Summary
Eiwitten die specifieke RNA opeenvolgingen binden spelen een kritieke rol in genexpressie. Gedetailleerde karakterisering van deze bandplaatsen is van cruciaal belang voor ons begrip van de genexpressie. Hier, wordt een-voor-stapmodus aanpak voor verzadiging mutagenese van eiwit-bandplaatsen in RNA beschreven. Deze aanpak geldt voor alle websites van de binding aan eiwitten in RNA.
Abstract
Genregulatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling. Talrijke DNA - en RNA-bindende proteïnen binden hun doel sequenties met hoge specificiteit te controleren van de genexpressie. Deze regelgevende eiwitten bepalen de expressie van genen op het niveau van DNA (transcriptie) of op het niveau van RNA (pre-mRNA-splicing, polyadenylatie, mRNA vervoer, verval en vertaling). Identificatie van regulerende sequenties helpt te begrijpen niet alleen hoe een gen is overgeschakeld in- of uitschakelen, maar ook welke downstream genen worden gereguleerd door een bepaalde regelgevende proteïne. Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.
Introduction
Genregulatie speelt een belangrijke rol in de biologie. Genen kunnen worden geregeld op het niveau van de transcriptie, pre-mRNA-splicing, 3' eind vorming, RNA export, vertaling, lokalisatie van mRNA, verval, posttranslationele wijziging/stabiliteit, etc. die beide DNA - en RNA-bindende proteïnen spelen een sleutelrol in gen verordening. Terwijl moleculair genetische analyses hebben talrijke regelgevende proteïnen geïdentificeerd, hebben slechts een klein gedeelte van hen volledig was gekenmerkt voor hun cellulaire functies of bindende sites in vivo. Fylogenetische sequentieanalyse en mutagenese bieden complementaire benaderingen karakteriseren van DNA - of RNA-eiwit interacties.
RNA-bindende proteïnen zijn belangrijk in ontwikkelings processen, met inbegrip van seksuele differentiatie. De Drosophila eiwit Sex-dodelijke (SXL) of het geslacht-hoofdschakelaar eiwit ontbreekt in de mannetjes, maar heden bij vrouwtjes. Het herkent uridine-rijke sequenties of pyrimidine-traktaten grenzend aan specifieke splice sites in downstream pre-mRNA doelen (transformator, Sex-dodelijkeen man-specifieke lethal2) in somatische cellen1,2 ,3,4. Daarnaast reguleert het polyadenylatie site overschakelen door binding aan uridine-rijke polyadenylatie versterker sequenties in de versterker van rudimentaire (e(r)) transcript5,6. SXL waarschijnlijk regelt extra doelen in de vrouwelijke germline dat nog moet worden vastgesteld van1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Karakterisering van een bindende site impliceert typisch, mutagenese, bijvoorbeeld door schrapping of vervanging van één of meerdere nucleotiden. Elke mutant bindende site, ten opzichte van de wild-typen RNA volgorde, is vervolgens geanalyseerd met behulp van een reeks eiwitten concentraties te bepalen zijn bindende affiniteit (Kd of evenwicht dissociatie constant) voor de proteïne van belang; Kd is de eiwitconcentratie moet 50% RNA-bindende verkrijgen. Deze arbeidsintensieve proces van gedetailleerde mutagenese betreft generatie en analyse van talrijke mutanten — drie niet-wild type nucleotiden voor elke positie in de bindende site. Er is dus behoefte aan een alternatieve benadering voor snellere, eenvoudigere en goedkope verzadiging mutagenese van eiwit bandplaatsen in RNA.
Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Figuur 1 geeft een overzicht van phosphorothioate mutagenese en geeft een overzicht van belangrijke stappen in het proces.
1. generatie van een bibliotheek van mutanten — Doping DNA sjabloon met niet-wild Type nucleotiden
- Synthetiseren T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') door chemische synthese op een DNA synthesizer.
- Synthetiseren een gedoopt oligonucleotide (complementaire strand) door chemische synthese op een DNA-synthesizer die overeenkomt met de site van de bindende eiwit. Gebruik een passende mix van phosphoramidites tijdens de chemische synthese voor elke site van doping (X hieronder) met een ratio van 90% A als de wild-type nucleotide en 10% T als de niet-wild type nucleotide (Zie representatieve resultaten voor meer informatie over deze verhouding).
Opmerking: Hier, de volgorde van de gedoopt oligonucleotide is 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. De onderstreepte volgorde is de omgekeerde aanvulling van SXL eiwit bindende site, plus extra nucleotiden buiten de bindende site waarmee nuttige besturingselementen waarin wordt bevestigd dat niet elke wijziging in het RNA beïnvloedt bindend, maar ook als laden besturingselementen voor vergelijking en normalisering van nucleotiden in de bindende site. De SXL-bindende site reeks UUUUUGUUGUUUUUUUU, die aanwezig is in de transformator pre-mRNA14,15,16,17, werd gebruikt om de voorgestelde methodologie te ontwikkelen. De volgorde in cursief is een aanvulling op de volgorde van de primer T7 en de T7 promotor voor in vitro transcriptie.
2. synthese van RNA
-
RNA in een 20 µL transcriptie reactie, als eerder beschreven18synthetiseren.
- Mix-T7 transcriptie buffer en 1 µM T7 oligonucleotide, 1 µM doped oligonucleotide, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM elke ATP, CTP, en UTP (calciumguanosine, adenosine, cytosinetrifosfaat en uridine trifosfaat) en 2 U/µL T7 RNA-polymerase.
- Toevoegen, in twee aparte microcentrifuge buizen, 0.167 mM α-thio ATP of 0.05 mM α-thio UTP fosforthioaten (zie schema in Figuur 2) geïntegreerd RNAs.
Opmerking: Voor alternatieve protocollen, toevoegen 0.2 mM α-thio CTP of 0,2 mM α-thio GTP een passende transcriptie reageren met een gedoopt oligonucleotide om te testen van de twee resterende nucleotide vervangingen. - Incubeer de RNA-synthese reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- 2.5 µL hitte-labiele alkalisch fosfatase en 2.5 µL 10xphosphatase buffer toevoegen aan het RNA-monster. Deze 25 µL reactie gedurende 10-30 minuten bij 37 ° C te verwijderen 5' fosfaten uit te broeden.
- Inactivering van de alkalische fosfatase-enzym door verwarming bij 80 ° C gedurende 2-5 min.
- Radiolabel van het einde 5' van gedefosforyleerd RNA (5 pmole) met behulp van 1 µL T4 polynucleotide kinase en 1 µL γ -32P ATP in een 10 µL reactie volume. Incubeer de reactie mix gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C.
- Inactivering van de T4 polynucleotide kinase enzym door verwarming bij 65 ° C gedurende 20-30 min.
- Gel zuiveren het RNA door elektroforese in een 10% polyacrylamidegel denaturering. Zoek RNA op de gel met behulp van autoradiografie. Het segment van de gel met radiolabeled RNA accijnzen, verpletteren in een microcentrifuge-buis door te drukken tegen de muren met een pipet tip en geniet in proteïnase K (PK) buffer (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium dodecyl sulfaat). Draai de buis bij kamertemperatuur van 2 h tot 's nachts.
- Centrifugeer de gel drijfmest, negeren de gel en verzamelen van de bufferoplossing.
- Pak de oplossing tweemaal met gelijk volume van fenol-chloroform en een keer met chloroform en verzamelen van de waterige fase.
- Toevoegen aan het volume van de waterfase 0.1 van 3M Natriumacetaat, pH 5.2, vervoerder tRNA of glycogeen en 2.5 volume ethanol. Houd het monster bij-80 ° C gedurende 1 uur.
- Het monster gedurende 5-10 min. in een hoge snelheid microcentrifuge 16,873 x gcentrifugeren. Verwijder zorgvuldig de buffer/ethanol oplossing zonder verstoring van de RNA-pellet.
- Wassen van de pellet met 70% ethanol en Centrifugeer gedurende 2-5 min. verwijderen ethanol zorgvuldig. Droog de pellet in lucht.
- Resuspendeer de pellet in 20 – 50 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water. Bewaren bij-20 ° C tot gebruik.
Opmerking: Alle stappen met radiolabeled RNA met behulp van passende voorzorgsmaatregelen en over een plexiglas schild te beschermen tegen radioactiviteit. Op dit moment zijn draai kolommen veelgebruikte en handiger te verwijderen designated radioactiviteit, als alternatief voor de reiniging van het gel van RNA.
3. eiwit bindende reactie en scheiding van afhankelijke RNA
- De recombinante eiwitten in Express en zuiveren van E. coli.
- Recombinant eiwitconcentratie te schatten door spectrofotometrie of door onderscheid in een SDS-polyacrylamide-gel naast een bekende eiwit standaard, boviene serum albumine (BSA). Visualiseer de proteïne van belang en de BSA standaard door kleuring van de gel met Coomassie briljant blauw R-250. Kwantificeren van de proteïne in vergelijking met een bekende hoeveelheid BSA verdunningen op het zelfde gel.
Opmerking: Bewaar recombinant eiwit bij - 80 ° C tot gebruik en verdund in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic zuur (HEPES), pH 8,0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 0.05% NP-40, 20% glycerol. Gebruik van 0.5-1.0 mM protease inhibitor phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF) is optioneel. - Uitvoeren van RNA-bindende reactie (20-100 µL) van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 eenheden/µL RNase remmer, 0.09 µg/µL geacetyleerd bovien serumalbumine, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-eind radiolabeled RNA en 6 µL van (een geschikte concentratie concentratie waartegen ~ 50% van het RNA aan proteïne bindt) van het eiwit.
Nota: Deze bindende buffer werkt voor drie RNA-bindende proteïnen (SXL, U2AF65, en PTB), maar moet worden gestandaardiseerd voor een proteïne van belang. Eiwitconcentratie empirisch, schatten met behulp van verschillende verdunningen voor een bepaald eiwit-preparaat, die is vereist voor het verkrijgen van ongeveer 50% RNA-bindende. Deze voorwaarde of Kd vertegenwoordigt het meest gevoelige deel van de RNA-bindende-curve. - Incubeer de reactie van de bindende eiwit voor 20-30 min bij 25 ° C (of op ijs).
-
Scheiden de eiwit-afhankelijke RNA-Fractie van de niet-afhankelijke breuk met behulp van een van de twee benaderingen:
- Nitrocellulose filter bindende
- De bindende reactie (20-100 µL) toepassen op een nitrocellulose filter aangesloten op een vacuüm variëteit bij kamertemperatuur.
Opmerking: Alleen de RNA-eiwit complex wordt bewaard op het filter en niet-afhankelijke RNA stromen door de filter. De aanpak van de bindende filter kunt hogere herstel van de afhankelijke RNA en is sneller en eenvoudiger, in vergelijking met de gel assay voor de verschuiving van de mobiliteit. Door het plaatsen van een membraan DEAE onder het nitrocellulose filter is het ook mogelijk om te verzamelen van de niet-afhankelijke RNA-fractie of gratis RNA voor vergelijking met de gebonden Fractie. - Het gedeelte van het nitrocellulose filter met de ingehouden knippen radioactieve RNA in kleinere stukken te passen in een microcentrifuge buis, geniet in voldoende PK buffer (300 – 500 µL met 10-20 µg PK) om onder te dompelen de filter stukken en elueer RNA van het filter voor 2 tot 3 h of 's nachts.
- Pak met fenol-chloroform, chloroform, en verzamelen van de waterige fase. Natriumacetaat en ethanol toevoegen na incubatie in vriezer, centrifugeren, wassen, drogen en resuspendeer RNA in DEPC-behandeld water. Ga als volgt te werk zoals beschreven in stappen 2.10 tot en met 2.14 boven.
- De bindende reactie (20-100 µL) toepassen op een nitrocellulose filter aangesloten op een vacuüm variëteit bij kamertemperatuur.
- Gel mobiliteit shift
- Bereiden en te polymeriseren een inheemse polyacrylamidegel van 5% (60:1 Acrylamide:bis-acrylamide) in 0,5 x TBE (standaard Tris-boraat-EDTA-buffer) voordat de bindende reactie, als alternatief voor de filter bindende methode.
- Stel vooraf de gel gedurende 15 minuten bij 250 V in een koude kamer (4 ° C).
- Laad elke bindende reactie (boven) in aparte putjes van de bovenstaande vooraf uitvoeren gel.
Opmerking: De buffer van de opslag eiwit biedt voldoende glycerol hetvullenvan monster wells. - Scheiden het RNA eiwitten gebonden door de Elektroforese van het gel in een koude kamer op 250 V gedurende 1 tot 2 uur, afhankelijk van de grootte van RNA en de specifieke proteïne.
- Zoek de positie van het RNA-eiwit complex aan de gel met behulp van autoradiografie. Accijnzen het gel-segment met de RNA-eiwit complex. Elueer RNA van het gel-segment door het verpletteren van het gel-segment en onderdompelen in de PK-buffer.
- Pak met fenol-chloroform, chloroform, en verzamelen van de waterige fase. Natriumacetaat en ethanol toevoegen na incubatie in vriezer, centrifugeren, wassen, lucht droog, en resuspendeer RNA in DEPC-behandeld water. Ga als volgt te werk zoals beschreven in stappen 2.10 tot en met 2.14 boven.
- Nitrocellulose filter bindende
4. analyse van jodium-gekloofd Phosphorothioate producten voor detectie van Mutant Nucleotide posities
- Toevoegen van 1 mM jodium in een 20 µL DEPC-behandeld water met maximaal 10 µg vervoerder tRNA te klieven RNAs (afhankelijke en totale RNAs) op de sites phosphorothioate statuten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
Opmerking: Meer informatie over jodium decolleté met iets andere voorwaarden — 7% (v/v) iodoethanol, Verwarming op 95 ° C gedurende 3 min — kan worden gevonden in Gish & Eckstein 198819. - Neerslag gekloofd RNA door toevoeging van natrium acetaat/ethanol, zoals hierboven beschreven. Resuspendeer in een laden kleurstof voor denaturering gels. Verhit en laden van het monster te scheiden van de fragmenten van RNA door elektroforese in een denatureren polyacrylamidegel van 15-20%.
- Bloot het polyacrylamidegel naar een X-ray film.
- Detecteren bands in de gebonden fractie ten opzichte van de totale pool met behulp van autoradiografie.
Opmerking: Voer alle stappen uit met jodium in de kap van een uitlaat. Voor RNA scheiding komt hier te staan, is een wig-vormige gel gebruikt, die wordt bereikt door een verdubbeling van de dikte van de beide afstandhouders aan de onderkant van de gel-platen door het invoegen van een extra duim lang spacer aan de onderkant van de gel. Deze shape kunt meer eenvormige of dichter afstand tussen kortere fragmenten van RNA. U kunt ook kan een phosphorimager worden gebruikt in plaats van X-ray films voor detectie en kwantificatie van radioactiviteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beginsel van verzadiging mutagenese met behulp van doping:
Voor een passende molaire verhouding van wild-type en andere nucleotiden, door een gelijke mix van alle vier nucleotiden te gebruiken als slechts één positie is om te worden geanalyseerd. Echter als meerdere posities gelijktijdig worden geanalyseerd, moet de verhouding van niet-wild type te wild-type nucleotiden worden aangepast, dat wil zeggen, verminderd. Anders, naast enkele vervangingen, die gewenst is, er zullen ook sjablonen met meerdere niet-wild type nucleotiden in een molecuul, uitschakeling van de analyse van het effect van single-nucleotide vervangingen. Dus, als een vuistregel, gebruik een verhouding van niet-wild type te wild-type nucleotiden van 1/n, waarbij n staat voor het aantal posities te analyseren. Hier, we 10 posities tegelijkertijd geanalyseerd en gebruikt een mengsel dat 90% van de wild-type nucleotide en 10% van de niet-wild type nucleotide voor doping van de DNA-sjabloon bevat. Aparte transcriptie reacties zijn gedaan, waarin elke reactie transcriptie is uitgevoerd met een van de vier fosforthioaten. Zo controleert elke reactie een specifieke nucleotide op de gedoopt posities.
Beginsel van partitioneren als gevolg van storingen:
In de hier gepresenteerde benadering mutagenese, hebben RNAs gemiddeld minder dan één phosphorothioate residu per molecuul. Tijdens het proces van bindende, RNA moleculen afscheiding tussen de eiwit gebonden Fractie en de niet-afhankelijke breuk. Aangezien een bepaalde nucleotide is gekoppeld aan een phosphorothioate koppeling, is splitsing van de phosphorothioate backbone koppeling een uitlezing van de aanwezigheid van een specifieke nucleotide op die positie. Verwacht wordt dat wanneer een nucleotide is gewijzigd op een bepaalde positie, het kan ofwel geen invloed op bindende hebben of het bindend, geheel of gedeeltelijk remmen kan. Als de aanwezigheid van een specifieke nucleotide heeft geen effect op de binding zal het partitioneren even tussen de eiwit-gebonden en niet-afhankelijke breuken. Echter, als een specifieke nucleotide op een bepaalde positie met binding aan eiwitten interfereert het zal worden netcongestieproblemen uitgesloten van het eiwit gebonden Fractie. De mate van interferentie kan kwantitatief worden gecontroleerd voor elk van de posities in de dezelfde reactie na gelelektroforese. Dit concept wordt geïllustreerd in een schema (Figuur 3). In totaal RNA fractie lane (T) is de intensiteit van de band ongeveer gelijk voor alle gedoopt posities (banden 1, 3-7). In eiwit-afhankelijke RNA fractie lane (B), op posities 1, 4 en 7 heeft de nucleotide geen effect op de binding. Echter, op positie 3 en 6, het interfereert met bindende en dus van de gebonden fractie is uitgesloten. Op positie 5 is inmenging gedeeltelijke. Vergelijkingen van vier gepaarde rijstroken, T en B voor elk nucleotide, is dus voorzien van analyse van alle vier nucleotiden. Het moet worden opgemerkt dat nucleotide wild-type voor een bepaalde positie weerspiegelt het effect, indien van toepassing, van zwavel in de ruggengraat van de RNA op binding aan eiwitten.
Het begeleidende autoradiograph (Figuur 4) toont twee paren (α-thio A en α-thio-U) van rijstroken uit een denatureren gel (T voor het totale zwembad) en B voor gebonden Fractie. Verscheidene opmerkingen kunnen worden gemaakt door het vergelijken van de intensiteiten van de bands op elke positie tussen elk paar van rijstroken (T en B). Ten eerste, de meerderheid van het signaal is aan de bovenkant van de gel, dat wil zeggen, uncleaved product, voor beide α-thio een lane en α-thio U lane. Ten tweede, voor α-thio A paar rijstroken, verschillende bands (jodium splitsingsproducten) zijn identiek tussen de gebonden en de totale RNA breuken bijvoorbeeld banden boven 1; relevante banden binnen de bindende site voor de α-thio een baan zijn genummerd voor referentie. Ten derde, de banden aan de onderkant van de gel zijn meer (bijv . de banden minder dan 6) nauw verdeeld dan gebruikelijk voor een sequencing gel is. Ten vierde, verschillende bands zijn aanwezig in de totaal RNA-fractie maar afwezig of sterk gereduceerde in de afhankelijke RNA-fractie (bijvoorbeeld banden 1, 2, 3 en 5). Ten vijfde, voor het α-thio U lane paar, terwijl de meeste bands vergelijkbaar tussen de totale en afhankelijke rijstroken zijn, sommige bands zijn relatief minder intens in de gebonden fractie (bijvoorbeeld banden 7 en 8).
Deze opmerkingen leveren bewijs voor de succesvolle ontwikkeling van deze nieuwe methode en leiden tot de volgende conclusies: ten eerste, voor zowel α-thio A paar straatjes en α-thio U rijstroken, koppelt omdat de meeste van de RNA uncleaved, het bewijs levert dat slechts een klein deel van het RNA bevat bewerkt of phosphorothioate residuen. Dit is belangrijk omdat het vaststelt dat RNA-moleculen niet meer dan één phosphorothioate residu bevatten. Tweede, identieke of soortgelijke intensiteiten voor verschillende bands buiten de site van de binding tussen de twee rijstroken, voor zowel α-thio A en α-thio U, aantonen dat laden vergelijkbaar zijn voor beide rijstroken is, zodat eenvoudige vergelijking tussen rijstroken. Derde, nauwer verdeelde bands zijn bereikt voor α-thio A en α-thio U, door de wig-vorm van de gel (dunner aan de bovenkant en aan de onderkant dikker), dus waardoor analyse van langere volgorde leest en het aanbieden van hogere resolutie. Meestal kortere fragmenten wijder gelijkmatig verdeeld in een gel met uniforme dikte. Ten vierde, verdwijning of lagere intensiteit van bepaalde banden in de gebonden fractie geeft aan dat de niet-wild-type nucleotide netcongestieproblemen is uitgesloten van de gebonden fractie (α-thio-A). Relatieve intensiteiten van verschillende bands binnen de afhankelijke baan bieden ook kwantitatieve informatie over de omvang van de inmenging van niet-wild type residuen op verschillende locaties. Met andere woorden, interfereren de mutant of de niet-wild type nucleotiden op specifieke posities met de binding aan eiwitten. Tot slot, het testen van het effect van de ruggengraat zwavel substitutie (phosphorothioate) op een van de oxygens van niet-overbruggen (α-thio-U), toont dat drie posities Toon kleine effecten van ruggengraat sulfurs (b.v., 6, 7 en degene onder 7). Onze gecombineerde resultaten tonen aan dat verschillende posities binnen de bindende site Toon preferentiële verdwijning of verlaagd intensiteiten van specifieke bands in de gebonden Fractie. Dit is te wijten aan de substitutie van base in plaats van ruggengraat, die aangeeft eiwitinteractie met specifieke honken in de bindende site (α-thio-A). Ondertussen, opneming van α-thio C toont een interferentiepatroon vergelijkbaar met α-thio-A. Slechts 3-4 α-thio G vervangingen Toon kleine maar aantoonbaar interferentie gecentreerd rond, bijvoorbeeld, posities genummerde 2 en 3 (gegevens niet worden weergegeven). Deze methode is gebruikt voor het onthullen van de verschillen in hoe de splicing onderdrukker SXL en de algemene splicing factor U2 snRNP ondersteunende Factor (U2AF65) aan een identieke pre-mRNA splicing signaal sequentie (polypyrimidine-darmkanaal) op verschillende wijze15 binden .
Figuur 1: stroomschema van sleutel stappen in phosphorothioate mutagenese (PTM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische van de koppeling van een phosphorothioate tussen twee nucleotiden, die chemisch kunnen worden cleaved door jodium. Zwavel wordt vervangen door een van de niet-overbruggen fosfaat oxygens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: beginsel van partitioneren als gevolg van interferentie. Hypothetische RNA bevat representatieve α-thio nucleotiden op zes posities, met inbegrip van een binding aan eiwitten site. Na binding aan eiwitten, RNA is gekloofd op sites van phosphorothioate opneming door jodium. Posities 1 tot en met 7 binnen en rond de bindende site worden willekeurig genummerd voor de verwijzing in de tekst. Positie 2 of ontbrekende band voorstelt geen phosphorothioate opneming of niet-doped nucleotide. Lane T is totaal RNA en lane B is eiwit-afhankelijke RNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Phosphorothioate mutagenese (PTM) aanpak maakt het mogelijk verzadiging mutagenese voor een polypyrimidine-darmkanaal/3 ' splice site aanwezig in de transformator pre-mRNA. Lane T is totaal RNA en lane B is eiwit-afhankelijke RNA. Α-thio een vertegenwoordigt RNA gesynthetiseerd in aanwezigheid van α-thio ATP en identificeert gedoopt posities met α-thio-adenosines in de reeks. Drie sterke banden komen overeen met de adenosines in de reeks op die posities. Α-thio-U vertegenwoordigt RNA gesynthetiseerd in aanwezigheid van α-thio UTP en identificeert alle uridines, met inbegrip van gedoopt posities, in de volgorde. Verticale lijn aan de linkerkant markeert de SXL bindende site. 1 – 8 posities binnen de bindende site worden genummerd voor referentiedoeleinden en voor het gemak van de beschrijving in de sectie resultaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagenese heeft lange tijd gebruikt om het eiwit bandplaatsen karakteriseren. Eerst kan een aantal mutanten worden gebouwd en individueel getest in de testen voor het analyseren van de gevolgen daarvan voor affiniteit bindend bindend. Hoewel een standaard mutagenese aanpak biedt een manier om te analyseren verschillende reeksen, meerdere stappen betrokken bij de standaardbenadering, zoals de bouw van mutanten en uitvoeren van een reeks van bindende reacties voor elke mutant, is moeizaam en tijdrovend en kan niet het toestaan van verzadiging mutagenese, speciaal voor langere sequenties. Ten tweede, een reeks gerandomiseerde kan worden en het zwembad gebruikt voor meerdere cycli van bindende en polymerase-kettingreactie (PCR) versterking. Deze sequenties die eiwit binden moet worden gekloond en sequenced ter identificatie en validatie van een bindende site from the consensus-reeks. Echter deze iteratieve bindende en versterking optie bestaat uit meerdere stappen en is moeizaam in het identificeren van residuen die belangrijk zijn binnen de bindende site. Bovendien kunnen herhaalde sequentie amplifications die inherent zijn aan PCR reeks bias invoeren. Ten derde, reeksen geselecteerd uit de random pool kunnen worden sequenced met behulp van een snellere optie van hoge-doorvoer sequencing, hoewel het is relatief duur. Daarom, om deze beperkingen van meerdere stappen, moeizame en/of dure methoden, te overwinnen wij bedacht een snellere, goedkoop, en nog belangrijker een-voor-stapmodus, hier beschreven methode, om te bereiken van verzadiging mutagenese van een bindende site (PTM).
De belangrijkste stappen in deze aanpak bevatten identificatie of tagging van de niet-wild-type nucleotide(s). We gebruikten phosphorothioate nucleotiden, waarin men van de oxygens in de fosfaat ruggengraat is gesubstitueerd met zwavel, als beschreven (Figuur 2). Het voordeel is dat jodium kan worden gebruikt om het chemisch klieven de ruggengraat van de nucleotide phosphorothioate. Dus, jodium splitsing van het RNA-substraat met de ruggengraat van een phosphorothioate genereert een sequentie-type ladder, waar de site van decolleté is een proxy of label voor de aanwezigheid van een van de vier baseert op die positie. Een vergelijking van de niet-afhankelijke en totale gehalten identificeert residuen die bij voorkeur zijn uitgesloten van de gebonden Fractie en dus zijn belangrijk voor de binding aan eiwitten. Daarentegen blijven de residuen die niet belangrijk zijn voor een inbinding gelijkelijk verdeeld tussen de twee breuken. Deze benadering kan worden gebruikt om te definiëren bandplaatsen voor elke RNA-bindende eiwit.
Kortom biedt deze one-step verzadiging mutagenese aanpak, het combineren van doping, fosforthioaten, en jodium decolleté, een krachtig instrument voor de karakterisering van een bindende site in RNA. Deze aanpak vereist echter dat de bindende site al vóór mutagenese is bekend. Eiwit-bindende voorwaarden moeten bovendien geoptimaliseerd voor elk eiwit. De volgende voorzorgsmaatregelen moeten worden benadrukt. Voorzorgsmaatregelen voor RNA behandeling moeten worden uitgeoefend, zoals het dragen van handschoenen, voorbereiding van oplossingen, en buffers in de DEPC-behandeld water, autoclaaf Pipetteer tips en buizen, en wijdt apparatuur voor RNA alleen gebruiken om te voorkomen dat RNAses. Zorg waarbij radioactieve schilden, radioactieve controle terwijl met behulp van radioactief materiaal is van essentieel belang, en het gebruik van uitlaat kap tijdens het gebruik van gevaarlijke chemische stoffen zijn ook nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteur dankt de National Institutes of Health voor de afgelopen financiering en Bedankt Michael R. Green voor synthese oligonucleotides.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
