Summary
Proteínas que se ligam a sequências específicas de RNA desempenham um papel crítico na expressão do gene. Caracterização detalhada destes sítios de ligação é fundamental para nossa compreensão da regulação genética. Aqui, uma abordagem passo a passo para mutagénese saturação de proteína ligadora de sites no RNA é descrita. Esta abordagem é relevante para todos os sites de proteína ligadora de RNA.
Abstract
Regulação genética desempenha um papel importante no desenvolvimento. Inúmeras proteínas do DNA e RNA-vinculação vincular suas sequências alvo com alta especificidade para controlar a expressão gênica. Estas proteínas reguladoras controlam a expressão gênica a nível de DNA (transcrição) ou no nível do RNA (pre-mRNA emendar, poliadenilação, transporte do mRNA, decadência e tradução). Identificação de sequências reguladoras ajuda a entender não só como um gene é ligado ou desligado, mas também que a jusante genes são regulados por uma determinada proteína reguladora. Aqui, descrevemos uma abordagem de uma etapa que permite mutagênese de saturação de um sítio de ligação da proteína no ARN. Trata-se modelo de DNA com não-selvagem-tipo nucleotídeos dentro do site de ligação, síntese de RNAs separados com cada nucleotídeo phosphorothioate e isolamento da fração ligada após incubação com proteína de doping. Interferência de nucleotídeos do selvagem-tipo não resulta em sua exclusão preferencial da fracção ligados a proteína. Isto é monitorado por eletroforese em gel de clivagem química seletiva com iodo de ligações fosfodiéster contendo fosforotioatos (phosphorothioate mutagênese ou PTM) a seguir. Esta abordagem de mutagênese de etapa única de saturação é aplicável para a caracterização de qualquer sítio de ligação da proteína no ARN.
Introduction
Regulação genética desempenha um papel importante na biologia. Os genes podem ser regulados ao nível da transcrição de emenda pre-mRNA, 3' final formação, exportação de RNA, tradução, localização de mRNA, decadência, modificação borne-translational/estabilidade, etc. ambos DNA e RNA-proteínas desempenham um papel chave no gene Regulamento. Enquanto as análises de genéticas moleculares identificaram inúmeras proteínas reguladoras, apenas um pequeno subconjunto deles foram caracterizados inteiramente para suas funções celulares ou vinculação sites em vivo. Mutagênese e análise filogenética sequência oferecem abordagens complementares para caracterizar as interações de DNA ou RNA-proteína.
RNA-proteínas são importantes em processos de desenvolvimento, incluindo a diferenciação sexual. A proteína de Drosophila sexo-letal (SXL) ou a proteína do sexo-interruptor geral está ausente em machos, mas presente nas fêmeas. Ele reconhece sequências de uridina-rico ou pirimidina-terras adjacentes aos locais específicos da tala em alvos a jusante pre-mRNA (transformador, sexo-letale lethal2 macho-específico) em células somáticas1,2 ,3,4. Além disso, regula o sítio de poliadenilação comutação por ligação a sequências de potenciador uridina-ricos poliadenilação na transcrição potenciador de rudimentar (e(r))5,6. SXL provável regula alvos adicionais no germline feminino continuam a ser identificado1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Normalmente, a caracterização de um sítio de ligação envolve mutagênese, por exemplo, por exclusão ou substituição de um ou vários nucleotídeos. Cada sítio de ligação de mutantes, em relação a sequência de RNA do tipo selvagem, então é analisado usando uma série de concentrações de proteína para determinar sua afinidade de ligação (dissociaçãoKd ou equilíbrio constante) da proteína de interesse; Kd é a concentração de proteína necessária para obter a ligação de RNA de 50%. Este processo trabalhoso de mutagénese detalhada envolve geração e análise de mutantes numerosos — três nucleotídeos de tipo não-selvagem para cada posição no sítio de ligação. Assim, há uma necessidade de uma abordagem alternativa para mutagénese mais rápido, mais simples e barato de saturação dos sítios de ligação da proteína no ARN.
Aqui, descrevemos uma abordagem de uma etapa que permite mutagênese de saturação de um sítio de ligação da proteína no ARN. Trata-se modelo de DNA com não-selvagem-tipo nucleotídeos dentro do site de ligação, síntese de RNAs separados com cada nucleotídeo phosphorothioate e isolamento da fração ligada após incubação com proteína de doping. Interferência de nucleotídeos do selvagem-tipo não resulta em sua exclusão preferencial da fracção ligados a proteína. Isto é monitorado por eletroforese em gel de clivagem química seletiva com iodo de ligações fosfodiéster contendo fosforotioatos (phosphorothioate mutagênese ou PTM) a seguir. Esta abordagem de mutagênese de etapa única de saturação é aplicável para a caracterização de qualquer sítio de ligação da proteína no ARN.
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Protocol
Nota: Figura 1 fornece uma visão geral de phosphorothioate mutagênese e resume as principais etapas do processo.
1. geração de uma biblioteca de mutantes — modelo de DNA com não-selvagem tipo nucleotídeos de Doping
- Sintetizar T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') por síntese química em um sintetizador de DNA.
- Sintetiza um dopado do oligonucleotide (cadeia complementar) por síntese química em um sintetizador de DNA correspondente para o sítio de ligação da proteína. Use uma mistura adequada de phosphoramidites durante a síntese química para cada site de dopagem (X abaixo) com uma proporção de 90% A como o nucleotídeo do selvagem-tipo e 10% T como o nucleotídeo do tipo não-selvagem (veja resultados representativos para mais pormenores sobre esta relação).
Nota: Aqui, a sequência do dopado do oligonucleotide é 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. A sequência de sublinhado é o complemento reverso do sítio de ligação de proteínas SXL, além de nucleotídeos adicionais fora do sítio de ligação que fornecem controles úteis confirmando que nem toda mudança no ARN afeta vinculativas, bem como sendo controles de carregamento para comparação e normalização de nucleotídeos dentro do sítio de ligação. A sequência do local SXL-ligação UUUUUGUUGUUUUUUUU, que está presente no transformador pre-mRNA14,15,16,17, foi usada para elaborar a metodologia proposta. A sequência em itálico é complementar à sequência da primeira demão de T7 e o promotor T7 para transcrição em vitro .
2. síntese de RNA
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Sintetiza RNA em uma reação de transcrição de 20 µ l, como descrito anteriormente,18.
- Buffer de transcrição Mix T7 e oligonucleotide de T7 1 µM, 1 µM dopado do oligonucleotide, 10mm ditiotreitol (DTT), 2mm GTP, 1mm cada ATP, CTP e UTP (guanosina, adenosina, citidina e uridina trifosfato) e 2 U / µ l T7 ARN-polimerase.
- Adicionar, em dois tubos separados microcentrifuga, 0,167 mM α-thio ATP ou 0,05 mM α-thio UTP para incorporar RNAs fosforotioatos (ver esquema na Figura 2).
Nota: Para protocolos alternativos, adicione 0,2 mM α-thio CTP ou 0,2 mM α-thio GTP para uma reação apropriada transcrição contendo um dopado do oligonucleotide para testar os dois restantes substituições de nucleotídeos. - Incubar a mistura de reação de síntese de RNA durante 2 h a 37 ° C.
- Adicione 2,5 µ l calor-labile da fosfatase alcalina e buffer de 10xphosphatase 2,5 µ l da amostra de RNA. Incube a esta reação µ l 25 por 10 a 30 min a 37 ° C para remover 5' fosfatos.
- Inativar a enzima fosfatase alcalina por aquecimento a 80 ° C, durante 2-5 min.
- Radiolabel a extremidade 5' do RNA dephosphorylated (pmole 5) usando 1 quinase de polinucleotido µ l T4 e 1 µ l γ -32P ATP em um volume de reação de 10 µ l. Incubar a mistura de reação para 30 a 60 min a 37 ° C.
- Inativar a enzima de quinase de polinucleotido T4 por aquecimento a 65 ° C, durante 20 a 30 min.
- Gel de purificar o RNA por eletroforese em um gel de poliacrilamida de desnaturação de 10%. Localize o RNA em gel por autoradiografia. Impostos especiais de consumo a fatia de gel contendo RNA radiolabeled, esmagar em um tubo de microcentrifuga pressionando contra as paredes com uma ponta de pipeta e mergulhe no buffer de proteinase K (PK) (100 mM Tris, pH 7,5, 12,5 mM EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de sódio Dodecil sulfato). Gire o tubo à temperatura de 2 h durante a noite.
- Centrifugue o gel de chorume, descartar o gel e recolher a solução-tampão.
- Extrair a solução duas vezes com igual volume de fenol-clorofórmio e uma vez com clorofórmio e recolher a fase aquosa.
- Adicionar o volume da fase aquosa 0,1 de 3M de acetato de sódio, pH 5.2, transportadora tRNA ou glicogênio e 2.5 volume de etanol. Manter a amostra a-80 ° C durante 1 h.
- Centrifugar a amostra para 5 a 10 min em alta velocidade microcentrifuga a 16.873 x g. Remova cuidadosamente a solução tampão/etanol sem perturbar a pelota do RNA.
- Lave o pellet com 70% de etanol e centrifugar para etanol de 2 – 5 min. Retire com cuidado. Seque a pelota no ar.
- Resuspenda o pellet em 20 – 50 µ l pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-água tratada. Armazenar a-20 ° C até o uso.
Nota: Execute todas as etapas com RNA radiolabeled usando as precauções apropriadas e um escudo de acrílico para proteger de radioatividade. Atualmente, colunas de rotação são mais comumente usada e mais conveniente para remover radioatividade sem personalidade jurídica, como uma alternativa ao gel de purificação do RNA.
3. proteína de ligação de reação e separação do RNA ligado
- Expressar a proteína recombinante em e purificar de e. coli.
- Estimar a concentração de proteína recombinante por espectrofotometria ou separando-se em um gel de SDS-poliacrilamida ao lado de uma proteína conhecida padrão, bovina albumina (BSA). Visualize a proteína de interesse e a BSA padrão manchando o gel com azul de Coomassie brilhante R-250. Dose as proteínas em comparação com quantidades conhecidas de diluições de BSA no mesmo gel.
Nota: Guarde a proteína recombinante no - 80 ° C até o uso e a diluir em 20 mM 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-ácido etanesulfónico (HEPES), pH 8.0, 1mm ditiotreitol (DTT), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,05% de 0.2 mM NP-40, 20% de glicerol. Uso de 0,5 m a 1,0 fluoreto de sulfonila de phenylmethane para inibidor de protease mM (PMSF) é opcional. - Realizar a reação de RNA-obrigatórias (20 – 100 µ l) em 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 milímetro DTT, 50 mM KCl, inibidor de RNase 0,5 unidades / µ l, 0,09 µ g / µ l acetilado albumina de soro bovino, 1 mM EDTA, 0,15 µ g / µ l tRNA, 5'-final radiolabeled RNA e 6 µ l de concentração adequada (uma concentração na qual ~ 50% do RNA liga-se à proteína) da proteína.
Nota: Este tampão de ligação funciona para três proteínas RNA-obrigatórias (SXL, U2AF,65e PTB), mas deve ser padronizado para uma proteína de interesse. Estimar a concentração de proteína empiricamente, utilizando várias diluições para uma preparação de determinada proteína, que é necessário para obter cerca de 50% a ligação de RNA. Esta condição ou Kd representa a parte mais sensível da curva de RNA-obrigatórias. - Incube a reação de ligação de proteínas por 20 a 30 min a 25 ° C (ou no gelo).
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Separe a fração de RNA proteínas da fracção não acoplada usando uma das duas abordagens:
- Ligação do filtro de nitrocelulose
- Aplicam-se a reação de ligação (20 – 100 µ l) em um filtro de nitrocelulose, conectado a um distribuidor de vácuo à temperatura ambiente.
Nota: Apenas o complexo RNA-proteína é retido no filtro e desacoplado RNA flui através do filtro. A abordagem de ligação do filtro permite maior recuperação do RNA ligado e é mais rápido e mais simples, comparado com o ensaio de turno de mobilidade de gel. Também é possível coletar a fração de RNA não acoplada ou livre de RNA para comparação com a fração ligada pela colocação de uma membrana DEAE debaixo do filtro de nitrocelulose. - Cortar a parte do filtro de nitrocelulose contendo o retido RNA radioativo em pedaços menores para caber em um tubo de microcentrifugadora, mergulhe no buffer suficiente de PK (300-500 µ l contendo 10 – 20 µ g PK) imergir as peças do filtro e eluir RNA do filtro para 2-3 h ou durante a noite.
- Extraia com fenol-clorofórmio, clorofórmio e recolher a fase aquosa. Adicionar etanol e acetato de sódio e, após incubação no freezer, centrífuga, lavar, secar e resuspenda o RNA em água tratada DEPC. Siga estas etapas conforme detalhado nas etapas 2.10 para 2.14 acima.
- Aplicam-se a reação de ligação (20 – 100 µ l) em um filtro de nitrocelulose, conectado a um distribuidor de vácuo à temperatura ambiente.
- Turno de mobilidade de gel
- Preparar e polimerizar-se um gel de polyacrylamide nativo de 5% (60:1 Acrylamide:bis-acrilamida) em 0,5 x TBE (tampão Tris-borato-EDTA-padrão) antes de iniciar a reação de ligação, como uma alternativa para o método de ligação do filtro.
- Pre-funcione o gel durante 15 min em 250 V em um quarto frio (4 ° C).
- Carrega cada reação de ligação (acima) em poços separados do gel pré-execução acima.
Nota: O buffer de armazenamento de proteínas fornece glicerol suficiente para carregamento de amostra em poços. - Separe o proteínas RNA por eletroforese em gel em uma sala fria a 250 V para 1 a 2 h, dependendo do tamanho de RNA e proteínas específicas.
- Localize a posição do complexo RNA-proteína em gel por autoradiografia. Impostos especiais de consumo a fatia de gel contendo o complexo RNA-proteína. Eluir o RNA da fatia gel esmagando a fatia de gel e imersão no buffer de PK.
- Extraia com fenol-clorofórmio, clorofórmio e recolher a fase aquosa. adicionar etanol e acetato de sódio e, após incubação no freezer, centrífuga, lavar, ar seco e ressuspender o RNA em água tratada DEPC. Siga estas etapas conforme detalhado nas etapas 2.10 para 2.14 acima.
- Ligação do filtro de nitrocelulose
4. análise de iodo-clivada Phosphorothioate produtos para detecção de posições do Nucleotide mutante
- Adicionar iodo de 1 mM em um 20 µ l água tratada com DEPC contendo até 10 µ g transportadora tRNA para clivar RNAs (RNAs acoplados e totais) aos sítios de phosphorothioate incorporação. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
Nota: Maiores detalhes no decote de iodo com condições ligeiramente diferentes — iodoethanol de 7% (v/v), aquecimento a 95 ° C por 3 min — podem ser encontradas em Gish & Eckstein 198819. - Precipitar o RNA clivado pela adição de acetato de sódio (etanol), conforme descrito acima. Resuspenda em uma tintura de carregamento para géis de desnaturação. Aqueça e carregar a amostra para separar fragmentos de RNA por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturação 15 – 20%.
- Expor o gel de poliacrilamida, para um filme de raio-x.
- Detecta bandas na fração vinculada versus pool total usando autoradiografia.
Nota: Execute todas as etapas com iodo no aspirante. Para a separação de RNA mostrada aqui, é empregado um gel em forma de cunha, que é conseguida dobrando a espessura dos dois espaçadores na parte inferior das placas de gel, inserindo um espaçador extra polegadas de comprimento na parte inferior do gel. Esta forma permite mais espaçamento uniforme ou mais estreita entre fragmentos de RNA mais curtos. Alternativamente, um phosphorimager pode ser usado em vez de filmes de raio-x para detecção e quantificação de radioactividade.
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Representative Results
Princípio de mutagénese saturação utilizando dopagem:
Para uma adequada relação molar do selvagem-tipo e outros nucleotídeos, use uma mistura igual de todos os quatro nucleotídeos se houver apenas uma posição para ser analisado. No entanto, se várias posições são analisadas simultaneamente, a relação de não-selvagem tipo de nucleotídeos do selvagem-tipo deve ser ajustada, ou seja, reduzido. Caso contrário, além de simples substituições, que é desejado, também haverá modelos com vários não-selvagem tipo nucleotídeos em uma molécula, impossibilitando a análise do efeito do único-nucleotide substituições. Assim, como regra geral, use uma relação de tipo não-selvagem de nucleotídeos do selvagem-tipo de 1/n, onde n é o número de posições a serem analisados. Aqui, analisamos 10 posições simultaneamente e usado uma mistura contendo 90% do nucleotide selvagem-tipo e 10% do tipo non-wild nucleotide por doping do molde de ADN. Reações de transcrição separadas são feitas, na qual cada reação de transcrição é realizada com um dos quatro fosforotioatos. Assim, cada reação monitora um nucleotídeo específico nas posições dopados.
Princípio de particionamento devido à interferência:
Na abordagem de mutagénese aqui apresentada, RNAs têm em média menos de um resíduo phosphorothioate por molécula. Durante o processo de vinculação, partição de moléculas de RNA entre a fração de proteínas e a fração não acoplada. Desde que um nucleotídeo específico estiver vinculado a um enlace phosphorothioate, clivagem da ligação phosphorothioate espinha dorsal é uma leitura da presença de um nucleotídeo específico naquela posição. Espera-se que em qualquer determinada posição, quando um nucleotídeo é mudado pode ou não têm efeito sobre vinculação ou pode inibir a ligação, parcialmente ou completamente. Se a presença de um nucleotídeo específico não tem efeito sobre vinculação particionará igualmente entre as frações de proteína vinculado e não vinculadas. No entanto, se um nucleotídeo específico em uma determinada posição interfere com ligação às proteínas é preferencialmente excluído da fracção ligados a proteína. O grau de interferência pode ser monitorado quantitativamente para cada uma das posições na mesma reação após eletroforese em gel. Este conceito é ilustrado em um esquema (Figura 3). Na fração de RNA total (pista T), a intensidade da banda é aproximadamente igual para todas as posições dopadas (faixas 1, 3 – 7). Em fração de RNA de proteínas (lane B), nas posições 1, 4 e 7, o nucleotídeo não tem efeito na ligação. No entanto, nas posições 3 e 6, isso interfere com ligação e, portanto, é excluído da fracção ligada. Na posição 5, a interferência é parcial. Assim, comparações de quatro pistas emparelhadas, T e B para cada nucleotídeo, permitem a análise de todos os quatro nucleotídeos. Deve ser observado o nucleotídeo do selvagem-tipo para uma determinada posição reflete o efeito, se houver, de enxofre na espinha dorsal do RNA na ligação às proteínas.
O acompanhamento autoradiograph (Figura 4) mostra dois pares (A α-thio e α-thio U) das pistas de um gel de desnaturalização (T para pool Total) e B para fração acoplada. Várias observações podem ser feitas, comparando as intensidades das bandas em cada posição entre cada par de pistas (T e B). Primeiro, a maioria do sinal está no topo do gel, ou seja, uncleaved produto, para ambos os α-thio uma pista de lane e α-thio U. Em segundo lugar, para pistas de par A α-thio, várias bandas (produtos de clivagem de iodo) são idênticas entre o limite e as frações de RNA totais, por exemplo, bandas acima de 1; bandas relevantes dentro do sítio de ligação para o α-thio uma pista são numeradas para referência. Terceiro, as bandas na parte inferior do gel são mais espaçadas (por exemplo, bandas abaixo 6) do que é habitual para um gel de sequenciamento. Em quarto lugar, várias bandas estão presentes na fração de RNA total mas ausentes ou significativamente reduzida na fração de RNA ligada (por exemplo, bandas 1, 2, 3 e 5). Em quinto lugar, para o par de lane α-thio U, enquanto a maioria das bandas são comparáveis entre as pistas totais e limite, algumas bandas são relativamente menos intensas na fração de limite (por exemplo, faixas 7 e 8).
Estas observações fornecem evidências para o desenvolvimento bem sucedido deste novo método e chumbo às seguintes conclusões: em primeiro lugar, para ambos lanes de par A α-thio e α-thio U par lanes, porque a maioria do RNA é uncleaved, fornece evidências que somente uma pequena fração da o RNA contém modificado ou phosphorothioate resíduos. Isto é importante porque ele verifica que as moléculas de RNA contenham não mais do que um resíduo phosphorothioate. Intensidades de segunda, idênticas ou similares para várias bandas fora do sítio de ligação entre as duas pistas, para tanto A de α-thio e α-thio U, demonstram que o carregamento é comparável para as duas pistas, permitindo fácil comparação entre pistas. Terceiros, mais espaçadas bandas são alcançadas, para α-thio A e α-thio U, pela-forma de gel (mais fino na parte superior e mais espesso na parte inferior), assim permitindo a análise de mais longa sequência de leituras e oferecendo maior resolução. Normalmente, fragmentos mais curtos são mais amplamente espaçados em um gel com espessura uniforme. Em quarto lugar, desaparecimento ou intensidade reduzida de certas bandas na fração ligada indica que o nucleotídeo não-selvagem-tipo é preferencialmente excluído a fração ligada (A α-thio). Intensidades relativas das bandas diferentes dentro da pista ligada também oferecem informações quantitativas sobre a extensão da interferência de resíduos não-tipo selvagem em locais diferentes. Em outras palavras, o mutante ou não-selvagem tipo nucleotídeos em posições específicas interferirem com a ligação às proteínas. Finalmente, testar o efeito de substituição de enxofre de espinha dorsal (phosphorothioate) em um dos oxigénios não-ponte (α-thio U), mostra que três posições mostram efeitos menores de quanto de espinha dorsal (e.g., 6, 7 e abaixo de 7). Nossos resultados combinados mostraram que várias posições dentro do local de ligação mostram desaparecimento preferencial ou reduziram intensidades das bandas específicas na fração de limite. Isto é devido à substituição de base, ao invés de espinha dorsal, indicando interações da proteína com bases específicas no site da Associação (A α-thio). Entretanto, a incorporação de α-thio C mostra um padrão de interferência comparável ao α-thio A. Apenas 3-4 α-thio substituições G mostram pequenas porém, interferências detectáveis, centralizada em torno de, por exemplo, posições numeradas de 2 e 3 (dados não mostrados). Este método tem sido usado para revelar diferenças em como o repressor emenda SXL e o general splicing factor snRNP U2 fator auxiliar (U2AF65) vincular a uma sequência de sinal da emenda pre-mRNA idêntico (spliciossoma-tracto) de forma distinta15 .
Figura 1: fluxograma da chave entra phosphorothioate mutagênese (PTM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquema de um enlace phosphorothioate entre dois nucleotídeos, que pode ser quimicamente clivada por iodo. Enxofre substitui um dos oxigénios fosfato não-ponte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: princípio de particionamento devido à interferência. Hipotético RNA contém representante α-thio nucleotídeos em seis posições, incluindo um sítio de ligação a proteínas. Na sequência de ligação às proteínas, RNA é clivado em sites de incorporação phosphorothioate por iodo. Posições 1 – 7 dentro e ao redor do local de ligação são numeradas arbitrariamente para referência no texto. Posição 2 ou falta banda representa não phosphorothioate incorporação ou nucleotídeo não-dopado. T Lane é o RNA total e lane B é proteínas RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Phosphorothioate mutagênese (PTM) abordagem permite o mutagenesis de saturação de um spliciossoma-trato/3 ' splice site presente no transformador pre-mRNA. T Lane é o RNA total e lane B é proteínas RNA. Α-thio um RNA representa sintetizado na presença de α-thio ATP e identifica posições dopadas com adenosines α-thio na sequência. Três bandas fortes correspondem a adenosines na sequência dessas posições. Α-thio U representa o RNA sintetizado na presença de α-thio UTP e identifica todos os uridines, incluindo posições dopadas, na sequência. Linha vertical à esquerda marca o local obrigatório SXL. 1 – 8 de posições dentro do local de ligação estão contadas para fins de referência e para facilitar a descrição na seção resultados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Mutagênese tem sido muito utilizado para caracterizar os locais obrigatórios de proteína. Em primeiro lugar, uma série de mutantes pode ser construída e testada individualmente em ensaios para analisar seus efeitos sobre a vinculação afinidade de ligação. Enquanto uma abordagem padrão mutagênese oferece uma forma de analisar várias sequências, várias etapas envolvidas na abordagem padrão, tais como construção de mutantes e realizando uma série de reações para cada mutante de binding, é trabalhoso e demorado e não podem permita a mutagênese de saturação, especialmente para as sequências mais tempo. Em segundo lugar, uma sequência pode ser randomizada e piscina usado para múltiplos ciclos de vinculação e polymerase reação em cadeia de amplificação (PCR). Essas sequências que ligam a proteína terá de ser clonado e sequenciado para identificar e validar um sítio de ligação da sequência de consenso. No entanto, esta opção iterativa de vinculação e amplificação envolve várias etapas e é trabalhosa na identificação de resíduos que são importantes dentro do sítio de ligação. Além disso, sequência repetidas amplificações inerente ao PCR podem introduzir viés de sequência. Em terceiro lugar, sequências, selecionadas a partir da piscina aleatória podem ser sequenciadas usando uma opção mais rápida de sequenciamento de alto rendimento, apesar de ser relativamente caro. Portanto, para superar essas limitações de várias etapas, métodos trabalhosos e/ou caros, criámos um mais rápido, barato e o mais importante um método passo a passo, descrito aqui, para realizar o mutagenesis de saturação de um sítio de ligação (PTM).
As principais etapas desta abordagem incluem identificação ou marcação de anti-sentido o não-selvagem-tipo. Nós usamos phosphorothioate nucleotídeos, em que um dos oxigénios em fosfato a espinha dorsal é substituído com enxofre, como descrito (Figura 2). A vantagem é que o iodo pode ser usado para decompor quimicamente a espinha dorsal do nucleotide phosphorothioate. Assim, clivagem de iodo do substrato RNA contendo um backbone phosphorothioate gera uma escada de sequenciamento-tipo, onde o local de clivagem é um proxy ou marca a presença de uma das quatro bases naquela posição. Uma comparação das frações não acopladas e totais identifica resíduos que excluem-se preferencialmente a fração ligada e, portanto, são importantes para a ligação às proteínas. Em contraste, resíduos que não são importantes para ligação permanecem igualmente distribuídos entre as duas frações. Esta abordagem pode ser usada para definir locais obrigatórios para qualquer RNA-proteína.
Em resumo, esta abordagem mutagênese saturação de uma etapa, combinando a dopagem, fosforotioatos e clivagem de iodo, oferece um meio poderoso para a caracterização de qualquer sítio de ligação no ARN. No entanto, essa abordagem requer que o sítio de ligação já é conhecido antes da mutagénese. Além disso, as condições de ligação às proteínas – precisam otimizado para cada proteína. As precauções a seguir precisam ser enfatizado. Precauções para manuseio do RNA devem ser exercidas, tais como luvas, preparação de soluções e buffers na água tratada DEPC, pontas de pipetas de autoclavagem e tubos e dedicando o equipamento para o RNA usam apenas para evitar RNAses. Da mesma forma, cuidados envolvendo escudos radioactivos, radioativos monitoração enquanto usar material radioativo é essencial e uso de capuz de escape durante o uso de produtos químicos perigosos são necessárias.
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Disclosures
O autor declara não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
O autor obrigado a National Institutes of Health, o financiamento do passado e Michael R. Green para a síntese de oligonucleotídeos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
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