Summary
חלבונים שקושרים רצפי RNA ספציפיים ממלאים תפקידים חיוניים בביטוי הגנים. אפיון מפורט של אתרים אלה מחייב חיוני להבנת הכונה. . הנה, מתואר בגישה צעד אחר צעד עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA. גישה זו היא רלוונטית עבור כל האתרים מחייב חלבון ה-RNA.
Abstract
הכונה ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות. רבים DNA ו RNA-מחייב חלבונים לאגד והרצפים שלהם מטרה עם ירידה לפרטים גבוה כדי לשלוט ביטוי גנים. אלה חלבוני בקרת ביטוי גנים ברמה של DNA (תמלול) או ברמה של RNA (pre-mRNA שחבור פוליאדנילציה, תחבורה mRNA, ריקבון, תרגום). זיהוי של רצפי הרגולציה מסייעת להבין לא רק איך הגן הוא החליף או ביטול, אלא גם אילו גנים במורד הזרם מוסדרים על ידי חלבון רגולטורי מסוים. כאן, אנו מתארים גישה חד-שלבית המאפשר רווית מוטגנזה מכוונת של אתר איגוד חלבון ב- RNA. זה כרוך סימום תבנית ה-DNA עם הלא-פראי-סוג נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב, סינתזה של RNAs נפרד עם כל נוקלאוטיד phosphorothioate, ובידוד של השבר מאוגד בעקבות הדגירה עם חלבונים. ההפרעות נוקלאוטידים שאינם-פראי-סוג התוצאה שלהם תצדיק השבר חלבון מכורך מועדף. זה נמצא בפיקוח בג'ל בעקבות סלקטיבי כימי המחשוף בעזרת יוד של איגרות חוב phosphodiester המכילים phosphorothioates (phosphorothioate מוטגנזה מכוונת או PTM). גישה מוטגנזה מכוונת זו צעד אחר צעד רוויה ישימה על האפיון בכל אתר איגוד חלבון ב- RNA.
Introduction
הכונה ממלא תפקיד חשוב בביולוגיה. יכול להיות מוסדר גנים ברמה של שעתוק החדרת ה-pre-mRNA, היווצרות קצה 3', RNA ייצוא, תרגום, לוקליזציה mRNA, ריקבון, שינוי post-translational/יציבות, וכו שני חלבונים DNA ו RNA-מחייב ממלאים תפקידי מפתח בגן תקנה. בזמן ניתוח גנטי מולקולרי זיהו חלבוני רבים, רק תת קבוצה קטנה של אותם כבר שאפיינו מלא תאיים או איגוד אתרים בתוך vivo. ניתוח פילוגנטי רצף מוטגנזה מכוונת מציעים גישות משלימות לאפיין DNA או RNA-חלבונים.
RNA-מחייב חלבונים חשובים בתהליכים התפתחותיים, כולל בידול המיניות. החלבון דרוזופילה סקס קטלני (SXL) או החלבון סקס מאסטר-switch נעדר זכרים, אבל המתנה אצל נקבות. הוא מזהה רצפי uridine-עשיר או פירימידין-ספינלי סמוכים לאתרי splice ספציפי במטרות במורד הזרם pre-mRNA (שנאי, סקס קטלני, ו lethal2 זכר ספציפי) תאים סומטיים1,2 3, ,4. בנוסף, זה מסדיר האתר פוליאדנילציה מיתוג באמצעות קשירה uridine-עשיר פוליאדנילציה רצפים משפר ב-5,התעתיק6 משפר של בסיסי (e(r)). SXL סביר מווסת את מטרות נוספות ב germline הנשי שנותרו להיות מזוהה1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
בדרך כלל, אפיון אתר איגוד כרוך מוטגנזה מכוונת, לדוגמה, על-ידי מחיקה או החלפה של יחיד או נוקלאוטידים מרובים. כל אתר איגוד מוטציה, יחסית רצף ה-RNA פראי-סוג, ואז ניתוח באמצעות סדרה של ריכוז חלבון כדי לקבוע זיקה מחייבת שלה (דיסוציאציהKd או שיווי משקל קבוע) עבור החלבון עניין; Kd הוא ריכוז חלבון הנדרשים על מנת לקבל 50% RNA מחייב. תהליך זה מהגידולים של נתונים היסטוריים מוטגנזה מכוונת כרוך דור וניתוח של מוטציות רבות – שלושה נוקלאוטידים מסוג שאינו בר לכל תפקיד באתר האיגוד. לפיכך, יש צורך בגישה אלטרנטיבית עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהירה, פשוטה וזולה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA.
כאן, אנו מתארים גישה חד-שלבית המאפשר רווית מוטגנזה מכוונת של אתר איגוד חלבון ב- RNA. זה כרוך סימום תבנית ה-DNA עם הלא-פראי-סוג נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב, סינתזה של RNAs נפרד עם כל נוקלאוטיד phosphorothioate, ובידוד של השבר מאוגד בעקבות הדגירה עם חלבונים. ההפרעות נוקלאוטידים שאינם-פראי-סוג התוצאה שלהם תצדיק השבר חלבון מכורך מועדף. זה נמצא בפיקוח בג'ל בעקבות סלקטיבי כימי המחשוף בעזרת יוד של איגרות חוב phosphodiester המכילים phosphorothioates (phosphorothioate מוטגנזה מכוונת או PTM). גישה מוטגנזה מכוונת זו צעד אחר צעד רוויה ישימה על האפיון בכל אתר איגוד חלבון ב- RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: איור 1 מספק מבט כולל על phosphorothioate מוטגנזה מכוונת, מסכם את השלבים החשובים בתהליך.
1. דור של ספריה של מוטציות — סימום תבנית ה-DNA עם נוקלאוטידים מסוג שאינו בר
- לסנתז T7 פריימר (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') על ידי סינתזה על סינתיסייזר הדנ א.
- לסנתז oligonucleotide מסומם (גדיל משלים) על ידי סינתזה על סינתיסייזר DNA המתאים לאתר איגוד חלבון. השתמש תערובת המתאים של phosphoramidites במהלך סינתזה עבור כל אתר של סמים (X להלן) עם יחס של 90% א כמו נוקלאוטיד פראי-סוג ו-10% T כמו נוקלאוטיד מסוג שאינו בר (ראה תוצאות נציג לקבלת פרטים נוספים על יחס זה).
הערה: כאן, רצף oligonucleotide מסומם הוא 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3'. הרצף בקו תחתון הוא המשלים הפוכה של אתר קישור החלבון SXL, בתוספת נוקלאוטידים נוספים באתר איגוד מספקות פקדים שימושיים המאשר כי לא כל שינוי RNA משפיעה על איגוד, כמו גם בקרת טעינה השוואה ונורמליזציה של נוקלאוטידים בתוך האתר מחייב. הרצף באתר מחייב SXL UUUUUGUUGUUUUUUUU, אשר נוכח שנאי pre-mRNA14,15,16,17, שימש כדי לתכנן את המתודולוגיה המוצעת. הרצף בכתב נטוי משלים הרצף פריימר T7 והוא יזם T7 עבור שעתוק במבחנה .
2. סינתזה של RNA
-
לסנתז RNA בתגובה שעתוק 20 µL, כפי שתואר לעיל18.
- מיקס T7 שעתוק מאגר ו 1 מיקרומטר T7 oligonucleotide, 1 מיקרומטר מסטול oligonucleotide, dithiothreitol 10 מ מ (DTT), 2 מ מ GTP, 1 מ מ ATP, CTP, זוג שזור (guanosine, אדנוזין, cytidine ו- uridine טריפוספט) ואת 2 U/µL T7 RNA פולימראז.
- להוסיף, שני צינורות microcentrifuge נפרדים, 0.167 מ מ α-thio ATP או מ מ 0.05 α-thio שזור לשלב phosphorothioates (ראה שרטוט באיור2) RNAs.
הערה: עבור פרוטוקולים חלופיים, להוסיף 0.2 מ מ α-thio CTP או 0.2 מ מ α-thio GTP לתגובה המתאימה שעתוק המכיל oligonucleotide מסומם כדי לבדוק את השניים הנותרים נוקלאוטיד החלפות. - דגירה את תערובת התגובה של סינתזה RNA עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף הדגימה RNA 2.5 µL פוספטאז אלקליין חום-יציב ומאגר 2.5 µL 10xphosphatase. דגירה כזאתי µL 25 למשך 10-30 דקות ב 37 ° C כדי להסיר 5' פוספטים.
- בטל את האנזים אלקליין פוספטאז על ידי חימום ב 80 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
- Radiolabel 5' סוף dephosphorylated RNA (5 pmole) באמצעות 1 µL T4 polynucleotide קינאז ו- 1 µL וγ -32P ATP באמצעי אחסון התגובה 10 µL. דגירה המיקס התגובה למשך 30-60 דקות ב 37 º C.
- הפוך ללא פעיל האנזים קינאז polynucleotide T4 על ידי חימום-65 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
- ג'ל לטהר את הרנ א על ידי אלקטרופורזה ב- 10% denaturing ג'ל לזיהוי. אתר ה-RNA על הג'ל על-ידי autoradiography. לסלק את הפרוסה ג'ל המכיל radiolabeled RNA, למחוץ צינור microcentrifuge על ידי לחיצה הקירות עם טיפ פיפטה, ומשרים במאגר K (PK) proteinase (100 מ מ טריס, pH 7.5, 12.5 מ מ EDTA, 150 מ מ NaCl, 1% נתרן גופרתי dodecyl). לסובב את הצינור בטמפרטורת החדר מ 2 h ללון.
- Centrifuge של slurry ג'ל, למחוק את הג'ל ולאסוף את בופר.
- לחלץ את הפתרון פעמיים נפח שווה של פנול-כלורופורם, פעם עם הכלורופורם ולאסוף את פאזה מימית.
- להוסיף פאזה מימית 0.1 האחסון של 3m סודיום אצטט, pH 5.2, מנשא tRNA או גליקוגן, 2.5 בנפח אתנול. שמור את הדגימה ב-80 מעלות צלזיוס לשעה.
- Centrifuge לדוגמה עבור 5 – 10 דקות microcentrifuge במהירות גבוהה ב 16,873 x g. הסר את הפתרון מאגר/אתנול בזהירות מבלי להפריע בגדר RNA.
- לשטוף את גלולה עם 70% אתנול, צנטריפוגה עבור 2 – 5 דקות הסר אתנול בקפידה. יבש בגדר באוויר.
- Resuspend בגדר ב 20 – 50 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים מטופלים. לאחסן ב-20 ° C עד השימוש.
הערה: בצע את כל השלבים עם radiolabeled RNA באמצעות אמצעי הזהירות המתאימים פלקסיגלס מגן כדי להגן מפני רדיואקטיביות. עד מהרה, ספין עמודות הן יותר נפוץ ונוח יותר להסיר את הרדיואקטיביות לא מעובדות, כחלופה ג'ל לטיהור של RNA.
3. חלבון מחייב תגובה והפרדה של RNA מאוגד
- לבטא את חלבון רקומביננטי ולטהר מ- e. coli.
- מעריכים ריכוז חלבון רקומביננטי באמצעות ספקטרופוטומטר או על-ידי הפרדת ב ג'ל מרחביות-לזיהוי לצד חלבון ידוע סטנדרטיים, שור אלבומין (BSA). דמיינו החלבון של עניין של BSA סטנדרטי על ידי מכתימה את הג'ל עם R-250 Coomassie כחול מבריק. Quantitate החלבון לעומת כמויות ידוע של BSA דילולים על הג'ל אותו.
הערה: אחסן חלבון רקומביננטי ב- 80 ° C עד השימוש ורכים ב- 20 מ מ 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 8.0, dithiothreitol 1 מ מ (DTT), 0.2 מ מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 0.05% NP-40, 20% גליצרול. שימוש של 0.5-1.0 מ"מ פרוטאז מעכב phenylmethane sulfonyl פלואוריד (PMSF) היא אופציונלית. - לבצע RNA מחייב תגובה (20 – 100 µL) 10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 1 מ"מ DTT, 50 מ"מ אשלגן כלורי, 0.5 יחידות/µL RNase מעכב, 0.09 µg/µL acetylated שור אלבומין, 1 מ"מ EDTA, 0.15 µg/µL סינתזת RNA 5'-סוף radiolabeled, 6 µL של הריכוז המתאים (א ריכוז בו ~ 50% של RNA נקשר חלבון) של החלבון.
הערה: מאגר איגוד זה עובד עבור שלושה RNA – מחייב חלבונים (SXL, U2AF65, ו- PTB), אבל חייב להיות מוגדר על חלבון עניין. לאמוד ריכוז חלבון מדעית, באמצעות דילולים שונים עבור הכנה חלבון מסוים, נדרש להשיג כ 50% איגוד ה-RNA. תנאי או Kd מייצג את החלק הרגיש ביותר של העקומה RNA מחייב. - דגירה התגובה מחייב חלבון למשך 20-30 דקות ב- 25 ° C (או על קרח).
-
להפריד את השבר RNA חלבון מכורך השבר לא מאוגד באמצעות אחד שתי גישות:
- ניטרוצלולוזה לסנן איגוד
- החל את תגובת האיגוד (20 – 100 µL) על מסנן ניטרוצלולוזה מחובר של יריעה ואקום בטמפרטורת החדר.
הערה: רק המתחם RNA-חלבון נשמר מסנן והוא לא מאוגדים RNA זורם דרך המסנן. הגישה מחייב מסנן מאפשר התאוששות גבוהה יותר של הרנ א מאוגד, הוא מהיר יותר, פשוט יותר, בהשוואה ל וזמינותו shift הניידות ג'ל. על ידי הצבת DEAE קרום מתחת המסנן ניטרוצלולוזה זה גם ניתן לאסוף את השבר RNA לא מאוגד או חינם RNA להשוואה עם השבר מאוגד. - לחתוך את החלק של המסנן ניטרוצלולוזה המכיל את יתרת RNA רדיואקטיבי לחתיכות קטנות יותר כדי להתאים לתוך צינור microcentrifuge, להשרות מאגר PK מספיקות (300 – 500 µL המכיל 10 – 20 µg PK) לטבול את החלקים מסנן ולאחר elute RNA מהמסנן עבור 2-3 שעות או לילה.
- לחלץ עם פנול-כלורופורם, כלורופורם, ולאסוף פאזה מימית. הוספת סודיום אצטט ואתנול, לאחר דגירה במקפיא, צנטריפוגה, לשטוף, לייבש, resuspend RNA במים שטופלו DEPC. בצע את השלבים כמפורט בשלבים 2.10-2.14 לעיל.
- החל את תגובת האיגוד (20 – 100 µL) על מסנן ניטרוצלולוזה מחובר של יריעה ואקום בטמפרטורת החדר.
- Shift הניידות ג'ל
- להכין, פולימריזציה לזיהוי יליד 5% ג'ל (60:1 Acrylamide:bis-אקרילאמיד) ב- 0.5 x TBE (מאגר טריס-בוראט-EDTA סטנדרטי) לפני שמתחילים את תגובת האיגוד, כחלופה לשיטה איגוד מסנן.
- מראש להפעיל את ג'ל למשך 15 דקות ב 250 V בחדר קר (4 ° C).
- לטעון כל תגובת האיגוד (לעיל) לתוך בארות נפרדים של הג'ל מבחו לעיל.
הערה: מאגר אחסון חלבון מספק מספיק גליצרול לטעינה מדגם לתוך בארות. - להפריד את ה-RNA חלבון מאוגד על-ידי אלקטרופורזה בג'ל בחדר קר ב 250 V h 1-2, תלוי בגודל RNA חלבון ספציפי.
- אתר את המיקום של המתחם RNA-חלבון על הג'ל על-ידי autoradiography. לסלק את הפרוסה ג'ל המכיל המתחם RNA-חלבון. Elute את הרנ א מן הפרוסה ג'ל על ידי ריסוק הפרוסה ג'ל לספוג את המאגר PK.
- לחלץ עם פנול-כלורופורם, כלורופורם, ולאסוף פאזה מימית. הוספת סודיום אצטט ואתנול, לאחר דגירה במקפיא, צנטריפוגה, אוויר יבש, וקונטה resuspend RNA במים שטופלו DEPC. בצע את השלבים כמפורט בשלבים 2.10-2.14 לעיל.
- ניטרוצלולוזה לסנן איגוד
4. ניתוח של מוצרים Phosphorothioate ביקע יוד לצורך זיהוי של נוקלאוטיד מוטציה עמדות
- להוסיף יוד 1 מ ב µL 20 שטופלו DEPC מים המכילים עד 10 המוביל µg tRNA כדי לדבוק RNAs (סה כ וקשורות RNAs) באתרים התאגדות phosphorothioate. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
הערה: עוד פרטים על יוד מחשוף עם תנאים קצת שונה — iodoethanol 7% (v/v), חימום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות — ניתן למצוא גיש & אקשטיין 198819. - התמיסה ביקע RNA על-ידי הוספת סודיום אצטט/אתנול, כמתואר לעיל. Resuspend ב צבע טעינה עבור denaturing ג'ל. החום ו'טען הדגימה כדי להפריד בין ה-RNA קטעים על ידי אלקטרופורזה ב- 15-20% ג'ל לזיהוי denaturing.
- לחשוף את הג'ל לזיהוי על סרט צילום רנטגן.
- לזהות להקות השבר מאוגד מול הבריכה הכולל שימוש autoradiography.
הערה: בצע את כל השלבים עם יוד בשכונה הפליטה. להפרדה RNA המוצגת כאן, ג'ל-בצורת טריז הוא מועסק, אשר מושגת על ידי הכפלת העובי של קפיציות שני בחלק התחתון של הלוחות ג'ל על-ידי הוספת מרווח במיוחד-inch-ארוכת של בחלק התחתון של הג'ל. צורה זו מאפשרת יותר מרווח אחיד או קרוב יותר בין קטעים RNA קצרים יותר. לחלופין, ניתן להשתמש phosphorimager ולא x-ray סרטים זיהוי, כימות לרדיואקטיביות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עקרון רוויה מוטגנזה מכוונת באמצעות סמים בספורט:
עבור יחס טוחנת המתאים של פראי-סוג של נוקלאוטידים אחרים, השתמש תערובת שווה של כל ארבעה נוקלאוטידים אם רק תנוחה אחת כדי להיות מנותח. עם זאת, אם תפקידים מרובים מנותחים בו זמנית, היחס של הלא-בר לסוג פראי-סוג נוקלאוטידים שתישמר, קרי, מופחתת. אחרת, בנוסף החלפות יחיד, אשר היא הרצויה, יהיו גם תבניות עם מספר נוקלאוטידים מסוג שאינו בר בתוך המולקולה, מסלק ניתוח ההשפעה של נוקלאוטיד יחיד החלפות. לפיכך, כלל אצבע, השתמש יחס של הלא-בר לסוג נוקלאוטידים פראי-סוג של 1/n, כאשר n הוא מספר המיקומים כדי להיות מנותח. כאן, ניתחנו את 10 משרות בו זמנית ומשמש תערובת המכילה 90% של נוקלאוטיד פראי-סוג ועוד 10 אחוז נוקלאוטיד מסוג שאינו בר עבור סימום את תבנית ה-DNA. שעתוק שונים התגובות נעשים, שבו כל התגובה שעתוק מתבצע באחת phosphorothioates 4. לפיכך, כל התגובה מפקחת נוקלאוטיד ספציפי על העמדות מסומם.
עקרון החלוקה למחיצות עקב הפרעות:
בגישה מוטגנזה מכוונת המובאת כאן, יש RNAs ממוצע אחד פחות שאריות phosphorothioate לכל מולקולה. במהלך תהליך מחייב, מחיצה מולקולות RNA בין השבר חלבון מכורך השבר לא מאוגד. מאחר נוקלאוטיד מסוים מקושר חיבור אמיתי phosphorothioate, המחשוף של הצמדה המרכזי (backbone) phosphorothioate הוא readout נוכחות של נוקלאוטיד מסוים במיקום זה. הוא צפוי כי במיקום נתון כלשהו, כאשר נוקלאוטיד משתנה זה ייתכן גם אין כל השפעה על איגוד או זה עלול לעכב את הכריכה, באופן חלקי או מלא. אם הנוכחות של נוקלאוטיד ספציפי אינה משפיעה על איגוד זה למחיצות באותה מידה בין שברים חלבון מכורך והלא מאוגדים. עם זאת, כאשר נוקלאוטיד מסוים במיקום נתון מפריע חלבון מחייב זה מעדיפים ייכללו השבר מאוגד-חלבון. מידת ההתערבות ניתן לנטר באופן כמותי לכל אחד עמדות אותה התגובה בעקבות בג'ל. תפיסה זו מומחש ב סכימטי (איור 3). ב- RNA הכולל שבר (ליין T), הלהקה בעוצמה שווה למשרות מסומם כל (להקות 1, 3-7). חלבון מכורך RNA שבר (ליין B), ומעמדות 1, 4 ו- 7, כולל נוקלאוטיד אין השפעה על הכריכה. אולם, על עמדות 3 ו- 6, זה מפריע מחייב, ובכך הוא נשלל מן השבר מאוגד. מיקום 5, התערבות היא חלקית. לפיכך, השוואות של ארבעה נתיבים לזווג, T ו- B עבור כל נוקלאוטיד, לאפשר ניתוח של כל ארבעה נוקלאוטידים. זה צריך להיות ציין כי נוקלאוטיד פראי-סוג עבור משרה הנתון משקף את האפקט, אם בכלל, של גופרית עמוד השדרה ה-RNA על חלבון מחייב.
Autoradiograph הנלווים (איור 4) מציג שני זוגות (α-thio A וα-thio U) נתיבים של ג'ל denaturing (T עבור מאגר הכולל) ו- B עבור שבר מאוגד. מספר תצפיות יכולה להיעשות על-ידי השוואת עוצמות רצועות לכל תפקיד בין כל זוג של מסלולים (T ו- B). ראשית, הרוב המכריע של האות הוא בחלק העליון של הג'ל, קרי, uncleaved המוצר, עבור שניהם-α-thio מסלול U ליין וα-thio. שנית, עבור α-thio A זוג מסלולים, מספר להקות (יוד המחשוף המוצרים) אינם זהים בין הגבול לבין סך השברים RNA לדוגמה, להקות מעל 1; להקות הרלוונטיים בתוך האתר מחייב עבור α-thio מסלול ממוספרים לעיון. שלישית, להקות בחלק התחתון של הג'ל הם יותר מקרוב במרווחים קבועים (למשל, להקות מתחת 6) מאשר מקובל עבור ג'ל רצף. רביעית, מספר להקות הן נוכח השבר RNA סה כ אבל נעדר או מופחתת באופן משמעותי בתוך השבר RNA מאוגדת (למשל, להקות 1, 2, 3 ו-5). חמישית, עבור α-thio U זוג ליין, בעוד רוב הלהקות דומות בין הנתיבים הכולל, מאוגד, יש להקות הם יחסית פחות אינטנסיבי של השבר מאוגדת (למשל, להקות 7 ו-8).
תצפיות אלה מספקים ראיות להתפתחותן של השיטה החדשה הזאת להוביל המסקנות הבאות: ראשית, עבור α-thio A זוג מסלולים וα-thio U זוג מסלולים, כי רוב RNA uncleaved, הוא מספק ראיות כי רק רסיס זעיר מכיל הרנ א שונה או שאריות phosphorothioate. זה חשוב כי זה ascertains כי מולקולות RNA מכילים שאריות phosphorothioate לא יותר מפעם אחת. עוצמות השני, זהים או דומים עבור מספר להקות מחוץ לאתר האיגוד בין שני הנתיבים, עבור α-thio A וα-thio U, מדגימים הטעינה זה ניתן להשוות שני נתיבים, המאפשר השוואה קלה בין נתיבים. להקות השלישי, יותר צפופים מושגות, עבור α-thio A וα-thio U, על ידי הצורה היתד של הג'ל (דק יותר בחלק העליון, עבה בתחתית), ובכך מאפשר ניתוח הקריאות רצף ארוך יותר, המציע רזולוציה גבוהה יותר. בדרך כלל, קטעים קצרים ירווחו באופן נרחב יותר של ג'ל עם עובי אחיד. רביעית, העלמות או בעוצמה מופחתת להקות מסוימים בהשבר מאוגד מציין מעדיפים שאינם נכללים של נוקלאוטיד הלא-פראי-סוג של השבר מאוגדת (α-thio א). עוצמות היחסי של להקות שונות בתוך הנתיב מאוגד מציעים גם מידע כמותי אודות היקף הפרעות מסוג שאינו בר שאריות במקומות שונים. במילים אחרות, מוטציה או נוקלאוטידים מסוג שאינו בר-עמדות מסוימות להפריע חלבון מחייב. לבסוף, בודק את ההשפעה של החלפת עמוד השדרה גופרית (phosphorothioate) באחת oxygens ללא גישור (α-thio U), מראה כי שלושה תפקידים להראות קטין תופעות של עמוד השדרה sulfurs (למשל, 6, 7 וזה שמתחת 7). התוצאות המשולבות שלנו להראות כי מספר תנוחות בתוך האתר מחייב הצגה היעלמות מועדף או מופחתת עוצמות של להקות ספציפיים בתוך השבר מאוגד. זאת בשל החלפת בסיס במקום מרכזי (backbone), המציין אינטראקציות חלבון עם בסיסים ספציפיים באתר איגוד (α-thio א). בינתיים, התאגדות של α-thio C מציג תבנית של התאבכות להשוות α-thio א עם זאת, רק 3-4 α-thio G החלפות להראות קטן אבל לזיהוי הפרעות כיעד, למשל, עמדות ממוספר 2 ו- 3 (נתונים לא מוצג). בשיטה זו נעשה שימוש כדי לחשוף את ההבדלים איך מדכא את. שבולם SXL splicing, את כללי splicing גורם U2 snRNP עזר פקטור (U2AF65) לאגד זהים pre-mRNA splicing אות רצף (polypyrimidine-בדרכי) באופן מובהק15 .
איור 1: תרשים זרימה של מפתח נכנס phosphorothioate מוטגנזה מכוונת (PTM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סכימטי של חיבור אמיתי בין שני נוקלאוטידים, אשר יכול להיות ביקע כימית על-ידי יוד phosphorothioate. הגופרית מחליף אחד oxygens פוספט-גישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: עקרון החלוקה למחיצות עקב הפרעה. RNA היפותטי מכיל נוקלאוטידים נציג α-thio-6 עמדות, כולל אתר מחייב חלבון. בעקבות חלבון מחייב, RNA הוא ביקע באתרים התאגדות phosphorothioate על-ידי יוד. עמדות 1-7 בתוך וליד אתר איגוד ממוספרות באופן שרירותי לעיון בטקסט. מיקום 2 או פס מייצג אין התאגדות phosphorothioate או נוקלאוטיד שאינם מסטול. ליין T RNA הכולל והוא ליין B RNA חלבון מאוגד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: Phosphorothioate מוטגנזה מכוונת (PTM) גישה מאפשרת מוטגנזה מכוונת הרוויה של polypyrimidine-דלקת בדרכי/3 ' אחוי האתר הנוכחי ב- pre-mRNA שנאי . ליין T RNA הכולל והוא ליין B RNA חלבון מאוגד. Α-thio RNA מייצג מסונתז בנוכחות ATP α-thio ומזהה מסומם הצהרותיך α-thio adenosines ברצף. שלוש להקות חזקה מקבילים adenosines ברצף על העמדות האלה. Α-thio U מייצגת RNA מסונתז בנוכחות UTP α-thio ומזהה כל uridines, כולל עמדות מסומם, ברצף. הקו האנכי בצד השמאל מסמן אתר איגוד SXL. עמדות 1 – 8 בתוך האתר מחייב ממוספרים למטרות הפניה, על מנת להקל על תיאור במקטע תוצאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מוטגנזה מכוונת זמן שימש לאפיין אתרי קישור חלבון. ראשית, סדרה של מוטציות יכול להיות נבנה ונבדק באופן אינדיבידואלי מחייבים מבחני לניתוח והשפעותיהם על איגוד הזיקה. בעוד בגישה מוטגנזה מכוונת סטנדרטי מציע דרך לנתח מספר רצפים, מרובי שלבים מעורב הגישה סטנדרטיים, כגון בניית מוטציות וביצוע סדרה של איגוד תגובות עבור כל מוטציה, זה מפרך וצורכת זמן, אולי לא לאפשר מוטגנזה מכוונת רוויה, במיוחד עבור רצפים ארוכים יותר. שנית, יכול להיות אקראיים רצף, הבריכה המשמש מספר מחזורים של תגובת שרשרת מחייבים, פולימראז (PCR) הגברה. רצפי אלה לאגד חלבון יהיה חייב להיות משובטים, וסודרו כדי לזהות ולאמת את אתר איגוד מהרצף קונצנזוס. בכל זאת, איטרטיבי מחייבים, הגברה אפשרות זו כוללת מספר השלבים והיא מייגעת בזיהוי שאריות חשובים בתוך האתר מחייב. יתר על כן, רצף חוזרות amplifications הטמון PCR ייתכן להטיה רצף. שלישית, רצפים נבחר ממאגר אקראי יכול להיות רציף באמצעות אופציה מהירה יותר של תפוקה גבוהה רצף, למרות שזה יקרה יחסית. לכן, כדי להתגבר על מגבלות אלה של מספר מדרגות, שיטות מפרך ו/או יקרים, אנחנו בדימיון מהירה, זולה, ובשיטת והכי חשוב צעד אחר צעד, המתוארים כאן, כדי להשיג את הרוויה מוטגנזה מכוונת של אתר האיגוד (PTM).
השלבים המפתח בגישה זו כוללות זיהוי או תיוג של nucleotide(s) הלא-פראי-סוג. השתמשנו נוקלאוטידים phosphorothioate, במי מכם oxygens ב פוספט עמוד השדרה מוחלף עם גופרית, כפי שמתואר (איור 2). היתרון הוא כי יוד יכול לשמש כדי כימית קליב את עמוד השדרה של נוקלאוטיד phosphorothioate. לפיכך, יוד המחשוף של המצע RNA המכיל שדרה phosphorothioate יוצר סולם רצף-סוג, איפה האתר של פצילות proxy או תג לנוכחות של. אחד בסיסי במיקום זה. השוואה בין שברים לא מאוגד, הכולל זיהוי משקעים אינם נכללים מעדיפים השבר מאוגד, ובכך חשובים עבור חלבון מחייב. לעומת זאת, שאריות לא חשובים עבור איגוד נשארים מופץ באופן שווה בין שני שברים. גישה זו יכולה לשמש להגדרת אתרי קישור עבור כל ה-RNA מחייב חלבון.
לסיכום, בשלב אחד רוויה מוטגנזה מכוונת גישה זו, שילוב של סמים בספורט, phosphorothioates, יוד מחשוף, ומציע אמצעי רב עוצמה האפיון של כל אתר האיגוד ב- RNA. עם זאת, גישה זו דורשת כי אתר איגוד ידועה כבר לפני מוטגנזה מכוונת. יתר על כן, חלבון – מחייב תנאים צריך אופטימיזציה עבור כל חלבון. אמצעי הזהירות הבאים צריך להדגיש. אמצעי זהירות לטיפול RNA החייבים אימון, כגון לבש כפפות, הכנת מאגרי מים שטופלו DEPC, autoclaving פיפטה טיפים וצינורות, והפתרונות ולהקדיש ציוד עבור ה-RNA להשתמש רק כדי להימנע RNAses. באופן דומה, טיפול מעורבים מגינים רדיואקטיבי, רדיואקטיבי ניטור בזמן באמצעות חומר רדיואקטיבי הוא חיוני, ושימוש הפליטה הוד תוך שימוש כימיקלים מסוכנים נחוצים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר מצהיר אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחבר תודה מכוני הבריאות הלאומיים לצורך מימון בעבר, תודה מיכאל ר גרין סינתזה oligonucleotides.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
