Determinação da membrana plasmática de particionamento para proteínas associadas perifericamente

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar uma análise quantitativa do nível de associação a membrana plasmática para fluorescente etiquetado proteína associada perifericamente. O método baseia-se na decomposição computacional da membrana e componente citoplasmático do sinal observado em células rotuladas com marcador fluorescente de membrana plasmática.

Abstract

Este método fornece uma abordagem rápida para a determinação da membrana plasmática de particionamento de qualquer marcados fluorescentemente perifericamente-proteína associada usando os perfis da intensidade de fluorescência através da membrana plasmática. Perfis de fluorescência medidos estão equipados por um modelo para distribuição de fluorescência de membrana e citoplasma ao longo de uma linha aplicada perpendicularmente para a periferia da célula. Este modelo é construído a partir dos valores de intensidade de fluorescência em referência a células expressando um marcador fluorescente-etiquetadas para o citoplasma e com FM 4-64-rotulado membrana plasmática. O método pode ser aplicado a vários tipos de células e organismos; no entanto, apenas plasma as membranas das células vizinhas não pode ser avaliadas. Este método rápido baseado em microscopia é apropriado para experiências, onde esperam-se mudanças sutis e dinâmicas de marcadores associados a membrana plasmática e necessidade de ser quantificado, por exemplo, na análise das versões mutantes de proteínas, tratamentos de inibidor, e observações de transdução de sinal. O método é implementado em um pacote de R multi-plataforma que é acoplado com uma macro ImageJ que serve como uma interface amigável.

Introduction

Perifericamente associados-a membrana plasmática proteínas são os principais componentes das vias de sinalização celular. Um de seus papéis fundamentais é sua associação transitória de membrana plasmática e dissociação, que é importante para a transdução de sinal entre a membrana plasmática e citoplasma. Proteínas de membrana de plasma perifericamente associados podem ser anexadas na membrana plasmática por âncoras lipídicas (N-miristoilação, S-acilação ou Prenilação) ou domínios de ligação de lipídios (interagindo com fosfatidilinositol fosfatos, ácido fosfatídico, etc.).

Vinculação de membrana plasmática Propriedades destas proteínas podem ser examinados na vivo, por exemplo, quando uma proteína fluorescente-tag é modificada por um mutagenesis local-dirigido de chave de aminoácidos, ou quando é tratada com vários inibidores que afectam sinalização de lipídios. As distribuições das proteínas de membrana de plasma periférico são principalmente sendo avaliadas qualitativamente, especialmente em casos, quando re-distribuição de proteína é óbvio. O método apresentado é ideal para situações quando re-distribuição de proteína é apenas parcial e avaliação quantitativa é necessária. Uma abordagem frequentemente usada de quando associação de membrana plasmática é estimada a partir confocal laser imagens de microscopia de varredura como uma relação entre as intensidades de fluorescência na membrana plasmática e no citoplasma^1,2, é simples, mas não Exato. As intensidades de fluorescência na membrana plasmática refletem uma superposição do sinal-a membrana plasmática e citoplasma devido a característica de difração de luz para a técnica de microscopia de fluorescência particular e elementos ópticos utilizados³. Por conseguinte, o sinal citoplasmático é incluído também na região da membrana. Por esse motivo, coloração padrão FM 4-64 não pode ser usado como uma máscara para um sinal de membrana seleção⁴. Além disso, medidas simples de membrana sinal na posição definida pelo FM 4-64 coloração máxima sempre sistematicamente superestimam o sinal real-a membrana plasmática da proteína perifericamente associados-a membrana plasmática, devido à sobreposição do membrana e citoplasma composto. O máximo de sinais observados para proteínas de fluorescente-etiquetadas perifericamente associados também não localizar co com o máximo do marcador de membrana plasmática (ou seja, tintura de styryl FM 4-64), mas é deslocado para o citoplasma. Outra limitação é baseada no fato de que a FM 4-64 pico de emissão é maior em comparação com os picos de emissão para proteínas fluorescentes verdes tais como GFP devido a dependência-comprimento de onda de difração de luz³.

O método descrito aqui, o sinal de etiquetado proteína é equipado por duas funções empíricas descrevendo uma distribuição hipotética da membrana plasmática e citoplasma sinal, respectivamente. Esta decomposição do sinal é aplicada a perfis de fluorescência lineares que são aplicados à superfície da célula perpendicularmente à membrana plasmática em imagens de origem, que são seções confocal regulares, dois canais de expressar a proteína fluorescente-tag células rotuladas com tintura de FM 4-64.

A primeira função usada para encaixe descreve uma difração de um sinal de citoplasma na borda de célula. É obtido a partir de perfis de fluorescência anteriormente adquiridos que foram medidos em células expressando um marcador de proteína do citoplasma marcado pelo cromóforo do mesmo como a membrana plasmática perifericamente associada a proteína de interesse. A segunda função descrevendo uma difração de um sinal de membrana plasmática é derivada de fluorescência do FM 4-64. Em primeiro lugar, este sinal é aproximado por uma função gaussiana que está sendo usada para uma modelagem aproximada de difração de luz de uma fonte pontual. Em segundo lugar, este modelo, válido para o vermelho de emissão FM 4-64, matematicamente é transformado para a forma que é relevante para um comprimento de onda de emissão do cromóforo do utilizado para a marcação de proteínas associadas perifericamente de interesse na membrana plasmática. Ambas as funções são normalizadas pela intensidade máxima e a média de 10% dos valores mais altos para sinal FM 4-64 e proteínas citoplasmáticas, respectivamente. Por esta decomposição do sinal (método não-linear de encaixe quadrado menos), a relação entre a membrana plasmática e a fração de citoplasma da proteína analisada podem ser estimados facilmente e com precisão. A dimensão física real de coeficiente de particionamento computada é na faixa de micrômetro, porque a concentração do volume citoplasmático é comparada com a concentração de superfície na membrana plasmática. Define a distância entre a membrana plasmática para o citoplasma, dentro do qual a mesma quantidade de proteínas está localizada em área adjacente da membrana plasmática. Esse valor é equivalente para o particionamento coeficiente K₂ introduzido previamente⁵. O método é muito rápido, exigindo apenas única seções confocal adquiridas usando rotineiro laser confocal microscópio, e não é exigente computacionalmente. O núcleo de análise foi implementado em um pacote de R portátil e uma macro ImageJ adicional foi escrita para fornecer a interface gráfica do usuário para executar a análise de diálogos de intuitivo. Software e uma descrição mais detalhada do método (publicado anteriormente⁶) pode ser encontrada em http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

O método é adequado para células isoladas, protoplastas e tecidos, onde a membrana plasmática das células individuais é claramente distinguível, expressar uma construção fluorescente-etiquetadas do examinado perifericamente associados a proteína. Um cromóforo compatível com FM 4-64 a coloração deve ser usada. FM 4-64 emite fluorescência vermelha; Portanto, examinada proteína pode ser marcada por uma proteína de fluorescência com emissão de azul, verde ou amarelo (por exemplo, GFP, PCP, YFP). Transformação estável de material biológico é recomendada porque permite observações menos artificiais e mais reprodutíveis de distribuição de proteína. É necessário que a proteína examinada tem uma distribuição relativamente homogênea citoplasmática. A localização de uma proteína no retículo endoplasmático ou outro compartimento intracelular de membrana pode produzir resultados artificiais.

Além disso, o mesmo material biológico expressando um marcador citoplasmático deve ser usado para a comparação. Células podem ser transformadas por um chomophore gratuito (o mesmo que usado para proteína periférica de marcação, por exemplo, enciclopédia GFP) ou etiquetada proteína de interesse com capacidade de ligação de membrana abolido. Capacidade de ligação de membrana pode ser abolida, por exemplo, por aparamento do domínio de ligação de membrana ou mutagenesis local-dirigido de resíduos de aminoácido chave (por exemplo, sites para N-miristoilação, S-acilação, ou Prenilação, etc.).

Para microscopia confocal, as células devem ser etiquetadas por um marcador de membrana como corante FM 4-64. Se FM 4-64 coloração não é adequado para o material estudado (devido a interferente autofluorescência, penetração do corante pobre, etc.), a membrana plasmática pode ser rotulada, por exemplo, pela proteína integral de membrana de plasma marcada para um chomophore apropriado ( mCherry, RFP, etc.). É essencial que o marcador tem localização insignificante nos compartimentos intracelular de membrana (endomembranes).

Se trabalhar com amostras fixas e anticorpos, fixável analógica FM 4-64FX ou membrana plasmática rotulagem pelo anticorpo contra um destino apropriado pode ser usado. Neste caso, é essencial para avaliar resultados com muito cuidado porque os procedimentos de fixação podem levar à perda seletiva de proteínas do citoplasma e a membrana plasmática.

Protocol

1. preparação de Material biológico Prepare material biológico, expressando a proteína fluorescente etiquetada de interesse, bem como um marcador citoplasmático. Siga os procedimentos mencionados na introdução. 2. confocal Laser, microscopia eletrônica de varredura Manchar o material preparado na secção 1 com FM 4-64 tintura7. Aplica um protocolo de coloração que é apropriado para o material estudado. Para célu…

Representative Results

DREPP10 é uma proteína de planta específica perifericamente associados-membrana plasmática que está associada com a membrana plasmática através de um N-miristoilação e uma interação eletrostática com fosfatidilinositol fosfatos11, 12. DREPP foi descrito como um componente de uma máquina de sinalização de cálcio na célula da planta e também interage com o citoesqueleto13<…

Discussion

O método descrito aqui gera uma estimação mais acurada de membrana plasmática de particionamento para proteínas perifericamente associadas em comparação com outras abordagens baseadas em medir intensidades de fluorescência⁵. O grande avanço desse método é que leva em conta a difração de luz e superposição de membrana plasmática e os sinais citoplasmáticos. Embora estes resultados do método estão em correlação com os resultados de um método simples, baseado na comparação da …

Materials

FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer