Fastsettelse av Plasma membranen partisjonering for perifert knyttet proteiner

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre en kvantitativ analyse av nivået av plasma-membran foreningen for fluorescently-merket perifert knyttet protein. Metoden er basert på beregningsorientert nedbryting av membran og cytoplasmatiske komponent signal i celler merket med plasma membranen fluorescerende markør.

Abstract

Denne metoden gir en rask tilnærming for fastsettelse av plasma membranen partisjonering av noen fluorescently-merket perifert knyttet protein hjelp profilene til fluorescens intensiteten i plasma membranen. Målt fluorescens profiler er utstyrt med en modell for membran og cytoplasma fluorescens distribusjon på en linje som er vinkelrett på cellen periferien. Denne modellen er konstruert av fluorescens intensitetsverdiene i Referanse celler uttrykke merketråd fluorescently merket for cytoplasma og med FM 4-64-merket plasma membran. Metoden kan brukes til ulike celletyper og organismer; Imidlertid kan bare plasma membraner av ikke-nærliggende celler evalueres. Denne rask mikroskopi-basert metode er egnet for eksperimenter, hvor subtil og dynamiske endringer i plasma membranen-assosiert markører er forventet og nødvendig å være kvantifisert, f.eksi analysen av mutant versjoner av proteiner, hemmer behandlinger, og signalet signaltransduksjon observasjoner. Metoden som er implementert i en multi-plattform R-pakke som er kombinert med en ImageJ makro som fungerer som et brukervennlig grensesnitt.

Introduction

Perifert knyttet plasma-membran proteiner er hovedkomponentene i cellen signalnettverk trasé. En av sine grunnleggende roller er deres forbigående plasma membranen tilknytning og dissosiasjon, som er viktig for signaltransduksjon mellom plasma membranen og cytoplasma. Perifert knyttet plasma membran proteiner kan festes på plasma membran av lipid ankere (N-myristoylation, S-acylation eller prenylation) eller lipid bindende domener (samspill med phosphatidylinositol fosfater, phosphatidic acid, etc.).

Plasma-membran bindende egenskaper av disse proteinene kan være undersøkt i vivo, f.eksnår en fluorescently merket protein er endret av en område-rettet mutagenese av viktige aminosyrer, eller når det behandles med ulike hemmere påvirker lipid signalering. Distribusjonen av eksterne plasma membran proteiner er hovedsakelig blir evaluert kvalitativt, spesielt i tilfeller når protein re-distribusjon er åpenbart. Presentert metoden er optimale i situasjoner når protein re-distribusjon er bare delvis og kvantitativ vurdering er nødvendig. En brukte tilnærming når plasma membranen association er beregnet fra AC confocal laser skanning mikroskopi bilder som forholdet fluorescens intensiteter plasma-membranen og i cytoplasma^1,2, er enkelt, men ikke nøyaktig. Fluorescens intensiteter i plasma membranen gjenspeiler en superposisjon av plasma-membran og cytoplasma signalet på grunn av lys Diffraksjon karakteristisk for bestemt fluorescens mikroskopi teknikk og optiske elementer brukt³. Følgelig inngår cytoplasmatiske signalet også i regionen membran. Derfor kan ikke FM 4-64 flekker mønster brukes som en maske for en membran signal utvalg⁴. Videre enkle målinger av membran signalet på plasseringen angitt av FM 4-64 flekker maksimal alltid systematisk overvurderer virkelige plasma-membran signalet perifert knyttet plasma-membran protein på grunn av superposisjon av den membran og cytoplasmatiske sammensatte. Maksimalt antall observert signaler for fluorescently-merket perifert knyttet proteiner også co Lokaliser ikke med maksimal plasma membranen markøren (dvs., FM 4-64 styryl farge), men er forskjøvet mot cytoplasma. En annen begrensning er basert på det faktum at FM 4-64 utslipp peak er større med utslipp toppene for grønne fluorescerende proteiner som GFP på grunn av bølgelengde-avhengighet av lys Diffraksjon³.

I metoden beskrevet her er merket protein signalet utstyrt med to empirisk funksjoner som beskriver en hypotetisk fordelingen av plasma membranen og cytoplasma signal, henholdsvis. Dette signalet nedbryting brukes lineær fluorescens profiler som brukes til celleoverflaten vinkelrett til plasma membranen i kildebilder, som er vanlig, tokanals AC confocal deler av fluorescently-merket protein uttrykke celler merket med FM 4-64 fargestoff.

Den første funksjonen brukes for montering beskriver en Diffraksjon en cytoplasma signal på cellen kanten. Det er innhentet fra tidligere anskaffet fluorescens profiler som ble målt i celler som uttrykker en cytoplasma protein markør merket av den samme chromophore som plasma membranen perifert knyttet protein av interesse. Den andre funksjonen som beskriver en Diffraksjon et plasma-membran signal er avledet fra fluorescens av FM 4-64. Dette signalet anslås først med en Gaussian funksjonen som brukes for en omtrentlig modellering av lys Diffraksjon av en kilde. For det andre, denne modellen, gyldig for rød FM 4-64 utslipp, matematisk forvandles til skjemaet som er relevant for et utslipp bølgelengde på chromophore brukes for merking av perifert knyttet proteiner av interesse på plasma membranen. Begge funksjonene er normalisert ved maksimal intensiteten og gjennomsnittet på 10% av de høyeste verdiene for FM 4-64 signal og cytoplasmatiske protein signal, henholdsvis. Av dette signalet nedbryting (ikke-lineære minst kvadrat passende metode), kan forholdet mellom plasma membranen og cytoplasma brøkdel av undersøkt protein estimeres enkelt og nøyaktig. Den virkelige fysiske dimensjonen av beregnede partisjonering koeffisient er i størrelsesorden mikrometer, fordi cytoplasmatiske volum konsentrasjon sammenlignes med overflaten konsentrasjon på plasma membranen. Den definerer avstanden fra plasma membranen til cytoplasma, som samme mengde proteiner er lokalisert i det nærliggende området i plasma membranen. Denne verdien tilsvarer partisjonering koeffisienten K₂ introdusert tidligere⁵. Metoden er rask, krever bare én AC confocal deler anskaffes ved hjelp av rutinemessig AC confocal laserskanning mikroskop, og det er ikke beregningsmessig krevende. Analyse kjernen er implementert i en flyttbar R-pakke og en ekstra ImageJ makro ble skrevet å gi grafisk brukergrensesnitt for å kjøre analyser intuitivt dialoger. Programvare og mer detaljert beskrivelse av metoden (publisert tidligere⁶) kan finnes på http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Metoden er egnet for isolert celler, protoplasts og vev, der plasma membranen individuelle celler er klart kan skilles, uttrykke en fluorescently merket konstruksjon av undersøkt perifert knyttet protein. En chromophore kompatibel med FM 4-64 flekker må brukes. FM 4-64 avgir røde fluorescens; Derfor kan undersøkt protein være merket av et fluorescens protein med blå, grønn eller gul utslipp (f.eksGFP, CFP, YFP). Stabil transformasjon av biologisk materiale anbefales fordi mindre kunstige og mer reproduserbar observasjoner av protein distribusjon. Det er nødvendig at undersøkt protein har en relativt homogene cytoplasmatiske distribusjon. Lokalisering av et protein i det endoplasmatiske retikulum eller en annen intracellulær membran kupeen kan produsere kunstig resultater.

I tillegg må det samme biologisk materialet uttrykke merketråd cytoplasmatiske brukes for sammenligningen. Cellene kan bli forvandlet ved en gratis chomophore (samme som gjelder perifer protein merking, f.eksgratis GFP) eller merket protein rundt med avskaffet membran innbindingen behandlingskapasitet. Membran innbindingen behandlingskapasitet kan bli avskaffet, for eksempel beskjæring av membran-bindende domene eller området-rettet mutagenese av viktige aminosyren residua (f.eks, nettsteder for N-myristoylation, S-acylation, eller prenylation, etc.).

For AC confocal mikroskopi skanning, må cellene merkes av merketråd membran som FM 4-64 fargestoff. Hvis FM 4-64 flekker ikke er egnet for studerte materialet (på grunn av forstyrrende autofluorescence, dårlig fargestoff penetrasjon, etc.), kan plasma membranen merkes, for eksempel med integrert plasma membranen protein merket med en riktig chomophore ( mCherry, RFP, etc.). Det er viktig at markøren har ubetydelig lokalisering i intracellulær membran seksjonene (endomembranes).

Hvis arbeider med fast prøver og antistoffer, kan fixable analog FM 4-64FX eller plasma membranen merking av antistoff mot en passende mål brukes. I dette tilfellet er det viktig å vurdere resultatene nøye fordi fiksering prosedyrer kan føre til selektiv tap av proteiner fra både cytoplasma og plasma membranen.

Protocol

1. utarbeidelse av biologisk materiale

1. Forberede biologisk materiale uttrykke fluorescently merket protein av interesse, samt en cytoplasmatiske markør. Følg fremgangsmåten nevnt i innledningen.

2. AC confocal mikroskopi for laserskanning

1. Stain materialet forberedt i Seksjon 1 med FM 4-64 fargestoff⁷.
   1. Bruke en fargeprotokoll som passer for studerte materialet. For tobakk ved-2 celler, beis 200 μL av cellen suspensjon med 0,2 μL 10 mM FM 4-64 løsning i dimethylsulfoxide.
      Merk: Typisk flekker konsentrasjonen av FM 4-64 fargestoff er om 10 μM med 10 mM lagerløsning i dimethylsulfoxide. Bruke lavest mulig konsentrasjonen av FM 4-64 for riktig flekker og ikke ruge celler på is (FM 4-64 og lav temperatur kan påvirke plasma membranen egenskaper). Fortsett med observasjon bruke AC confocal mikroskopi umiddelbart. Intervallet mellom den flekker og bilde oppkjøpet kan ikke være lengre enn 10 min; ellers vil endocytose av fargestoffet påvirke FM 4-64 flekker.
   2. Behandle flere prøver fortløpende, og ikke flekker alle prøvene i begynnelsen av eksperimentet.
2. Fange en equatorial AC confocal del per én celle.
   1. Angi en sekvensiell tokanals skanning for chromophore brukes som protein tag (må være i den første kanalen) og FM 4-64 (må være i den andre kanalen). Angi en høyere optisk oppløsning (10-20 px/μm). Et eksempel oppsett: 63 X olje nedsenking mål, NA 1.3, bildestørrelse 1024 x 1024 px. Kontroller at plasma membranen flyet er vinkelrett på AC confocal-inndelingsplanet i ervervet bilder.
   2. Fange minst 20 celler per prøve å ha nok data for flygninger evalueringen (avhengig av signal variasjon i behandlet materialet).

3. nødvendig programvareinstallasjon

1. Installere Fiji ImageJ distribusjon⁸og makroen nødvendig tilbehør.
   1. Dataoverføre programvare fra nettstedet https://fiji.sc/#download og installere dem ved utpakking.
   2. Starte Fiji ved å dobbeltklikke på filen "ImageJ(.exe)" i den pakket ut "Fiji.app"-mappen.
   3. Last ned en makro "perifere" fra følgende webområde:
      http://kfrserver.natur.Cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.ijm.
   4. Fiji, velg Plugins | Makroer | Installere... i hovedmenyen og angi banen til den nedlastede filen "Peripheral_.ijm."
      Merk: To nye verktøy på installert makroen "enhet" vises på verktøylinjen Fiji: "Ta profil verktøyet" og "Perifere Protein meny."
2. Installere R-prosjektet programvare⁹og nødvendige pakker.
   1. Følg instruksjonene på området https://cloud.r-project.org/ for R-project-installasjonen.
      Merk: Den generelle analysen vil bli utført i Fiji. R programvaren vil bli kalt bare internt Fiji makroen "perifere" under beregningen.
   2. Kjøre R GUI, velg pakker | Installere pakke(r)... i hovedmenyen, og oppgi nærmeste oppbevaringssted og pakke "ggplot2" for installasjon.
      Merk: Alternativt skriver til R kommandolinje: install.packages("ggplot2").
   3. Last ned en R-pakke perifere fra målet: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Installere dem ved å velge pakker | Installere pakke(r) fra lokale filer....
      Merk: Alternativt Skriv til R for denne kommandoen bare:
      Install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, type = "kilden").

4. bildeanalyser Fiji

1. Behandle AC confocal bilder av cytoplasmatiske markøren.
   1. Importere bildene til Fiji bruker Plugins | Bio-formater | Bio-formater importør menyen Fiji med standardinnstillinger.
   2. Sjekk Hvis Bio-formater importøren gjenkjennes bilde kalibreringen. Bilde dimensjonen vises i øvre venstre feltet bilde informasjonsvinduet må være lik de opprinnelige bildet dimensjonene.
   3. Behandle feil kalibrert bilder med det feil dimensjoner, f.eksved å angi de riktige parameterne i dialogvinduet analyser | Angi skala... menyen Fiji: fylle bildebredde i piksler i feltet avstanden i piksler og virkelige bredden i passende lengde enheten i feltet kjent avstand ).
      Merk: Hvis Leica LCS LEI filene kalibreres feil, følger du trinn 4.2.1.
2. Kjør Import makroen for en analyse oppsett. Aktivere makroen av en av tre måter: Velg Plugins | Makroer | Importvalg [f1] i Fiji hovedmenyen, Velg samme element når du klikker verktøyet meny Perifere Protein-menyeneller trykker tastaturet snarvei F1. Angi parameteren i dialogvinduet aktivert makro.
   1. Hvis Leica LCS LEI format, løse feil kalibrering av Leica.lei bilder -boksen. Dette alternativet importerer riktig bildedimensjonene fra filen filtypen "lei".
   2. Angi den riktige verdien i feltet Gaussian blur radius (px). Dette påvirker bilde utjevning og støy reduksjon. En lav verdi (1 px) er tilstrekkelig og ikke forårsaker tap av bilde-informasjon.
   3. Angi en verdi i feltet profil linjebredden (px). En tykkere linje fører høyere utjevning av profil kurver. En standardverdi 10 px anbefales.
   4. Angi et bilde tittel analysering av definisjonen av "Sample skilletegn" og "Eksporterte elementer."
      Merk: En bilde tittel (filnavn uten filtype, f.eks: "Eksperiment-1_line-02_cell-11") deles rundt alle tegnene vises i feltet "Sample skilletegn" (f.eks: "-_") i et sett med elementer («Experiment","1"," linje","02","celle", og"11") som kan brukes som gruppering faktorer (eksempel, celle, linje eller behandling identitet) i følgende analyse. Define hvilke varer som skal brukes ved å skrive deres serienummer ("0" for det første elementet) i den arkiverte "Eksporterte elementer." Bruke mellomromsdelt format, f.eks"3 5." I dette eksemplet vil "02" og "11" bli referert til som gruppering faktorer kalt "Fac_0" og "Fac_1." I tillegg vil identiteten til hver måling bli referert til som "jeg" faktor.
   5. Også holde eksempel skilletegn tom og angir 0 til de eksporterte elementer hvis hele bildet tittelen kan beholdes.
   6. På Windows operativsystem, sjekk hvis banen til R programvaren vil være riktig oppdages automatisk i feltet bane til R.exe. Ellers angi den fullstendige banen til filen R.exe i systemet (f.eks"C:\Program Files\R\bin\R.exe").
   7. Klikk på OK. Merk tittelen analysering i neste dialogboks vinduet og klikk OK eller tilbake til å tilbakestille.
      Merk: Alle bilder automatisk glattet og til slutt recalibrated. En liste over alle eksporterte gruppering faktorer vises i resultatvinduet.
3. Utføre en lineær utvalg i plasma membranen regionen i bearbeidet bildene og måle fluorescens profilene.
   1. Velg verktøyet Fiji rett linje fra verktøylinjen Fiji. Klikk på bildet og drar en linje over regionen plasma membran. Må starte i ekstracellulære plass og skal vinkelrett plasma membranen. Velg områder med en tykkere og mer homogen lag av kortikale cytoplasma. Optimal er lineær utvalget 5-10 μm.
   2. Kjøre den ta profil makro analogisk fremgangsmåte som i trinn 4.2 (snarvei "x") eller ved å klikke ta profil verktøyet på verktøylinjen Fiji. Automatisk måling fluorescens profiler i begge kanaler skal utføres, og dataene vises i resultatvinduet.
   3. Hvis bruker nøkkelen "x" anses brukervennlig unfriendly, åpne kildefilen makro Peripheral_.ijm i tekstredigeringsprogrammet, erstatte det "x"-symbolet i linjen "makro"Ta profil [x]"{" med et gunstigere symbol (som ikke brukes i Fiji miljøet som en aktive tastaturet snarvei) og lagre filen. Installere makroen (trinn 3.1.4) og starte analysen fra bilde import.
   4. Ifølge enkelte signal variasjon, ta representant antall profiler for hver celle.
   5. Lagre dataene via fil | Lagre som.... Bruk alltid "csv" forlengelse; Det er nødvendig for riktig dataformat.
4. Kjøre den Plot profil datamakroen (snarvei F5) for grafisk visualisering av målt profiler. Angi parameteren i dialogvinduet aktivert makro.
   1. Holde avmerkingsboksene Bruk filtrering for input data? umerkede.
   2. Angi om handlingen skal opprettes fra siste dataene i vinduet resultatet fra en enkelt CSV-fil eller fra alle CSV-filer i en angitt mappe ved å klikke alternativknappen.
      Merk: Hvis handlingen opprettes fra siste resultatene, data lagres først (Lagre som... dialog vil bli automatisk aktivert).
   3. Angi hvilke gruppering faktorer brukes for plotting ved å velge de aktuelle avmerkingsboksene. Velg faktoren "i." Hvis alle profiler skal vises i unike tomter. Hold avmerkingsboksene umarkert, hvis alle data bør av tegnet inn i et enkelt gravsted.
      FORSIKTIG: Valg av en gruppering faktor som ikke finnes i behandlet resultater forårsaker feil under opprettingen av tomten.
   4. Angi filnavn når du lagrer et plott i feltet Output filen prefiks og definere handlingen bildedimensjonene filer Plot høy og Plot bredde.
      Merk: Det resulterende plott lagres i en kildekatalog data som en PNG-fil.
   5. Velg den Pdf-utskrifter? avmerkingsboksen hvis en ekstra PDF produksjon kan.
   6. Klikk på OK. Angi banen for lagring av resultater eller til slutt data importere i neste dialogboks vinduet. Bekreft analysen ved å klikke OK i dialogboksen windows viser utført R koden.
      Merk: Tomten åpnes i et nytt bildevindu og R analyse utgang vises i tekstvinduet.
5. Kjør profil filtrering installasjonsprogrammet makro (snarvei F2) hvis noen plottet profiler har overdreven signaler i ekstracellulære plass (for merket protein) eller i intracellulær plass (for FM 4-64 signalet). Følg ved å angi parameterne i dialogvinduet aktivert makro.
   Merk: Filtrering lar fjerning av dårlig profiler etter maksimale tillatte intensitet terskelen på angitte x-koordinater.
   1. For hver kanal, kan du angi riktig intensitet terskelverdien i filen fjerne mål med en overdreven ekstracellulære (intracellulær) signal. Angi regionen der intensitet terskelen brukes i feltet x-koordinater lavere (større) enn.
   2. Kjøre den Plot profil datamakroen (trinn 4.4) igjen med avmerkingsboksene Bruk filtrering for input data? merket. Kontroller at alle avvikende profiler ble fjernet. Ellers forbedre filtrering parametre (trinn 4.5.1).
6. Kjøre lag modell makro (snarvei F3) for å opprette en modell av plasma membranen og cytoplasma fluorescens distribusjon basert på kalibrering. Følg ved å angi parameterne i dialogvinduet aktivert makro.
   1. Angi hvis inndataene skal være filtrert (trinn 4.5) ved å velge den Bruk filtrering for input data? -boksen.
   2. Angi kildedataene lignende praksis som i trinn 4.4.2.
   3. Angi et intervall som modellen vil bli spådd av definisjonen av "start", "end," og "trinn" verdier i μm.
      Merk: Alle profil mål må være lengre enn det angitte intervallet.
   4. Angi bølgelengder av fluorescens eksitasjon og utslipp maxima av chromophores brukes, i de aktuelle feltene. Angi standardverdier for GFP og FM 4-64 kombinasjon.
      Merk: "GFP" angir chromophore brukt for protein merking (GFP, CFP, YFP, etc.), og "FM4" angir chromophore som brukes for en plasma membran flekker (vanligvis FM 4-64).
   5. Angi feltet Output filen prefiks . Prefikset brukes for å lagre en resulterende modell som filen RData til en kildekatalog data.
   6. Den merker Plot modell? Hvis grafisk produksjon. Tomten lagres som PNG og også som PDF-filen hvis den Pdf-utskrifter? -merkes.
   7. Klikk på OK. Angi inndata eller utgang baner i neste dialogboks windows og bekrefter analysen ved å klikke OK i dialogvinduet viser utført R koden.
      Merk: Den handlingen i det modellerte cytoplasmatiske og membran sammensetning av perifert knyttet protein fluorescens vises i det nye bildevinduet, og R analyse utgang vises i tekstvinduet.
7. Behandle bilder av celler som uttrykker protein av interesse.
   1. Importere bildene lignende praksis som i trinn 4.1.
   2. Definere analysen lignende praksis som i trinn 4.2. Jevne og linje bredden må være identisk.
   3. Måle profilene lignende praksis som i trinn 4.3.
   4. Kontroller at profilene ved å plotte (trinn 4.4) og filtreringen hvis ønskelig (trinn 4.5).
8. Kjøre Beregn distribusjon makro (snarvei F4) for beregning av en protein partisjonering mellom plasma membranen og i cytoplasma. Følg parameterinnstillingen i dialogvinduet aktivert makro.
   1. Lignende praksis med forrige trinn (trinn 4.4), angi datakilden, filtrering og filnavnprefiks.
   2. Angi Hvis modell for protein distribusjon beregningen skal lastes fra den siste modellen beregning i den siste forekomsten av makroen "Perifere" på Fiji (Velg-boksen nylig resultater), eller fra den RData filen ( Merk "fra fil").
   3. Hold boksen fjerne resultater med gjenværende variasjon større enn aktivert hvis en resultere filterene. Angi terskelen på maksimalt tillatte gjenværende variasjonen som kan være uforklarlig ved signal nedbryting av individuell profil målingen. For eksempel: verdien 0.200 angir at alle måling med uforklarlig variasjon høyere enn 20% av totale variasjon av fluorescens intensiteten i profilen vil bli forkastet.
   4. Velg eksempel gruppering faktorer, som kan brukes til boksen-handlingen opprette (trinn 4.4).
   5. Aktivere avmerkingsboksen- Pdf-utskrifter? for lagring boksen-handlingen som PDF-fil.
   6. Klikk OK, angi inndata eller utgang baner og bekrefter analysen ved å klikke OK i dialogvinduet viser utført R koden.
      Merk: Boksen-handlingen perifert knyttet protein partisjonering mellom plasma membranen og cytoplasma vises i et nytt bildevindu, og R analyse utgang vises i tekstvinduet.
   7. For ekstern behandling, lagre resultatene vises i resultatvinduet via fil | Lagre som... i Vindu-menyen.

Representative Results

DREPP¹⁰ er en plante-spesifikke perifert knyttet plasma-membran protein som er knyttet til plasma membranen via en N-myristoylation og en elektrostatisk samhandling med phosphatidylinositol fosfater^{11, 12}. DREPP ble beskrevet som en komponent av kalsium-signalisering maskiner i anlegget celle og også kommuniserer med cytoskjelett^13,14. I presentert forsøket, vill-type tobakk DREPP2 og ikke-myristoylated mutert versjon (Gly2 erstattet av Ala) var GFP-merket⁶ og uttrykt i tobakk ved-2 suspensjon celler¹⁵ under CaMV 35S promotor¹⁶. Plasma membranen partisjonering av disse proteinene ble målt i 3 dager gamle (3 dager etter fortynning), FM 4-64-merket (8 µM) celle kulturer⁶ med (figur 1A) og uten (figur 1B) tillegg av phosphoinositide 3-kinase hemmer Wortmannin (10 µM)¹⁷, i henhold til protokollen beskrevet ovenfor. Den trimmede versjonen DREPP2(Δ1-23) mangler plasma membranen bindende domene⁶ ble brukt som en cytoplasma markør for fluorescens distribusjon modell bygging (figur 1 c).

Beregnet data var kvadratroten forvandlet (positive verdien som tilsvarer den laveste negativ verdien ble lagt til alle data å hente bare positive data), og data ble testet av toveis VARIANSANALYSE i R⁹. Effekten av mutasjon og hemmer behandling var svært betydelig (p < 2.2 x 10^-16 ***). Alle gruppene ble sammenlignet med Tukey HSD test; alle gruppene skilte seg betydelig med unntak av DREPP2 behandlet av Wortmannin og ikke-behandlet DREPP2(G2A) (figur 1 d).

Disse resultatene viser tydelig at plasma-membran foreningen av tobakk DREPP2 protein er resultatet av en N-myristoylation og elektrostatiske interaksjon, som fungerer samarbeide. Bare gjensidig effekten av N-myristoylation nettstedet mutasjon og Wortmannin behandling forårsaket en full dissosiasjon av DREPP2 protein fra plasma membranen. Disse resultatene er i samsvar med tidligere publiserte data⁶.

Figur 1 : Effekten av mutasjon i N-myristoylation området og Wortmannin behandling på plasma membranen partisjonering perifert knyttet plasma-membran protein DREPP, som er involvert i en kalsium signalveien i anlegget celle. (A) Medial AC confocal deler av tobakk ved-2-celler som uttrykker vill type form DREPP2-GFP og mutant danner DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (grønn kanal). Cellene ble merket med FM 4-64 fargestoff (magenta kanal), skala bar 10 µm. (B) samme celle linje ble behandlet av 10 µM Wortmannin (WM). (C) celler uttrykke cytoplasmatiske markør DREPP2(Δ1-23). (D) beregnet plasma membranen partisjonering for alle utvalg. Betydningen av begge effekter ble testet toveis VARIANSANALYSE (p < 2.2 x 10^-16 *** i begge tilfeller, de opprinnelige dataene var kvadratroten-forvandlet). Bokstavene angir grupper som ikke er signifikant forskjellig fra hverandre som bestemmes av Tukey HSD test. Værhår av boksen-tomter indikerer 95% konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Metoden beskrevet her genererer et mer nøyaktig anslag for plasma membranen partisjonering av perifert tilhørende proteiner sammenlignet med andre tilnærminger basert på måler fluorescens intensiteter⁵. Stor forbedring av denne metoden er at det tar hensyn til lys Diffraksjon og superposisjon av plasma-membranen og cytoplasmatiske signaler. Selv om disse metoden resultatene er i sammenheng med resultatene av en enkel metode basert på sammenligning av fluorescens intensitet på membran posisjon med gjennomsnittlig cytoplasmatiske signal (som vist tidligere⁶), den store fordelen med denne romanen metoden er fastsettelse av gjenværende variasjon (uforklarlig av signal nedbryting) der estimering av relevansen av resultatene, spesielt der plasma membranen signalet er lavere enn cytoplasmatiske signalet. Metoden beskrevet er også mer robust å signalisere lyd fordi beregningen av protein partisjonering ikke er basert på bare ett punkt.

Analysen krever bare én tokanals AC confocal bilder. I motsetning til FRAP tilnærminger¹⁸ basert på målinger av protein diffusjon dynamikken i lengre tid windows, er metoden beskrevet mer gjeldende for dynamisk i vivo tilnærminger, når rask bilde er en betenkelig behov ( f.eks, signal signaltransduksjon undersøkelser, hemmende analyser). Metoden er egnet for raskt å få store datamengder som er tilstrekkelig for statistiske evalueringer.

Metoden er begrenset til bare en enkelt membranen. Analyse av signaler fra to tett tilstøtende membraner av nabokommunene cellene støttes ikke. I dette tilfellet er signal montering mer krevende med høyere risiko for gjenstander.

Men analysen ble opprinnelig utviklet for plante suspensjon celler¹⁵, og den kan brukes for analyser andre celletyper også. Pollen rør og rot hår representerer potensielt godt mål for denne metoden i anlegget biologi. Eksterne membraner av anlegget epidermal celler kan analyseres etter forrige at cellen vegger ikke er merket av FM 4-64 og ikke vise forstyrrende autofluorescence. Protist celler som er fri for forstyrrende autofluorescence, gjærceller, fungal cellene, samt dyreceller med glatt plasma membranen kan analyseres ved hjelp av metoden beskrevet; men for dyreceller kan ikke analyse av protein distribusjon på forkant av fibroblast celler eller Lyngen grensen av epitelceller være mulig. På grunn av fleksibel analyseinnstillingene merket FM 4-64 flekker kan erstattes av andre plasma membranen visualisering tilnærminger, slik som fluorescently proteiner. Med forsiktighet, kan metoden brukes for fast celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer