Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi
Summary
Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.
Abstract
Bu yöntem plazma zarı arasında floresan yoğunluğu profilleri kullanarak herhangi bir fluorescently öğesini periferik ilişkili protein plazma zarı bölümleme belirlenmesi için hızlı bir yaklaşım sağlar. Ölçülen floresans profilleri dik hücre çevre için uygulanan bir çizgi boyunca membran ve sitoplazma floresans dağıtım için bir model ile donatılmıştır. Bu model fluorescently öğesini işaret sitoplazma ve FM 4 64 etiketli plazma zarı ile ifade başvuru hücrelerdeki floresan yoğunluğu değerleri üzerinden inşa edilmiştir. Yöntemi çeşitli hücre tipleri ve organizmalar için uygulanabilir; Ancak, sadece plazma zarı olmayan komşu hücre değerlendirilebilir. Bu hızlı mikroskobu tabanlı yöntem deneyler, nerede plazma zarı ilişkili işaretçileri ince ve dinamik değişiklikler bekleniyor ve sayısal gerek, Örneğin, proteinler, önleyici tedaviler mutant sürümleri analiz için uygundur, ve sinyal iletim gözlemler. Kullanıcı dostu bir arabirim olarak hizmet veren bir ImageJ makro ile birleştiğinde bir çoklu platform R paket içinde uygulanan yöntemi.
Introduction
Periferik ilişkili plazma-membran proteinlerinin yolları sinyal cep anahtar bileşenleri vardır. Temel rollerini onların geçici plazma zarı Derneği ve plazma zarı ve sitoplazma arasında sinyal iletimi için önemlidir ayrılma biridir. Plazma zarı periferik ilişkili proteinler plazma membran üzerinde lipid çapa (N-miristoillenme, S-asilasyonu veya prenilasyon) veya (etkileşim phosphatidylinositol fosfat, phosphatidic asit, ile lipid bağlayıcı etki alanları eklenebilir vb).
Plazma zarı bağlama özellikleri bu proteinlerin olabilir vivo içinde Örneğin, bir fluorescently öğesini protein temel amino asitler bir site yönettiği mutagenesis tarafından değiştirildiğinde, etkileyen çeşitli inhibitörleri ile tedavi ederken incelendi lipid işaret. Protein yeniden dağıtılması açık olduğunda özellikle durumlarda, periferik plazma membran proteinlerinin dağılımları çoğunlukla nitelik, değerlendirilen. Sunulan protein yeniden dağıtımı yalnızca kısmi ve kantitatif değerlendirilmesi gerekli olduğunda durumlar için en iyi yöntemdir. Sık kullanılan bir yaklaşım ne zaman plazma zarı Derneği confocal üzerinden tahmin edilmektedir, lazer tarama mikroskobu görüntüleri bir oranı floresans yoğunluklarını plazma zarı ve sitoplazma1,2, ama basit değil gibi doğru. Plazma zarı koyulukları floresan ışık kırınım özelliği nedeniyle plazma zarı ve sitoplazma sinyal belirli floresans mikroskobu tekniği ve optik öğeleri kullanılan3için süperpozisyon yansıtır. Sonuç olarak, sitoplazmik sinyal aynı membran bölgede yer alır. Bu nedenle, FM 4-64 boyama desen bir membran sinyal seçimi4için bir maske olarak kullanılamaz. Ayrıca, gerçek plazma zarı sinyal periferik ilişkili plazma-membran protein süperpozisyon nedeniyle membran sinyal FM 4-64 sistematik olarak her zaman maksimum boyama tarafından tanımlanan konumundaki basit ölçümleri abartma membran ve sitoplazmik bileşik. Gözlenen sinyaller fluorescently öğesini periferik ilişkili proteinler için maksimum da plazma zarı marker (yani, FM 4-64 styryl boya) maksimum ile birlikte yerelleştirmek değil ama sitoplazma doğru kaymıştır. FM 4-64 emisyon en yüksek ışık kırınım3dalga boyu bağımlılığı nedeniyle GFP gibi yeşil flüoresan proteinler için emisyon zirveleri ile karşılaştırıldığında daha geniş gerçeğine dayalı başka bir kısıtlamadır.
Burada açıklanan yöntemde tagged protein sinyal varsayımsal dağılımı plazma zarı ve sitoplazma sinyal, sırasıyla açıklayan iki ampirik işlevleri tarafından takılmıştır. Bu sinyal ayrışma hücre yüzeyine dik plazma membran protein fluorescently öğesini ifade düzenli, iki kanallı confocal bölümleri kaynak görüntüler için uygulanan lineer floresan profilleri uygulanır FM 4-64 boya ile etiketli hücreleri.
Montaj için kullanılan ilk işlev hücre kenarında bir kırınım bir sitoplazma sinyal açıklar. Plazma zarı periferik ilişkili protein ilgi olarak aynı chromophore tarafından öğesini bir sitoplazma protein marker ifade hücrelerdeki ölçüldü daha önce alınan floresans profilleri elde edilir. Bir plazma zarı sinyal bir kırınım açıklayan ikinci işlev FM 4-64 floresans türetilmiştir. Bu sinyal öncelikle bir nokta kaynak ışık kırınım yaklaşık bir modelleme için kullanılmakta olan bir Gauss işlev tarafından yaklaşık. İkinci olarak, bu model, kırmızı FM 4-64 emisyon için geçerli matematiksel bir emisyon dalga boyu periferik ilişkili proteinler plazma zarı, ilgi etiketleme için kullanılan chromophore ilgilidir forma dönüşür. Her iki işlevleri sırasıyla maksimum yoğunluk ve en yüksek değerleri FM 4-64 sinyal ve sitoplazmik protein sinyal, yüzde 10’u ortalamasından normalleştirilmiş. Bu sinyal ayrıştırma tarafından (doğrusal olmayan en azından kare uygun yöntemi), plazma zarı oranını ve muayene protein sitoplazma kısmını kolayca ve doğru bir şekilde tahmin edilebilir. Hesaplanan bölümleme katsayısı gerçek fiziksel boyut mikrometre, aralıkta çünkü sitoplazmik birim konsantrasyon plazma membran yüzey konsantrasyon ile karşılaştırılır. Plazma zarı mesafe içinde plazma zarı bitişik alan olduğu gibi proteinler aynı miktarda yerelleştirilmiştir sitoplazma tanımlar. Bu değer bölümleme için eşdeğerdir katsayısı K2 tanıttı daha önce5. Çok hızlı, mikroskop, tarama rutin confocal lazer kullanılarak kazanılması sadece tek confocal bölümleri gerektiren yöntemdir ve değil hesaplama açısından talep ediyor. Analiz çekirdek bir taşınabilir R pakette uygulamaya konmuştur ve ek bir ImageJ makro analiz sezgisel iletişim kutuları çalıştırmak için grafik kullanıcı arabirim sağlamak için yazıldı. Yazılım ve daha ayrıntılı bir açıklama yöntemi (daha önce yayınlanmamış6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/ bulunabilir.
Yöntem izole hücreler, önceki ve dokular, uygun olan bireysel hücrelerin plazma zarı açıkça ayırt olduğu yerde bir fluorescently öğesini yapı ifade periferik ilişkili protein inceledi. 4-64 boyama kullanılmalıdır FM ile uyumlu bir chromophore. FM 4-64 kırmızı floresans yayar; Bu nedenle, muayene protein-ebilmek var olmak tagged floresans protein ile mavi, yeşil ya da sarı emisyon (Örneğin, GFP, CFP, YFP) tarafından. Protein dağıtım daha az yapay ve daha tekrarlanabilir gözlemleri sağladığından biyolojik malzemenin istikrarlı dönüştürme önerilir. Muayene protein nispeten homojen bir sitoplazmik dağılımı gösterir gereklidir. Endoplazmik retikulum veya başka bir hücre içi membran yuvası bir proteinin yerelleştirme yapay sonuçlar verebilir.
Ayrıca, sitoplazmik bir işaretleyici ifade aynı biyolojik malzeme karşılaştırma için kullanılması gerekir. Hücre membran kaldırıldı bağlama kapasitesi ile ücretsiz chomophore (aynı etiketleme, Örneğin, ücretsiz GFP periferik protein için kullanılan) veya ilgi tagged protein dönüştürülebilir. Membran bağlama kapasitesi, örneğin, kırpma membran bağlayıcı etki alanının veya site yönettiği mutagenesis anahtar amino asit residua (Örneğin, N-miristoillenme, S-asilasyonu, ya da prenilasyon, vbsiteleri), kaldırılmış.
Confocal tarama Mikroskopi için hücre membran marker FM 4-64 boya gibi tarafından etiketlenmesi gerekir. 4-64 boyama FM (nedeniyle sokan autofluorescence, zavallı Boya Penetrasyon, vb) okudu malzeme için uygun değilse, plazma zarı, örneğin, etiketli bir uygun chomophore (ayrılmaz plazma membran protein tarafından etiketli mCherry, RFP, vb). İşaretçiyi hücre içi membran bölmeleri (endomembranes) ihmal edilebilir yerelleştirme olması zorunludur.
Eğer sabit örnekleri ve antikorlar ile çalışma, düzeltilebilir analog FM 4-64FX veya uygun bir hedef karşı antikor tarafından plazma zarı etiketleme kullanılabilir. Bu durumda, fiksasyon yordamlar sitoplazma ve plazma zarı proteinler seçici kaybına yol açabilir çünkü sonuçları çok dikkatli bir şekilde değerlendirmek için esastır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan yöntem floresans yoğunluklarda5ölçme üzerinde dayalı diğer yaklaşımlar göre periferik ilişkili proteinler için plazma zarı bölümleme daha doğru bir tahmin oluşturur. Bu yöntemin önemli gelişme bu ışık kırınım ve süperpozisyon plazma zarı ve sitoplazmik sinyalleri dikkate alır olduğunu. Bu yöntem sonuçlar floresan yoğunluğu ile ortalama sitoplazmik membran konumundaki karşılaştırılması temel alan bir basit yöntemi sonuçları ile ilişki i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje NPU tarafından desteklenen ben LO1417 (Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor Çek Cumhuriyeti).
Materials
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Plasma membrane dye |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Dye solvent |
| Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) | Equipment for cell labelling and microscopy | ||
| Confocal laser scanning microscope | |||
| Ordinary computer |
References
- Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
- Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
- Kubitscheck, U. . Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).
- Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
- Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
- Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta – Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
- Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
- Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
- Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
- Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
- Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
- Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
- Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
- Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).
