Summary
We laten zien een nieuwe methode voor de bouw van een enkele cel-gebaseerde 3-dimensionale (3D) vergadering zonder een kunstmatige steiger.
Abstract
Regeneratieve geneeskunde en weefselengineering bieden verschillende voordelen voor de behandeling van hardnekkige ziekten, en verscheidene studies hebben aangetoond dat het belang van 3-dimensionale (3D) cellulaire assemblages in deze velden. Kunstmatige steigers zijn vaak gebruikt voor de bouw van 3D cellulaire assemblages. Echter de steigers gebruikt voor de constructie van cellulaire assemblages zijn soms giftig en de eigenschappen van de cellen kunnen wijzigen. Dus, zou het zinvol zijn om een niet-toxisch methode voor het vergemakkelijken van cel-cel contact. In deze paper introduceren wij een nieuwe methode voor de opbouw van stabiele cellulaire samenstellen met behulp van optisch pincet met dextran. Een van de voordelen van deze methode is dat het stabiel contact van cel naar cel binnen een paar minuten. Deze nieuwe methode kan de bouw van 3D cellulaire vergaderingen in een natuurlijke hydrofiel polymeer en zit verwachte voor zitten nuttig voor de bouw van de volgende generatie 3D eencellige-assembly's op het gebied van regeneratieve geneeskunde en weefselkweek.
Introduction
Terwijl menselijke weefsels samengesteld uit verschillende samenstellingen van de cellen zijn en helpen kunnen om de homeostase van het lichaam, afzonderlijke cellen zelf ook een belangrijke rol spelen via cel-naar-cel interactie. Daarom is het belangrijk om te verhelderen hoe afzonderlijke cellen kunnen worden gestimuleerd door externe signalen en hoe zij dergelijke signalen naar andere Adherente cellen overdragen. Voor dit doel, zijn verschillende methoden vastgesteld voor de bouw van één cel-gebaseerde 3-dimensionale (3D) vergaderingen1,2,3,4,5,6 ,7,8. De materialen die worden gebruikt voor het construeren van cellulaire assembly's kunnen echter nog worden verbeterd. Bijvoorbeeld, synthetische gels en polymeren waaronder polyethyleenglycol (PEG) bepaalde chemische, fysisch-chemische eigenschappen bezitten en kunnen van invloed zijn op de doelcellen (bijvoorbeeld toxiciteit).
Onlangs meldden wij een nieuw systeem dat tot een enkele cel-gebaseerde 3D vergadering van cellen met dextran (DEX leiden kan) door de oprichting van stabiele cel contact9. We hebben overwogen dat deze technologie op verscheidene onderzoeksgebieden, met inbegrip van regeneratieve geneeskunde en zelfs Kankerbiologie nuttig zou kunnen zijn. In dit verslag beschrijven we hoe we enkele cellen manipuleren en 3-dimensionale (3D) cellulaire assemblages in de aanwezigheid van verschillende hydrofiele biomacromoleculen met inbegrip van DEX zonder een kunstmatige steiger bouwen.
Protocol
1. bereiding van cellen
- Onderhouden NAMRU muis melkklier epitheliale cellen (NMuMG cellen) met 5 mL D-MEM met 10% (v) foetale runderserum (FBS) en 1% (v) penicilline-streptomycine (P/S) in een maatkolf van 25 cm3 . Verwijderen Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (D-MEM), met 10% FBS en 1% P/S.
- 3-5 mL 37 ° C-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (-) Voeg aan de maatkolf. Merk op dat de pH van PBS 7,1-7.3 is.
- Verwijder alle de PBS uit de kolf met behulp van een aspirator.
- Voeg 1,5 mL trypsine van 37 ° C (0,25%, w/v) aan op de maatkolf.
- Incubeer de kolf gedurende ongeveer 1-2 minuten bij 37 ° C in een broedstoof CO2 .
- Voeg 3,5 mL D-MEM met 10% FBS en 1% P/S tot de kolf. Pipetteer te mengen.
- De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL en Centrifugeer het gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Merk op dat de straal van de rotatie en de rotatiesnelheid van de centrifuge 16,6 cm en 1500 rpm, respectievelijk. Onder deze voorwaarde is de relatieve centrifugale kracht 417 x g.
- Voeg 5 mL van de verse D-MEM (10% FBS en 1% P/S) aan op de maatkolf na aspirating van het medium (indien nodig, cryopreserve de cellen met cryopreservatie oplossing, na instructies van de fabrikant).
2. voorbereiding van Dextran (DEX)
- Bereiden van 80 mg/mL DEX-oplossing door het mengen van 10 mL van de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) en 0.8 g van DEX. Merk op dat de oplossing van DEX kan worden gefilterd met een spuit filter (0,22 µm) nadat de cellen hebben gekweekt voor een voldoende tijd.
- Bereid een celsuspensie met 40 mg/mL DEX medium door het mengen van 200 µL van DEX oplossing en 200 µL van de celsuspensie bereid in 2.1. Merk op dat de nummer dichtheid van de cellen in de oplossing ongeveer 2.3 × 10 is5 cellen/mL.
3. voorbereiding van de Laser en microscopie
- Inschakelen van de laser (continu golven, golflengte van 1,064 nm) (Figuur 1een). Merk op dat het gebruik van een laserstraal, met een golflengte in het rood tot nabij-infrarood regio is het meest effectief; deze golflengte regio heet de diagnostische en therapeutische venster10 aangezien het minimaal wordt geabsorbeerd door de cellen.
- Dubbelklik op het pictogram software.
- Dubbelklik op die de pictogrammen voor de ① camera, ② light - emitting diode (LED), ③ focus aanpassen, en ④ fase verplaatsen. De displays overeenkomt met ①-④ verschijnt (Figuur 1b).
4. cel manipulatie met behulp van het lasersysteem overvullen
- Plaats 20 µL van het monster dat is bereid in stap 2.2 op de bodem cover glas (0,17 mm dikte, grootte = 30 mm × 40 mm), en bedek het met de hoogste dekking glas (0,17 mm dikte, grootte = 18 mm × 18 mm), met scheiding geboden door twee afstandhouders (0,17 mm dikte grootte = 10 mm × 24 mm), zoals afgebeeld in Figuur 2. Merk op dat deze bril niet een speciale coating vereisen.
- Plaats van de cel van de steekproef bereid in stap 4.1 op de lagere objectief (water onderdompeling met ca. 10 μl, vergroting = 60 X, afstand = 0,28 mm, numerieke diafragma = 1.2)).
- Bevestig het bovenste objectief (water onderdompeling met ca. 10 μl, vergroting = 60 X, afstand = 2 mm, numerieke diafragma = 1.0) aan de bovenkant van de cel van de steekproef.
- Zet de LED licht door te klikken op pictogram 2 (Figuur 1b).
- Pas de afstand tussen het monster en de lagere objectief door te klikken op de pictogrammen op paneel 3 (Figuur 1b) totdat het is in focus.
- Het bestralen van de laserstralen op positie 1 en positie 2 (Figuur 1B) van het monster door te klikken op pictogrammen I, II en III (Figuur 1b).
- De intensiteit van elke laserstraal ingesteld op 1.500 mW door het invoeren van deze waarde op pictogram IV (Figuur 1b).
- Zet de monster fase door te klikken op pictogram 4 aangeeft richtingen (Figuur 1b) tot een cel is gevangen in positie 1 (Figuur 1b).
- Sleep de cursor positie 2 (Figuur 1b) tot een andere cel aangeeft is gevangen in positie 2.
5. bouw van een 3-dimensionale (3D) celstructuur
- Manipuleren een eencellige zodat er in contact met een andere cel. Handhaven van deze voorwaarde voor 300 s; dat wil zeggen, elke cel wordt blootgesteld aan een laser voor 300 s.
- De X-en Y-as weergegeven in Figuur 1bopnemen.
- Construeer een willekeurige 2D cel vergadering door het vangen en transporteren van een andere cel aan de cellen.
- Bouw een 3D cellulaire vergadering door het podium op en neer te bewegen.
- Bevestigen dat de vergadering stabiel blijft na de laser wordt uitgeschakeld.
Representative Results
Figuur 1 toont de Microscoop en de software die wordt gebruikt in deze studie. Figuur 2 is een schematische weergave van de procedure voor het plaatsen van de monsteroplossing met cellen. Figuur 3 toont de vorming van een piramidestructuur met behulp van dubbel-bundel optisch pincet. Als het experiment succesvol is, wordt met deze cellulaire assemblages stabiel blijven zelfs nadat de laser wordt uitgeschakeld.
Figuur 1 : (a) het controlesysteem voor het lasersysteem overvullen (NanoTracker2 (11)). Het systeem wordt geactiveerd door de op de switch van de laser als volgt ①-③ draaien. (b) de software voor het beheersen van het lasersysteem overvullen. De camera, LED licht, scherpstelling aan te passen, en bewegen van fase worden geactiveerd door te klikken op pictogrammen ①, ② en ③ ④, respectievelijk. De microscopische opname wordt weergegeven in het deelvenster 1. De aan/uit controle voor de LED is in deelvenster 2. De focus wordt beheerd in deelvenster 3. De laserstralen worden bestraald op posities 1 en 2 door te klikken op pictogrammen I tot IV. De details van deze Laser overvullen objectiveren waarin Ref. (12). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger schema voor het plaatsen van het glas van dia. 20 µL van het monster (celsuspensie met dextran) is op de dia geplaatst en gebruikt voor het manipuleren van de laser. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : een) samenstellingen van epitheliale cellen (NMuMG) van een beoogde vorm in een medium met DEX (40 mg/mL): een piramide wordt weergegeven als een voorbeeld van een 3D-cluster. b) een schematische afbeelding van de piramide-vormige 3D cellulaire vergadering blijkt ook. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De huidige studie toont een concrete toepassing van onze recente rapporten9,11 op het gebruik van oplosbare polymeren voor de bouw van 3D eencellige assemblages. Dergelijke vergaderingen worden stabiel gevormd in de bulk-oplossing wanneer het aantal cellen maximaal 10 is, en kan worden gehouden door een enkele laserstraal. Assemblages neerslaan op het glasoppervlak wanneer er meer dan 10 cellen. Hoewel de experimenten nog in een primitieve stadium zijn, we verwachten dat de nieuwe methodologie zou een krachtig instrument voor de bouw van de volgende generatie 3D eencellige assemblages, die onmisbaar voor de vooruitgang op het gebied van celbiologie zijn en regeneratieve geneeskunde.
In een oplossing met geen polymeer, afstoten cellen elkaar als gevolg van de elektrostatische afstoting die voortvloeien uit de oppervlakte lading, de kracht van de afkeer hydratatie, glycocalyx repulsion effect en membraan golving. Onze vorige studie toonde aan dat cel paren kunnen stabiel voor een lange tijd wanneer de cellen worden behandeld met PEG. Wat nog belangrijker is, suggereert het succesvolle vervoer van een paar van de cel naar een regio zonder PEG, nadat de cellen hadden plaatsgevonden in contact gedurende 5 minuten in PEG, dat cellulaire contact op een stabiele wijze is onderhouden. Dit wordt goed uitgelegd in de termen van de uitputting effect11, en in wezen hetzelfde mechanisme is van toepassing op de cellulaire assembly's gegenereerd met behulp van DEX9. Onze huidige resultaten suggereren dat andere soorten natuurlijke macromoleculen kunnen ook worden gebruikt voor de bouw van stabiele 3D cellulaire assemblages.
Voor het snelle vervoer van cellen is de concentratie van polymeer belangrijk. In het algemeen verhoogt de viscositeit van de oplossing drastisch wanneer het polymeer wordt opgelost boven de concentratie van de overlapping. Onder deze voorwaarde is het moeilijk om te manipuleren van cellen met optisch pincet. Vandaar, is het experiment moet worden uitgevoerd onder de overlap concentratie. Voor een oplossing van DEX, de overlapping concentratie is ca. 50 mg/mL (de kinetische viscositeit is 5,5 mm2/s). Zoals blijkt uit Ref. 9, werd een stabiele cellulaire vergadering waargenomen toen de concentratie van DEX 10 mg/mL tot 40 mg/mL. Dit resultaat wijst erop dat het effect van uitputting voldoende grote stabiele cel om contact te houden zelfs wanneer de DEX-concentratie lager dan de concentratie van de overlapping is. Het is aangetoond dat de toevoeging van DEX heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen tot 40 mg/mL 9.
De oprichting van een methode voor de bouw van 3D cellulaire assemblages is belangrijk op het gebied van regeneratieve geneeskunde, sinds het nabootsen van een in vivo cellulaire communicatie door het structureren van afzonderlijke cellen kan vergemakkelijken stamcel afkomstige weefsel vorming. Tot nu toe hebben we dit protocol gebruikt voor de bouw van cellulaire samenstellen met behulp van Neuro2A cellen9 naast NMuMG cellen. Wij hopen om een experimentele methode voor de bouw van 3D cellulaire assemblages voor een groter aantal cellen van verschillende morphologies. Het optisch pincet systeem ontwikkeld door Ichikawa et al. 13 zou gelden voor dit doel de oriëntatie van de cellen kan worden bestuurd. Verdere proeven langs deze lijnen moeten zijn veelbelovend.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Shu Hashimoto, Aoi Yoshida en Taeko Ohta Doshisha Universiteit voor hun gulle hulp bij de experimentele opzet. Dit werk werd ondersteund door KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) en door het MEXT-Supported-programma voor de strategische Research Foundation aan particuliere universiteiten. Deze studie werd ook ondersteund door een Poolse subsidie van het KNOW (toonaangevende nationale centrum voor onderzoek) wetenschappelijk Consortium "Gezond dier - veilig voedsel", besluit van Ministerie van Wetenschappen en hogeronderwijs nr. 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
