Summary
Dimostriamo un metodo novello per la costruzione di una single-cell-based Assemblea 3-dimensionale (3D) senza un'impalcatura artificiale.
Abstract
Medicina rigenerativa e ingegneria tissutale offrono diversi vantaggi per il trattamento di malattie intrattabili, e diversi studi hanno dimostrato l'importanza delle assemblee cellulari di 3-dimensionale (3D) in questi campi. Scaffold artificiali sono stati usati spesso per la costruzione di assiemi 3D cellulare. Tuttavia, i ponteggi utilizzati per costruire gli assembly cellulari a volte sono tossici e possono modificare le proprietà delle cellule. Così, sarebbe utile stabilire un metodo non tossico per facilitare il contatto della cellula-cellula. In questa carta, presentiamo un nuovo metodo per costruire stabile cellulare assembly utilizzando le pinzette ottiche con destrano. Uno dei vantaggi di questo metodo è che esso stabilisce stabile contatto cellula--cellula in pochi minuti. Questo nuovo metodo permette la costruzione di assiemi 3D cellulare in un polimero idrofilo naturale e dovrebbe essere utile per la costruzione di assiemi 3D di cella singola generazione nel campo della medicina rigenerativa e ingegneria tissutale.
Introduction
Mentre tessuti umani sono composti da diversi assembly delle cellule e possono aiutare a mantenere l'omeostasi del corpo, cellule singole da soli anche svolgono ruoli importanti tramite interazione cellula--cellula. Pertanto, è importante chiarire come singole cellule possono essere stimolate dai segnali esterni e come trasferire tali segnali ad altre cellule aderenti. Per questo scopo, sono stati stabiliti metodi diversi per la costruzione di assiemi (3D) 3-dimensionale single-cell-based1,2,3,4,5,6 ,7,8. Tuttavia, i materiali che vengono utilizzati per costruire gli assembly cellulari possono ancora essere migliorati. Ad esempio, gel sintetiche e polimeri quali polietilenglicole (PEG) possiedono determinate proprietà chimico-fisiche chimiche e possono influenzare le cellule bersaglio (ad es., tossicità).
Recentemente abbiamo segnalato un nuovo sistema che potrebbe generare un assembly 3D single-cell-based di celle utilizzando destrano (DEX) stabilendo contatti cellula-cellula stabile9. Abbiamo considerato che questa tecnologia potrebbe essere utile in diversi campi di ricerca, tra cui anche il cancro biologia e medicina rigenerativa. In questo rapporto, descriviamo come manipolare cellule singole e costruire 3-dimensionale assembly cellulare (3D) in presenza di varie biomacromolecole idrofilici compreso DEX senza un'impalcatura artificiale.
Protocol
1. preparazione delle celle
- Mantenere cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo a NAMRU (cellule NMuMG) con 5 mL di D-MEM contenente 10% (v) siero bovino fetale (FBS) e 1% (v) penicillina-streptomicina (P/S) in un pallone di3 cm 25. Rimuovere Dulbecco per volta medio dell'Aquila (D-MEM), contenente 10% FBS e 1% P/S.
- Aggiungere 3-5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) (-) e 37 ° C al pallone. Si noti che il pH del PBS è 7.1-7.3.
- Rimuovere tutto il PBS dalla beuta utilizzando un aspiratore.
- Aggiungere 1,5 mL di tripsina di 37 ° C (0,25%, p/v) al pallone.
- Incubare la beuta per circa 1-2 minuti a 37 ° C in un incubatore a CO2 .
- Aggiungere 3,5 mL di D-MEM contenente 10% FBS e 1% P/S al pallone. Pipetta per mescolare.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a esso per 3 min a temperatura ambiente. Notare che il raggio di rotazione e la velocità di rotazione della centrifuga sono 16,6 cm e 1500 giri/min, rispettivamente. In questa circostanza, la forza centrifuga relativa è 417 x g.
- Aggiungere 5 mL di fresco D-MEM (10% FBS e 1% P/S) al pallone dopo avere aspirato il mezzo (se necessario, crioconservare le cellule con soluzione di crioconservazione, seguendo le indicazioni del produttore).
2. preparazione di destrano (DEX)
- Preparare 80 mg/mL di soluzione DEX mescolando 10 mL di D-MEM (10% FBS, 1%P/S) e 0,8 g di DEX. Si noti che la soluzione DEX può essere filtrata con un filtro per siringa (0,22 µm) dopo che le cellule sono coltivate per un tempo sufficiente.
- Preparare una sospensione di cellule contenenti 40 mg/mL di terreno di DEX mescolando 200 µ l di soluzione DEX e 200 µ l di sospensione cellulare preparata al punto 2.1. Si noti che la densità di numero delle cellule nella soluzione è circa 2.3 × 105 cellule/mL.
3. preparazione per Laser e microscopia
- Accendere il laser (onda continua, 1.064 nm lunghezza d'onda) (Figura 1a). Si noti che l'uso di un fascio laser con una lunghezza d'onda nel colore rosso alla regione vicina all'infrarosso è più efficace; Questa regione di lunghezza d'onda si chiama finestra diagnostica e terapeutica10 poiché è minimamente assorbito dalle cellule.
- Fare doppio clic sull'icona del software.
- Fare doppio clic che le icone di fotocamera ① ② diodo luminoso (LED), messa a fuoco ③ per regolare, quindi ④ fase commovente. I display corrispondente ④ ① mostrerà (Figura 1b).
4. cell manipolazione utilizzando il sistema Laser Trapping
- Posto 20 µ l del campione preparato nel passaggio 2.2 il vetro di copertura inferiore (0,17 mm di spessore, dimensione = 30 × 40 mm) e coprire con il vetro di copertura superiore (0,17 mm di spessore, dimensione = 18 × 18 mm), con separazione fornito da due distanziatori (0,17 mm di spessore dimensione = 10 mm × 24 mm), come illustrato nella Figura 2. Si noti che questi occhiali non necessitano di un rivestimento speciale.
- Posizionare la cella del campione preparata nel passaggio 4.1 sulla lente dell'obiettivo inferiore (acqua immersione con ca. 10 μl, ingrandimento = 60 X, distanza di lavoro = 0,28 mm, apertura numerica = 1,2)).
- Fissare l'obiettivo superiore (acqua immersione con ca. 10 μl, ingrandimento = 60 X, distanza di lavoro = 2 mm, apertura numerica = 1.0) nella parte superiore della cella del campione.
- Accendere il LED luce facendo clic sull'icona 2 (Figura 1b).
- Regolare la distanza tra il campione e la lente dell'obiettivo inferiore facendo clic sulle icone sul pannello 3 (Figura 1b) fino a quando non è a fuoco.
- Irradiare i raggi laser in posizione 1 e posizione 2 (Figura 1B) del campione cliccando le icone, I, II e III (Figura 1b).
- Impostare l'intensità di ogni fascio laser a 1.500 mW inserendo questo valore a icona IV (Figura 1b).
- Spostare la fase del campione facendo clic su indicazioni stradali indicando icona 4 (Figura 1b) fino a quando una cella viene intrappolata in posizione 1 (Figura 1b).
- Trascinare il cursore che indica la posizione 2 (Figura 1b) fino a un'altra cella viene intercettato in posizione 2.
5. costruzione di una struttura di cella 3-dimensionale (3D)
- Manipolare una singola cella in modo che sia a contatto con un'altra cella. Mantenere questa condizione per 300 s; cioè, ogni cella è esposta ad un laser per 300 s.
- Registrare l'asse di X-Y, mostrato nella Figura 1b.
- Costruire un assembly arbitrario cella 2D intrappolando e trasportando un'altra cella per le celle.
- Costruire un assembly cellulare 3D spostando su e giù il palco.
- Confermare che l'assembly rimane stabile dopo il laser viene spento.
Representative Results
La figura 1 Mostra il microscopio e il software utilizzato in questo studio. Figura 2 è una rappresentazione schematica della procedura per l'immissione della soluzione di esempio che contiene le cellule. Figura 3 illustra la formazione di una struttura piramidale con doppio raggio ottiche pinzette. Se l'esperimento è riuscito, queste assemblee cellulari rimangono stabili anche dopo il laser viene spento.
Figura 1 : (a) il sistema di controllo per il sistema Laser Trapping (NanoTracker2 (11)). Il sistema è attivato accendendo l'interruttore laser ③ ① come segue. (b) il software per il controllo del sistema di cattura di Laser. La fotocamera, LED luce, messa a fuoco regolare, e lo spostamento di fase vengono attivati facendo clic su icone ① ②, ③ e ④, rispettivamente. L'immagine microscopica viene visualizzata nel pannello 1. Il controllo inserita/disinserita per il LED è in pannello 2. La messa a fuoco è controllato nel pannello 3. I raggi laser sono irradiati alle posizioni 1 e 2 facendo clic sulle icone I a IV. I dettagli di questo Laser Trapping Systemare forniti in rif. (12). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schema rappresentativo per l'immissione il vetro scorrevole. 20 µ l di campione (sospensione cellulare contenente destrano) è inserito nella diapositiva e utilizzato per la manipolazione di laser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : un) assembly delle cellule epiteliali (NMuMG) di una forma prevista in un mezzo con DEX (40 mg/mL): una piramide è indicata come un esempio di un cluster di 3D. b) una figura schematica dell'Assemblea cellulare 3D a forma di piramide è anche mostrata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Lo studio presente indica un'applicazione concreta del nostro recente report9,11 sull'uso di polimeri solubili per la costruzione di assiemi 3D di cella singola. Tali assemblee sono formate stabilmente nella soluzione di massa quando il numero delle cellule è fino a 10 e possa essere detenuto da un singolo fascio laser. Gli assembly precipitano sulla superficie del vetro quando ci sono più di 10 celle. Anche se gli esperimenti sono ancora in una fase primitiva, ci aspettiamo che la nuova metodologia potrebbe essere un potente strumento per la costruzione di assiemi 3D cella singola generazione, che sono indispensabili per il progresso nel campo della biologia cellulare e medicina rigenerativa.
In una soluzione non contenente alcun polimero, le cellule si respingono a causa della repulsione elettrostatica derivanti dalla carica superficiale, la forza di repulsione di idratazione, effetto di repulsione glicocalice e ondulazione di membrana. Il nostro studio precedente ha mostrato che coppie di cella possono essere stabile per lungo tempo quando le cellule sono trattate con PEG. Ancora più importante, il trasporto di successo di una coppia di cella a una regione senza PEG, dopo che le cellule erano state tenute in contatto per 5 minuti in PEG, suggerisce che il contatto cellulare viene mantenuta in maniera stabile. Questo è ben spiegato in termini di effetto di svuotamento11, ed essenzialmente lo stesso meccanismo si applica agli assembly cellulare generato utilizzando DEX9. I nostri risultati attuali suggeriscono che altri tipi di macromolecole naturali anche potrebbero essere utilizzati per costruire gli assembly cellulari 3D stabili.
Per il trasporto rapido delle cellule, la concentrazione del polimero è importante. Generalmente, la viscosità della soluzione aumenta drasticamente quando il polimero viene sciolto sopra la concentrazione di sovrapposizione. In questa circostanza, è difficile manipolare cellule utilizzando pinzette ottiche. Quindi, l'esperimento deve essere eseguito sotto la concentrazione di sovrapposizione. Per una soluzione DEX, la concentrazione di sovrapposizione è ca. 50 mg/mL (la viscosità cinetica è 5,5 mm2/s). Come mostrato in rif. 9, un'Assemblea cellulare stabile è stata osservata quando la concentrazione di DEX era 10 mg/mL a 40 mg/mL. Questo risultato suggerisce che l'effetto di svuotamento è sufficientemente grande per mantenere il contatto della cellula-cellula stabile anche quando la concentrazione di DEX è inferiore rispetto alla concentrazione di sovrapposizione. Esso ha dimostrato che l'aggiunta di DEX non pregiudica la vitalità cellulare fino a 40 mg/mL 9.
L'istituzione di un metodo per la costruzione di assiemi 3D cellulare è importante nel campo della medicina rigenerativa, dal che imita un in vivo microambiente cellulare strutturando singole cellule può facilitare derivati da cellule staminali del tessuto formazione. Finora, abbiamo usato il presente protocollo per costruire cellulari assembly utilizzando Neuro2A cellule9 oltre a cellule NMuMG. Speriamo di stabilire una metodologia sperimentale per la costruzione di assiemi 3D cellulare di un numero maggiore di cellule di varie morfologie. Il sistema di pinzette ottiche sviluppato da Ichikawa et al. 13 sarebbe applicabile per questo scopo poiché l'orientamento delle cellule può essere controllata. Ulteriori prove lungo queste linee dovrebbero essere promettente.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Shu Hashimoto, Aoi Yoshida e Taeko Ohta a Doshisha University per la loro generosa assistenza con la messa a punto sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI (15H 02121, 15 05400 K, 25103012, 50587441) e dal programma MEXT-Supported per la Fondazione di ricerca strategica alle università Private. Questo studio è stato sostenuto anche da una sovvenzione polacca il consorzio scientifico KNOW (leader del centro nazionale ricerche) "Animale – sicuro il cibo sano", decisione del Ministero della scienza e dell'istruzione superiore n. 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
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