único. Módulos (assemblies) precipitam na superfície do vidro quando há mais de 10 células. Embora os experimentos ainda estão em um estágio primitivo, esperamos que a nova metodologia poderia ser uma poderosa ferramenta para a construção da próxima geração 3D assemblies de célula única, que são indispensáveis para o progresso nas áreas de biologia celular e medicina regenerativa.
Em uma solução contendo o polímero não, as células se repelem devido a repulsão eletrostática decorrentes da carga de superfície, a força de repulsão de hidratação, o efeito de repulsão glicocálix e ondulação da membrana. Nosso estudo anterior mostrou que pares de células podem ser estáveis por muito tempo, quando as células são tratadas com PEG. Mais importante, o transporte bem sucedido de um par de célula para uma região sem PEG, após as células tinham sido realizadas em contato durante 5 minutos em PEG, sugere que o contato celular é mantido de forma estável. Isto está bem explicado em termos de efeito da depleção11, e essencialmente o mesmo mecanismo se aplica aos assemblies celulares gerados usando DEX9. Nossos resultados atuais sugerem que outros tipos de macromoléculas naturais também podem ser usados para construir conjuntos celulares 3D estáveis.
Para o transporte rápido das células, a concentração do polímero é importante. Geralmente, a viscosidade da solução drasticamente aumenta quando o polímero é dissolvido acima da concentração de sobreposição. Sob esta condição, é difícil manipular as células usando a Pinça óptica. Portanto, o experimento deve ser realizado abaixo da concentração de sobreposição. Para uma solução DEX, a concentração de sobreposição é ca. 50 mg/mL (a viscosidade cinética é 5,5 mm2/s). Como mostrado na Ref. 9, um conjunto estável de celular foi observado quando a concentração de DEX foi de 10 mg/mL, 40 mg/ml. Este resultado sugere que o efeito de depleção é suficientemente grande para manter o contato célula-célula estável mesmo quando a concentração de DEX é menor do que a concentração de sobreposição. Tem sido demonstrado que a adição de DEX não afeta a viabilidade celular até 40 mg/mL 9.
O estabelecimento de um método para a construção de módulos (assemblies) celular 3D é importante no campo da medicina regenerativa, desde imitando um na vivo celular microambiente estruturando células únicas pode facilitar a células-tronco derivadas de tecido formação. Até agora, usamos o presente protocolo para construir celulares assemblies usando Neuro2A células9 além de células NMuMG. Nós esperamos estabelecer uma metodologia experimental para a construção de conjuntos celulares 3D de um maior número de células de diversas morfologias. O sistema de Pinça óptica desenvolvido pela Ichikawa et al 13 seria aplicável para esta finalidade desde que a orientação das células pode ser controlada. Ensaios adicionais ao longo destas linhas deve ser promissoras.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Shu Hashimoto, Aoi Yoshida e Taeko Ohta na Universidade Doshisha por sua generosa ajuda com a instalação experimental. Este trabalho foi financiado pelo KAKENHI (15H 02121, 15 05400 K, 25103012, 50587441) e pelo programa de MEXT-Supported para a Fundação de pesquisa estratégica em universidades privadas. Este estudo foi suportado também por uma concessão polonês na KNOW (centro de pesquisa nacional de levando) Consortium científica "Animal – seguro alimentos saudáveis", decisão do Ministério da ciência e do ensino superior n º 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
