Summary
Proteiner som binder bestemt RNA sekvenser spille viktige roller i genuttrykk. Detaljert karakterisering av disse bindende områder er avgjørende for vår forståelse av genet regulering. Her beskrives et enkeltsteg tilnærming for metning mutagenese av protein-bindende RNA. Denne tilnærmingen er relevant for alle protein-bindende områder i RNA.
Abstract
Genreguleringen spiller en viktig rolle i utviklingen. Mange DNA og RNA-bindende proteiner binde sekvensene målet med høy spesifisitet kontrollere genuttrykk. Disse regulatoriske proteiner styre genuttrykk enten på nivået av DNA (transkripsjon) eller på nivået av RNA (pre-mRNA skjøting, polyadenylation, mRNA transport, forfall og oversettelse). Identifikasjon av regulatoriske sekvenser bidrar til å forstå ikke bare hvordan et gen er slått på eller av, men også hvilke nedstrøms gener er regulert av en bestemt regulatoriske protein. Her beskriver vi en ett-trinns tilnærming som gjør at metning mutagenese av et protein bindende område i RNA. Det innebærer doping DNA mal med ikke-vill-type nukleotider på binding området, syntese av separate RNAs med hver phosphorothioate nucleotide og isolasjon av den bundne fraksjon etter inkubasjon med protein. Forstyrrelser fra ikke-vill-type nukleotider resulterer i deres fortrinnsrett utelukkelse fra protein-bundet brøken. Dette er kontrollert av gel geleelektroforese etter selektiv kjemiske spalting med jod phosphodiester obligasjoner som inneholder phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkeltsteg metning mutagenese gjelder karakterisering av alle protein bindende områder i RNA.
Introduction
Genreguleringen spiller en viktig rolle i biologi. Gener kan reguleres på nivå med transkripsjon, pre-mRNA skjøting, 3 slutt dannelsen, RNA eksport, oversettelse, mRNA lokalisering, forfall, post-translasjonell modifikasjon/stabilitet, etc. begge DNA og RNA-bindende proteiner spiller nøkkelroller i genet regulering. Mens molekylær genetisk analyser har identifisert mange regulatoriske proteiner, bare en liten del av dem har vært preget fullt cellulære funksjoner eller bindende områder i vivo. Fylogenetiske sekvens analyse og mutagenese tilbyr supplerende tiltak for å karakterisere DNA eller RNA-protein interaksjoner.
RNA-bindende proteiner er viktige utviklingsprosesser, inkludert seksuell differensiering. Drosophila protein Sex-dødelige (SXL) eller sex-hovedbryter protein er fraværende i menn, men stede i kvinner. Den gjenkjenner uridine-rik sekvenser eller pyrimidine-traktater tilstøtende til bestemte skjøte områder i nedstrøms pre-mRNA mål (transformator, Sex-dødeligeog hann-spesifikk lethal2) i somatiske celler1,2 ,3,4. I tillegg regulerer den polyadenylation nettstedet bytte ved binding til uridine-rik polyadenylation enhancer sekvenser i enhancer av rudimentære (e(r)) transkripsjon5,6. SXL sannsynlig regulerer flere mål i den kvinnelige germline som gjenstår for å bli identifisert1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Vanligvis innebærer karakterisering av en bindende nettsted mutagenese, for eksempel ved sletting eller substitusjon av én eller flere nukleotider. Hvert område som mutant bindende, i forhold til vill-type RNA sekvensen, analyseres deretter bruke en serie med protein konsentrasjoner for å bestemme dens forpliktende tilhørighet (Kd eller likevekt dissosiasjon konstant) for protein steder. Kd er protein konsentrasjon nødvendig for å få 50% RNA bindende. Denne arbeidskrevende prosessen med detaljert mutagenese omfatter generasjon og analyse av mange mutanter-tre ikke-wild type nukleotider for hver posisjon i området bindende. Dermed er det behov for en alternativ tilnærming for raskere, enklere og rimelig metning mutagenese av protein bindende RNA.
Her beskriver vi en ett-trinns tilnærming som gjør at metning mutagenese av et protein bindende område i RNA. Det innebærer doping DNA mal med ikke-vill-type nukleotider på binding området, syntese av separate RNAs med hver phosphorothioate nucleotide og isolasjon av den bundne fraksjon etter inkubasjon med protein. Forstyrrelser fra ikke-vill-type nukleotider resulterer i deres fortrinnsrett utelukkelse fra protein-bundet brøken. Dette er kontrollert av gel geleelektroforese etter selektiv kjemiske spalting med jod phosphodiester obligasjoner som inneholder phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkeltsteg metning mutagenese gjelder karakterisering av alle protein bindende områder i RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Figur 1 gir en oversikt over phosphorothioate mutagenese og oppsummerer viktige trinn i prosessen.
1. generasjon av et bibliotek av mutanter-Doping DNA mal med wild Type nukleotider
- Syntetisere T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3 ") av syntese i DNA synthesizer.
- Syntetisere en dopet oligonucleotide (komplementære strand) av syntese i DNA synthesizer tilsvarer protein binding området. Bruke en passende blanding av phosphoramidites under syntese for hvert område av doping (X nedenfor) med forholdet 90% A som vill-type nukleotid og 10% T som vill type nukleotid (se representant resultater for flere detaljer om dette forholdet).
Merk: Her sekvensen av dopet oligonucleotide er 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 ". Understreket sekvensen er det omvendte supplement SXL protein binding området pluss ekstra nukleotider bindende område som gir nyttig kontroller bekrefter at ikke hver endring i RNA påvirker bindende, samt å være lasting kontroller for sammenligning og normalisering av nukleotider i binding området. SXL-binding området rekkefølgen UUUUUGUUGUUUUUUUU, som er tilstede i transformator pre-mRNA14,15,16,17, ble brukt til å utvikle foreslåtte metodikken. Sekvensen i kursiv er utfyllende til T7 primer sekvensen og T7 arrangøren for i vitro transkripsjon.
2. syntese av RNA
-
Syntetisere RNA i en 20 µL transkripsjon reaksjon, som beskrevet tidligere18.
- Blanding T7 transkripsjon buffer og 1 µM T7 oligonucleotide, 1 µM dopet oligonucleotide, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP, og UTP (guanosine, adenosin, cytidine og uridine-trifosfat) og 2 U/µL T7 RNA polymerase.
- Legge til, i to separate microcentrifuge rør, 0.167 mM α-deg selv thio ATP eller 0.05 mM α-deg selv thio UTP å innlemme phosphorothioates (se skjema i figur 2) i RNAs.
Merk: For alternative protokoller, legge 0.2 mM α-deg selv thio CTP eller 0.2 mM α-deg selv thio GTP til en passende transkripsjon reaksjon som inneholder en dopet oligonucleotide for å teste de to gjenværende nukleotid erstatninger. - Inkuber RNA syntese reaksjonsblandingen 2 h på 37 ° C.
- Legge til 2,5 µL varme-labil alkalisk fosfatase og 2,5 µL 10xphosphatase buffer RNA prøven. Inkuber denne 25 µL reaksjonen i 10-30 min på 37 ° C fjerne 5' fosfater.
- Deaktiver alkalisk fosfatase enzymet ved 80 ° C i 2-5 minutter.
- Radiolabel 5' slutten av dephosphorylated (5 pmole) 1 µL T4 polynucleotide kinase og 1 µL γ -32P ATP i et 10 µL reaksjon volum. Inkuber reaksjonen blanding i 30-60 minutter på 37 ° C.
- Deaktiver T4 polynucleotide kinase enzymet ved 65 ° C i 20-30 min.
- Gel rense RNA ved geleelektroforese i 10% denaturing polyakrylamid gel. Finn RNA på gel av autoradiography. Avgiftsdirektoratet gel sektoren som inneholder radiolabeled RNA knuse i et microcentrifuge rør ved å trykke mot veggene med Pipetter tips og suge i proteinasen K (PK) buffer (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium dodecyl sulfate). Rotere røret ved romtemperatur fra 2t overnight.
- Sentrifuge gel gjødsel, forkaste gel og samle buffer løsning.
- Ekstra løsningen to ganger med lik antall fenol-kloroform og med kloroform og samle den vandige fasen.
- Legge til vandige fasen 0,1 volumet av 3M natrium Acetate, pH 5.2, bærer tRNA eller glykogen og 2,5 volum av etanol. Holde prøven ved-80 ° C i 1 time.
- Sentrifuge utvalget for 5-10 minutter i en høyhastighets microcentrifuge 16,873 x g. Fjerne buffer/etanol løsningen forsiktig uten å forstyrre RNA-pellets.
- Vask pellets med 70% etanol og sentrifuge for 2-5 min. Fjern etanol nøye. Tørr pellet i luften.
- Resuspend pellet i 20-50 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann. Lagre på 20 ° C før bruk.
Merk: Utføre alle skritt med radiolabeled RNA ved forsiktighetsregler og en plexiglass skjerme for å beskytte mot radioaktivitet. For tiden er spinn kolonner mer vanlig og enklere å fjerne kommunefritt radioaktivitet, som et alternativ til gel rensing av RNA.
3. protein bindende reaksjon og separasjon av bundet
- Express rekombinant proteinet i og rense fra E. coli.
- Anslå rekombinante proteiner konsentrasjon av spectrophotometry eller ved å skille i et SDS-polyakrylamid gel ved siden av en kjent protein standard, storfe serum albumin (BSA). Visualisere protein av interesse og BSA standard ved farging gel med Coomassie briljant blå R-250. Quantitate proteinet i forhold til kjente størrelser innenfor BSA fortynninger på samme gel.
Merk: Oppbevar rekombinante proteiner til - 80 ° C før bruk og fortynnet i 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic syre (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 0,05% NP-40, 20% glyserol. Bruk av 0,5-1.0 mM protease hemmer phenylmethane sulfonyl fluor (PMSF) er valgfrie. - Utføre RNA-bindende reaksjon (20-100 µL) i 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0,5 enheter/µL RNase inhibitor, 0.09 µg/µL acetylated bovin serum albumin, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-end radiolabeled RNA og 6 µL av aktuelle konsentrasjon (a konsentrasjon som binder ~ 50% av protein) av protein.
Merk: Denne bindingen buffer fungerer for tre RNA-binding proteiner (SXL, U2AF65, og PTB), men må standardiseres for et protein av interesse. Beregne protein konsentrasjon empirisk, bruker ulike fortynninger for en gitt protein forberedelse, som kreves for å få ca 50% RNA bindende. Denne betingelsen eller Kd representerer den mest følsomme delen av RNA-bindende kurven. - Inkuber protein bindende reaksjonen i 20-30 min ved 25 ° C (eller is).
-
Skille protein-bundet RNA brøken fra ubundet brøkdel bruker en av disse metodene:
- Nitrocellulose filtrere bindende
- Bruk bindingen reaksjonen (20-100 µL) på en nitrocellulose filteret koblet til en vakuum manifold ved romtemperatur.
Merk: Bare RNA-protein komplekset beholdes på filter og ubundet RNA flyter gjennom filteret. Filteret bindende tilnærmingen gjør høyere gjenvinning av de bundne RNA og er raskere og enklere, sammenlignet med gel mobilitet Skift analysen. Ved å plassere en DEAE membran under nitrocellulose filteret er det også mulig å samle ubundet RNA brøken eller gratis RNA for sammenligning med bundet brøken. - Delen av nitrocellulose filter som inneholder de beholdt radioaktivt RNA i mindre biter passer inn i et microcentrifuge rør, suge i tilstrekkelig PK buffer (300-500 µL inneholder 10-20 µg PK) å fordype filter bitene og elute RNA fra filteret for 2-3 h eller over natten.
- Ekstra med fenol-kloroform, kloroform, og samle vandige fasen. Legge til natrium acetate og etanol og, etter inkubasjon i fryseren sentrifuge, vask, tørr og resuspend RNA i DEPC-behandlet vann. Følg fremgangsmåten som beskrevet i fremgangsmåten 2.10 til 2,14 ovenfor.
- Bruk bindingen reaksjonen (20-100 µL) på en nitrocellulose filteret koblet til en vakuum manifold ved romtemperatur.
- Gel mobilitet SKIFT
- Forberede og danner en 5% innfødt polyakrylamid gel (60:1 Acrylamide:bis-akrylamid) i 0,5 x TBE (standard Tris Borate EDTA buffer) før du starter bindende reaksjon, som et alternativ til filteret binding metoden.
- Pre kjøre gel i 15 min på 250 V i et kaldt rom (4 ° C).
- Legg hver binding reaksjon (over) i separate brønner i over pre kjøre gel.
Merk: Protein lagring bufferen gir tilstrekkelig glyserol for eksempel lasting i brønner. - Skill protein-bundet RNA med gel geleelektroforese i et kaldt rom på 250 V for 1-2 h, avhengig av RNA størrelse og bestemt protein.
- Finne plasseringen av RNA-protein kompleks på gel ved autoradiography. Avgiftsdirektoratet gel sektoren som inneholder RNA-protein komplekset. Elute RNA fra gel stykket ved knusing gel sektoren og soaking i PK bufferen.
- Ekstra med fenol-kloroform, kloroform, og samle vandige fasen. legge til natrium acetate og etanol og etter inkubasjon i fryseren sentrifuge, vaske, luften tørr, og resuspend RNA i DEPC-behandlet vann. Følg fremgangsmåten som beskrevet i fremgangsmåten 2.10 til 2,14 ovenfor.
- Nitrocellulose filtrere bindende
4. analyse av jod-kløyvde Phosphorothioate produkter for påvisning av Mutant Nucleotide posisjoner
- Legge 1 mM jod i en 20 µL DEPC-behandlet vann som inneholder opptil 10 µg bærer tRNA deler RNAs (bundet og total RNAs) ved phosphorothioate innlemmelse. Inkuber ved romtemperatur for 5 min.
Merk: Mer informasjon om jod spalting med litt forskjellige betingelser-7% (v/v) iodoethanol, oppvarming til 95 ° C i 3 minutter, finnes i Gish & Eckstein 198819. - Utløse kløyvde RNA ved å legge til natrium acetate/etanol, som beskrevet ovenfor. Resuspend i en lasting fargestoff for denaturing gels. Varme og laste prøve å skille RNA fragmenter av geleelektroforese i en 15-20% denaturing polyakrylamid gel.
- Utsett polyakrylamid gel en X-ray film.
- Oppdage band i bundne fraksjonen versus totale adresseutvalg med autoradiography.
Merk: Utføre alle skritt med jod i en eksos hette. For RNA separasjon vist her, er en kile-formet gel ansatt, som oppnås ved å doble tykkelsen på begge avstandsstykkene nederst gel plater ved å sette inn en ekstra tomme lang avstand på bunnen av gel. Denne figuren kan mer ensartet eller nærmere avstand mellom kortere RNA fragmenter. Alternativt kan en phosphorimager brukes X-ray filmer for deteksjon og kvantifisering av radioaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prinsippet om metning mutagenese bruker doping:
Bruke en lik blanding av alle fire nukleotider en passende molar ratio av vill-type og andre nukleotider, hvis bare en stilling som skal analyseres. Men hvis flere stillinger blir analysert samtidig, forholdet av ikke-wild type å vill-type nukleotider må justeres, dvs. redusert. Ellers i tillegg enkelt erstatninger, er ønsket, vil det også være maler med flere ikke-wild type nukleotider i et molekyl, slik at analyse av effekten av enkelt-nukleotid erstatninger. Dermed som en tommelfingerregel, bruke forholdet av ikke-wild type å vill-type nukleotider i 1/n, der n er antall stillinger som skal analyseres. Her vi analyserte 10 stillinger samtidig og brukte en blanding som inneholder 90% av vill-type nukleotid og 10% av det vill type nukleotid dopingprøve malen DNA. Separat transkripsjon reaksjoner er gjort, der hver transkripsjon reaksjon er utført med en av de fire phosphorothioates. Dermed overvåker hver reaksjon en bestemt nukleotid dopet posisjoner.
Prinsippet om deling på grunn av forstyrrelser:
I mutagenese tilnærming presenteres her, har RNAs gjennomsnittlig mindre enn en phosphorothioate rester per molekylet. Under prosessen med bindende, RNA molekyler deling mellom brøken protein-bundet og ubundet brøken. Siden en bestemt nukleotid er knyttet til en phosphorothioate kobling, er spalting av phosphorothioate ryggraden sammenhengen en presentasjon av tilstedeværelsen av en bestemt nucleotide i den posisjonen. Det er forventet at på en gitt plassering, når en nukleotid endres det har enten ingen virkning bindingen eller det kan hemme bindende, helt eller delvis. Hvis tilstedeværelse av en bestemt nukleotid ikke påvirker bindingen vil det deling like mellom protein-bundet og ubundet fraksjoner. Men hvis en bestemt nucleotide i en gitt posisjon gjør protein bindingen utelukkes det fortrinnsvis fra protein-bundet brøkdel. Graden av forstyrrelser kan overvåkes kvantitativt for hver av stillingene i samme reaksjon etter gel geleelektroforese. Dette konseptet er illustrert i en skjematisk (Figur 3). I totalt RNA brøk (lane T) er bandet intensitet omtrent lik for alle dopet stillinger (band 1, 3 – 7). I protein-bundet RNA brøk (lane B), posisjoner 1, 4 og 7 har nukleotid ingen innvirkning på bindingen. Men posisjoner 3 og 6, det forstyrrer bindende og dermed utelates fra bundet brøkdel. Posisjon 5 er forstyrrelser delvis. Dermed tillater sammenligninger av fire sammenkoblede kjørefelt, T- og B for hver nucleotide, analyse av alle fire nukleotider. Det burde være bemerket det vill-type nukleotid for en gitt posisjon gjenspeiler effekten, om noen, av svovel i RNA ryggraden protein bindingen.
Den tilhørende autoradiograph (Figur 4) viser to par (α-deg selv thio A og α-deg selv thio U) baner fra en denaturing gel (T for Total bassenget) og B for bundet brøkdel. Flere observasjoner kan gjøres ved å sammenligne intensiteter band på hver posisjon mellom hvert par av baner (T- og B). Først er fleste signalet på toppen av gel, dvs uncleaved produkt, for både α-deg selv thio en lane og α-deg selv thio U kjørefelt. Andre, for deg selv α-thio A par baner, flere band (jod cleavage produkter) er identiske mellom bundet og totale RNA fraksjoner for eksempel band over 1; relevante band på binding området for den α-deg selv thio en nummereres for referanse. Tredje band på bunnen av gel er flere tett linjeavstand (f.eks band under 6) enn vanlig for en sekvensering gel. Fjerde, flere band er tilstede i totale RNA fraksjonen men fraværende eller betydelig redusert i bundne RNA fraksjonen (f.eks band 1, 2, 3 og 5). Femte er α-deg selv thio U lane paret, mens de fleste band er sammenlignbare mellom de totale og bundet banene, noen band relativt mindre intens i bundne fraksjonen (f.eks band 7 og 8).
Disse observasjonene gir bevis for vellykket utvikling av denne nye metoden og føre til følgende konklusjoner: først for både α-deg selv thio A par baner og α-deg selv thio U par baner, fordi de fleste av de er uncleaved, det gir bevis på at bare en liten brøkdel av RNA inneholder endret eller phosphorothioate rester. Dette er viktig fordi det konstaterer at RNA molekyler inneholder mer enn én phosphorothioate rester. Andre, identiske eller lignende intensiteter for flere band utenfor webområdet bindingen mellom de to banene, for både α-deg selv thio A og α-deg selv thio U, viser at lasting er sammenlignbare for begge kjørefelt, slik at enkel sammenligning mellom baner. Tredje, mer tett linjeavstand band er oppnådd, for deg selv α-thio A og α-deg selv thio-U, av kile-figuren av gel (tynnere øverst og tykkere nederst), således tillater analyse av lengre sekvens og tilbyr høyere oppløsning. Vanligvis er kortere fragmenter mer mellomrom i en gel med jevn tykkelse. Fjerde angir forsvinningen eller redusert intensiteten av visse band i bundne fraksjonen at ikke-vill-type nukleotid fortrinnsvis er utelukket fra bundet brøkdel (α-deg selv thio A). Relativ intensiteter av forskjellige band i bundne kjørefelt tilbyr også kvantitativ informasjon om omfanget av forstyrrelser fra vill type rester på forskjellige steder. Med andre ord, påvirke mutant eller vill type nukleotider i bestemte posisjoner protein bindende. Til slutt, teste effekten av ryggraden svovel substitusjonsbehandling (phosphorothioate) på en av de ikke-bro oxygens (α-deg selv thio U), viser at tre posisjoner vise mindre effekter fra ryggraden sulfurs (f.eks 6, 7 og ene under 7). Våre samlede resultater viser at flere stillinger innenfor binding området vise fortrinnsrett forsvinningen eller redusert intensiteter bestemt band i bundne fraksjonen. Dette er base i stedet for ryggraden substitusjon, indikerer protein interaksjoner med bestemte baser i binding området (α-deg selv thio A). I mellomtiden, inkorporering av α-deg selv thio C viser en Forstyrrelsen mønsteret sammenlignes med α-deg selv thio A. Men bare 3-4 α-deg selv thio G erstatninger Vis liten men oppdages interferens sentrert rundt, for eksempel plasserer nummererte 2 og 3 (data ikke vist). Denne metoden er brukt til å avdekke forskjeller i hvordan det skjøting repressor SXL og den generelle skjøting faktor U2 snRNP ekstra faktor (U2AF65) binde en identisk pre-mRNA skjøting signal sekvensen (polypyrimidine-skrift) på forskjellige måte15 .
Figur 1: flytdiagram for nøkkelen trinn i phosphorothioate mutagenese (PTM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk av en phosphorothioate sammenheng mellom to nukleotider, som kan være kjemisk kløyvde av jod. Svovel erstatter en av ikke-bro fosfat oxygens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: prinsippet om partisjonering på grunn av forstyrrelser. Hypotetisk RNA inneholder representant α-deg selv thio nukleotider på seks stillinger, blant annet et protein-bindende område. Etter protein bindende, RNA er kløyvde på steder av phosphorothioate innlemmelse av jod. Posisjoner 1 – 7 i og rundt området bindende nummereres vilkårlig referanse i teksten. Posisjon 2 eller manglende band representerer ingen phosphorothioate innlemmelse eller ikke-dopet nukleotid. Lane T er totalt RNA lane B er protein-bundet RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Phosphorothioate mutagenese (PTM) tilnærming gjør metning mutagenese en polypyrimidine-skrift/3 "spleise området i transformator pre-mRNA. Lane T er totalt RNA lane B er protein-bundet RNA. Α-deg selv thio en representerer RNA syntetisert i nærvær av α-deg selv thio ATP og identifiserer dopet posisjoner med α-deg selv thio adenosines i sekvensen. Tre sterke bånd tilsvarer adenosines i rekkefølgen de posisjoner. Α-deg selv thio U representerer RNA syntetisert i nærvær av α-deg selv thio UTP og identifiserer alle uridines, inkludert dopet posisjoner, i rekkefølge. Loddrett linje til venstre markerer SXL binding området. Posisjoner 1 – 8 i binding området er nummerert for referanseformål og enkel beskrivelse i resultatinndelingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagenese har lenge vært brukt til å simulere protein bindende områder. Først kan en rekke mutanter, konstruert og testet individuelt i bindingen analyser analysere deres effekter på bindende affinitet. Mens en standard mutagenese tilnærming tilbyr en måte å analysere flere sekvenser, flere skritt involvert i standard tilnærming, som konstruere mutanter og utføre en rekke bindende reaksjoner for hver mutant, er arbeidskrevende og tidkrevende og ikke tillate metning mutagenese, spesielt for lengre sekvenser. Andre, en sekvens kan være randomisert og bassenget brukes for flere sykluser av bindende og polymerase kjedereaksjon (PCR) forsterkning. Disse sekvensene som binder protein må bli klonet og rekkefølge for å identifisere og godkjenne en binding området fra konsensus sekvensen. Likevel, dette iterativ og forsterkning og alternativet innebærer flere trinn og er arbeidskrevende identifisere rester som er viktig innenfor området bindende. Videre kan gjentatt rekkefølge amplifications ligger PCR presentere sekvens bias. Tredje kan sekvenser valgt tilfeldig bassenget være sekvensielt ved hjelp av et raskere alternativ av høy gjennomstrømning sekvensering, selv om det er relativt dyre. Derfor, for å overvinne disse begrensningene av flere trinn, arbeidskrevende og/eller billigste metoder, vi utviklet en raskere, billig, og aller viktigst et enkeltsteg metoden beskrevet her, for å oppnå metning mutagenese av en bindende nettsted (PTM).
De viktigste trinnene i denne tilnærmingen omfatter identifikasjon eller merking av ikke-vill-type nucleotide(s). Vi brukte phosphorothioate nukleotider, hvor en av oxygens i fosfat ryggraden erstattes med svovel, som beskrevet (figur 2). Fordelen er at jod kan brukes kjemisk deler ryggraden i phosphorothioate nukleotid. Dermed genererer jod spalting av RNA underlaget inneholder en phosphorothioate ryggrad en sekvensering-type stige, der webområdet cleavage er en proxy eller koden for tilstedeværelsen av en av fire baser i den posisjonen. En sammenligning av ubundne og totale fraksjoner identifiserer rester som er fortrinnsvis ekskludert fra bundet brøkdel og dermed er viktig for protein bindende. Derimot forbli rester som ikke er viktig for innbindingen like distribuert mellom to fraksjoner. Denne fremgangsmåten kan brukes til å definere bindende for noen RNA-bindende protein.
I sammendraget tilbyr dette ettrinns metning mutagenese tilnærming, kombinere doping, phosphorothioates og jod cleavage, en kraftig metode for karakterisering av noen binding området i RNA. Dette krever imidlertid at bindingen området er allerede kjent før mutagenese. Videre må protein-bindende betingelser optimalisert for hver protein. Følgende forholdsregler må vektlegges. Forholdsregler for RNA håndtering må utøves, som bærer hansker, utarbeidelse av løsninger og buffere i DEPC-behandlet vann, autoklavering pipette-spisser og rør, og dedikere utstyr for RNA bruk bare for å unngå RNAses. Tilsvarende er omsorg med radioaktive skjold, radioaktivt overvåking mens bruke radioaktivt materiale er viktig, og bruk av eksos hette mens du bruker helsefarlige kjemikalier nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tilbyderen erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatteren Takk National Institutes of Health for siste finansiering og takk Michael R. Green for å syntetisere oligonucleotides.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
