Summary
हम एक कृत्रिम पाड़ के बिना एक एकल सेल आधारित 3 आयामी (3 डी) विधानसभा के निर्माण के लिए एक उपंयास विधि प्रदर्शित करता है ।
Abstract
अपक्षयी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग असभ्य रोगों के उपचार के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं, और कई अध्ययनों से इन क्षेत्रों में 3 आयामी (3 डी) सेलुलर सभाओं के महत्व को प्रदर्शित किया है । कृत्रिम पाड़ों अक्सर 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, पाड़ों सेलुलर विधानसभाओं का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कभी विषैले और कोशिकाओं के गुणों को बदल सकते हैं । इस प्रकार, यह सेल सेल संपर्क की सुविधा के लिए एक गैर विषैले विधि स्थापित करने के लिए फायदेमंद होगा । इस पत्र में, हम dextran के साथ ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके स्थिर सेलुलर सभाओं के निर्माण के लिए एक उपंयास विधि का परिचय । इस विधि के लाभों में से एक यह है कि यह एक कुछ मिनट के भीतर स्थिर सेल से सेल संपर्क स्थापित करता है । इस नई विधि एक प्राकृतिक हाइड्रोफिलिक बहुलक में 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण की अनुमति देता है और अगली पीढ़ी के 3 डी एकल अपक्षयी दवा और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्रों में सेल विधानसभाओं के निर्माण के लिए उपयोगी होने की उंमीद है ।
Introduction
जबकि मानव ऊतकों कोशिकाओं के कई सभाओं से बना है और शरीर के homeostasis बनाए रखने में मदद कर सकते हैं, खुद के द्वारा एकल कोशिकाओं को भी सेल से सेल संपर्क के माध्यम से महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसलिए, यह स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कैसे एकल कोशिकाओं को बाहरी संकेतों से उत्तेजित किया जा सकता है और कैसे वे अन्य अनुयाई कोशिकाओं के लिए इस तरह के संकेतों को हस्तांतरण. इस प्रयोजन के लिए, एकल-कक्ष-आधारित 3-आयामी (3d) असेंबली के निर्माण के लिए कई विधियाँ स्थापित की गई हैं1,2,3,4,5,6 ,7,8. हालांकि, सामग्री है कि सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है अभी भी सुधार किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) सहित सिंथेटिक जैल और पॉलिमर कुछ रासायनिक भौतिक गुणों के अधिकारी हैं और लक्ष्य कोशिकाओं (जैसे, विषाक्तता) को प्रभावित कर सकते हैं ।
हमने हाल ही में एक उपंयास प्रणाली है कि एक एकल-सेल आधारित कोशिकाओं के 3 डी विधानसभा dextran (DEX) का उपयोग स्थिर सेल-सेल संपर्क9स्थापित करके उत्पंन कर सकता है की सूचना दी । हमने माना है कि इस प्रौद्योगिकी के कई अनुसंधान क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है, अपक्षयी चिकित्सा और यहां तक कि कैंसर जीव विज्ञान सहित । इस रिपोर्ट में, हम वर्णन कैसे हम एकल कोशिकाओं में हेरफेर और 3 आयामी निर्माण (3 डी) एक कृत्रिम पाड़ के बिना DEX सहित विभिंन हाइड्रोफिलिक biomacromolecules की उपस्थिति में सेलुलर असेंबलियों ।
Protocol
1. कोशिकाओं की तैयारी
- बनाए रखने नमृ माउस स्तन ग्रंथि उपकला कोशिकाओं (NMuMG कोशिकाओं) के साथ डी की 5 मिलीलीटर-मेम 10% (v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% (v) पेनिसिलिन-Streptomycin (पी/एस) एक 25 सेमी3 कुप्पी में. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (डी-मेम) को निकालें, जिसमें 10% FBS और 1% P/
- कुप्पी के लिए ३७ ° c फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 3-5 मिलीलीटर जोड़ें (-) । ध्यान दें कि पंजाबियों का पीएच 7.1-7.3 है ।
- एक aspirator का उपयोग कर कुप्पी से सभी पंजाबियों को हटा दें ।
- कुप्पी में ३७ ° c trypsin (०.२५%, w/v) की १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
- एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1-2 मिनट के लिए कुप्पी मशीन ।
- 10% FBS युक्त डी-मेम की ३.५ मिलीलीटर जोड़ें और कुप्पी के लिए 1% P/ पिपेट मिश्रण.
- एक 15 मिलीलीटर के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक ट्यूब स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए यह केंद्रापसारक । ध्यान दें कि रोटेशन त्रिज्या और रोटेशन की गति के केंद्रापसारक १६.६ सेमी और १५०० rpm, क्रमशः कर रहे हैं । इस हालत के तहत, रिश्तेदार केंद्रापसारक बल ४१७ एक्स जी है ।
- मध्यम aspirating (यदि आवश्यक हो, cryopreservation समाधान के साथ कोशिकाओं cryopreserve, निर्माता के निर्देशों का पालन) के बाद कुप्पी के लिए ताजा डी-मेम (10% FBS और 1% P/S) के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
2. Dextran (DEX) की तैयारी
- डी-मेम (10% FBS, 1% P/S) और DEX के ०.८ g के 10 मिलीलीटर को मिलाकर DEX सॉल्यूशन के ८० मिलीग्राम/एमएल तैयार करें । ध्यान दें कि DEX समाधान एक सिरिंज फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया जा सकता (०.२२ µm) के बाद कोशिकाओं को एक पर्याप्त समय के लिए संस्कृति है ।
- ४० मिलीग्राम/एमएल DEX माध्यम से युक्त एक सेल सस्पेंशन तैयार करें जिसमें २०० µ l का DEX सॉल्यूशन और २०० µ l का २.१ में तैयार किया गया सेल सस्पेंशन का मिश्रण है । ध्यान दें कि समाधान में कोशिकाओं की संख्या घनत्व लगभग 2.3 × 105 कोशिकाओं/
3. लेजर और माइक्रोस्कोपी के लिए तैयारी
- लेजर चालू करें (निरंतर तरंग, १,०६४ एनएम तरंग दैर्ध्य) (चित्रा 1ए) । ध्यान दें कि लाल रंग में एक तरंग दैर्ध्य के निकट अवरक्त क्षेत्र के साथ एक लेज़र बीम का उपयोग सबसे प्रभावी है; यह तरंग दैर्ध्य क्षेत्र नैदानिक और चिकित्सकीय खिड़की10 कहा जाता है क्योंकि यह न्यूनतम कोशिकाओं द्वारा अवशोषित कर लेता है ।
- सॉफ़्टवेयर चिह्न को डबल-क्लिक करें ।
- ① कैमरा के लिए चिह्न डबल-क्लिक करें, ② प्रकाश उत्सर्जक डायोड (LED), ③ फ़ोकस समायोजित, और ④ चलती अवस्था । प्रदर्शित करने के लिए इसी ①-④ दिखाई देगा (चित्रा 1ख) ।
4. सेल लेजर ट्रैपिंग प्रणाली का उपयोग हेरफेर
- नीचे कवर ग्लास (०.१७ mm मोटाई, पर चरण २.२ में तैयार किए गए नमूने के 20 µ एल प्लेस, आकार = 30 मिमी × ४० मिमी), और शीर्ष कवर ग्लास (०.१७ mm मोटाई, आकार = 18 मिमी × 18 मिमी) के साथ कवर, जुदाई के साथ दो स्पेसर द्वारा प्रदान की (०.१७ mm मोटाई , आकार = 10 मिमी × 24 मिमी), चित्रा 2में दिखाया गया के रूप में. ध्यान दें कि इन चश्मे एक विशेष कोटिंग की आवश्यकता नहीं है ।
- निचले उद्देश्य लेंस पर कदम ४.१ में तैयार नमूना सेल प्लेस (सीए के साथ जल विसर्जन. 10 μl, आवर्धन = 60X, कार्य दूरी = ०.२८ mm, संख्यात्मक एपर्चर = १.२)) ।
- ऊपरी उद्देश्य लेंस संलग्न (सीए के साथ जल विसर्जन. 10 μl, आवर्धन = 60X, काम की दूरी = 2 मिमी, संख्यात्मक एपर्चर = १.०) नमूना सेल के शीर्ष पर ।
- चिह्न 2 (चित्र 1b) पर क्लिक करके LED लाइट चालू करें.
- 3 पैनल (चित्रा 1ख) जब तक यह ध्यान में है पर माउस को आइकनों पर क्लिक करके नमूना और कम उद्देश्य लेंस के बीच की दूरी को समायोजित करें ।
- विकीर्ण 1 और 2 स्थान पर लेजर मुस्कराते हुए (चित्रा 1ख) चिह्न मैं, द्वितीय, और III (चित्रा 1ख) पर क्लिक करके नमूने के ।
- आइकन IV (चित्रा 1ख) में इस मूल्य में प्रवेश करके १,५०० मेगावाट के लिए प्रत्येक लेजर बीम की तीव्रता निर्धारित करें ।
- आइकन 4 पर क्लिक करके नमूना चरण ले जाएँ दिशा निर्देश (चित्रा 1ख) जब तक एक सेल 1 स्थिति (चित्रा 1ख) पर फंस गया है.
- स्थिति 2 (चित्रा 1ख) जब तक दूसरे सेल 2 स्थिति में फंस गया है का संकेत कर्सर खींचें ।
5. एक 3 आयामी (3 डी) सेल संरचना का निर्माण
- किसी एकल कक्ष में हेरफेर करें जिससे वह किसी अंय कक्ष से संपर्क में हो । ३०० s के लिए इस शर्त को बनाए रखें; यानी, प्रत्येक कोशिका ३०० एस के लिए एक लेजर के संपर्क में है ।
- चित्र 1bमें दर्शाए गए X-Y अक्ष को रिकॉर्ड करना ।
- फँसाने और कोशिकाओं के लिए एक और सेल परिवहन द्वारा एक मनमाना 2d सेल विधानसभा का निर्माण ।
- मंच ऊपर और नीचे ले जाकर एक 3 डी सेलुलर विधानसभा का निर्माण ।
- पुष्टि करें कि असेंबली लेज़र स्विच है बंद करने के बाद स्थिर रहता है ।
Representative Results
चित्रा 1 इस अध्ययन में प्रयुक्त माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर से पता चलता है. चित्रा 2 नमूना समाधान कोशिकाओं से युक्त रखने के लिए प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है । चित्रा 3 डबल बीम ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कर एक पिरामिड संरचना के गठन को दर्शाता है । यदि प्रयोग सफल होता है, तो लेजर स्विच ऑफ होने के बाद भी ये सेलुलर असेंबली स्थिर रहती हैं ।
चित्रा 1 : (क) लेजर ट्रैपिंग प्रणाली के लिए नियंत्रण प्रणाली (NanoTracker2 (11)) । सिस्टम लेजर स्विच पर मोड़ द्वारा सक्रिय है कदम ①-③ निंनलिखित । (ख) लेजर ट्रैपिंग प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर । कैमरा, एलईडी लाइट, फोकस समायोजित करें, और चलती स्टेज क्रमशः माउस ①, ②, ③, और ④, क्लिक करके सक्रिय कर रहे हैं । सूक्ष्म छवि 1 पैनल में प्रदर्शित किया जाता है । एलईडी के लिए ऑन/ऑफ कंट्रोल पैनल 2 में है । ध्यान 3 पैनल में नियंत्रित किया जाता है । लेजर मुस्कराते हुए 1 और 2 पदों पर विकिरणित है माउस को आइकनों मैं IV पर क्लिक करके । इस लेजर ट्रैपिंग का विवरण रेफरी में प्रदान की Systemare (12) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: प्रतिनिधि स्लाइड ग्लास रखने के लिए योजनाबद्ध । नमूने के 20 µ एल (सेल dextran युक्त निलंबन) स्लाइड पर रखा गया है और लेजर हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : a) असेंबली की उपकला कोशिकाओं (NMuMG) DEX के साथ एक माध्यम में एक इच्छित आकार का (४० mg/एमएल): पिरामिड एक 3d क्लस्टर का एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है । ख) पिरामिड के आकार का 3d सेलुलर असेंबली का एक योजनाबद्ध आंकड़ा भी दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
वर्तमान अध्ययन 3 डी एकल सेल विधानसभाओं के निर्माण के लिए घुलनशील पॉलिमर के उपयोग पर हमारे हाल ही में9रिपोर्ट,11 के एक ठोस आवेदन से पता चलता है । इस तरह के विधानसभाओं छुरा थोक समाधान में गठन कर रहे है जब कोशिकाओं की संख्या 10 तक है, और एक एकल लेजर बीम द्वारा आयोजित किया जा सकता है । जब 10 से अधिक कक्ष हैं, तो असेंबलीज़ कांच की सतह पर हाला । हालांकि प्रयोग एक आदिम अवस्था में अब भी कर रहे हैं, हम उंमीद है कि उपंयास पद्धति अगली पीढ़ी के 3 डी एकल सेल विधानसभाओं, जो कोशिका जीवविज्ञान के क्षेत्र में प्रगति के लिए अपरिहार्य है और निर्माण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है अपक्षय चिकित्सा ।
एक समाधान में कोई बहुलक युक्त, कोशिकाओं को एक दूसरे की वजह से सतह प्रभारी, जलयोजन प्रतिकारक बल, glycocalyx प्रतिकारक प्रभाव, और झिल्ली undulat से उत्पंन इलेक्ट्रोस्टैटिक repuls के पीछे हटाना । हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि सेल जोड़े एक लंबे समय के लिए स्थिर किया जा सकता है जब कोशिकाओं खूंटी के साथ इलाज कर रहे हैं । इससे भी महत्वपूर्ण बात, खूंटी के बिना एक क्षेत्र के लिए एक सेल जोड़ी के सफल परिवहन, के बाद कोशिकाओं के संपर्क में खूंटी में 5 मिनट के लिए आयोजित किया गया था, पता चलता है कि सेलुलर संपर्क एक स्थिर तरीके से बनाए रखा है । यह अच्छी तरह से घट प्रभाव11के संदर्भ में समझाया गया है, और अनिवार्य रूप से एक ही तंत्र DEX9का उपयोग कर उत्पन्न सेलुलर विधानसभाओं के लिए लागू होता है. हमारे वर्तमान परिणाम सुझाव है कि प्राकृतिक अणुओं के अंय प्रकार भी स्थिर 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कोशिकाओं के त्वरित परिवहन के लिए, बहुलक की एकाग्रता महत्वपूर्ण है । आम तौर पर, समाधान की चिपचिपाहट तेजी से बढ़ जाती है जब बहुलक ओवरलैप एकाग्रता के ऊपर भंग है । इस शर्त के तहत, यह ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए मुश्किल है । इसलिए, प्रयोग को ओवरलैप एकाग्रता के नीचे किया जाना चाहिए । एक DEX समाधान के लिए, ओवरलैप एकाग्रता ca है । ५० मिलीग्राम/एमएल (काइनेटिक चिपचिपापन है ५.५ mm2/ के रूप में रेफरी .9 में दिखाया गया है, एक स्थिर सेलुलर विधानसभा मनाया जब DEX की एकाग्रता था 10 मिलीग्राम/एमएल करने के लिए ४० मिलीग्राम/एमएल । इस परिणाम से पता चलता है कि घट प्रभाव को पर्याप्त रूप से स्थिर सेल-सेल संपर्क बनाए रखने के लिए भी जब DEX एकाग्रता ओवरलैप एकाग्रता से कम है बड़ा है । यह दिखाया गया है कि DEX के अलावा सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है अप करने के लिए ४० मिलीग्राम/
3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए एक विधि की स्थापना एक सेल संरचना द्वारा vivo सेलुलर microenvironment में नकल उतार के बाद से अपक्षयी दवा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण है, स्टेम सेल व्युत्पंन ऊतक की सुविधा हो सकती है गठन. अब तक, हम NMuMG कोशिकाओं के अलावा Neuro2A कोशिकाओं9 का उपयोग सेलुलर विधानसभाओं का निर्माण करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है. हम विभिंन morphologies की कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए एक प्रायोगिक पद्धति स्थापित करने की उंमीद है । Ichikawa एट अल द्वारा विकसित ऑप्टिकल चिमटी प्रणाली । 13 इस प्रयोजन के लिए लागू किया जाएगा के बाद से कोशिकाओं के उंमुखीकरण को नियंत्रित किया जा सकता है । इन पंक्तियों के साथ आगे परीक्षण का वादा किया जाना चाहिए ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक Ohta विश्वविद्यालय में शू Hashimoto, Aoi योशिदा, और Taeko Doshisha प्रयोगात्मक सेटअप के साथ उनके उदार सहायता के लिए धंयवाद । यह काम KAKENHI द्वारा समर्थित (15H02121, 15K05400, २५१०३०१२, ५०५८७४४१) और MEXT द्वारा निजी विश्वविद्यालयों में सामरिक अनुसंधान फाउंडेशन के लिए कार्यक्रम का समर्थन किया था । यह अध्ययन भी पता (अग्रणी राष्ट्रीय अनुसंधान केंद्र) वैज्ञानिक कंसोर्टियम "स्वस्थ पशु-सुरक्षित भोजन" से एक पोलिश अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय के निर्णय No. 05-1/KNOW2/2015..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
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